Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di funzionamento a BAV dal morbo di Crohn e Colite Foundation of Canada (CCFC) e degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute (CIHR). GB è stato finanziato da una borsa di studio laureato CIHR. BAV sono i bambini con disturbi intestinali e del fegato (BAMBINO) presidente della Fondazione di Ricerca Pediatrica IBD e il Canada Research Chair in Gastroenterologia Pediatrica.

1. Preparazione di Citrobacter rodentium inoculo e sonda gastrica di topi <ol><li> Preparare e sterilizzare in autoclave Luria Bertani brodo (LB). </li><li> Ottenere vitale C. rodentium da uno stock di glicerolo congelata e striscia sulla piastra LB agar con un&#39;ansa sterile da inoculo o punta della pipetta. Incubare a 37 ° C per una notte. Inoculare 3 ml di brodo LB sterile in una provetta di coltura falcon con colonie dalla piastra LB utilizzando una ansa o punta della pipetta. Preparazione dell&#39;inoculo deve essere fatto utilizzando tecniche asettiche. </li><li> Incubare la C. cultura rodentium aerobiosi a 37 ° C per una notte in una incubazione banco agitatore a 200 rpm. Il brodo LB inoculato dovrebbe apparire torbida dopo la coltura durante la notte. </li><li> Usare una lampadina punta dell&#39;ago gastrica gavage attaccato ad una siringa da 1 ml per gavage ciascun topo con 100 microlitri della overnight C. rodentium cultura. Delicatamente collottola il mouse, impugnando saldamente la pelle flaccida sul suo collo e schienacon il pollice e le dita. Tirare indietro la testa dell&#39;animale con il dito indice per immobilizzare la testa e raddrizzare l&#39;esofago per l&#39;inserimento dell&#39;ago gavage. </li><li> Mantenere il mouse in posizione verticale e dirigere la punta dell&#39;ago bulbo gavage lungo il lato della sua bocca e sulla sua lingua. Delicatamente passare l&#39;ago lungo il tetto della bocca e farlo avanzare l&#39;esofago. In caso di resistenza che avverte durante questa procedura, rimuovere l&#39;ago gavage e reinserirla. </li><li> Lentamente iniettare 100 ml di inoculo batterico e rimuovere delicatamente l&#39;ago gavage. Monitorare la frequenza respiratoria e il comportamento del mouse dopo il ritorno alla sua gabbia. </li></ol> Note: <ul><li> Nelle fasi 2 e 3, anche preparare una provetta di coltura falcon utilizzando tecniche asettiche con 3 ml di brodo LB sterile per essere coltivate durante la notte per assicurare che non vi è alcuna contaminazione batterica del brodo stesso. Il brodo LB dovrebbe apparire chiaro dopo coltura durante la notte. </li><li&gt; Agitare delicatamente la coltura nel tubo falcon prima di caricare siringhe per gavage modo che una dose uguale di batteri è consegnato a ciascun topo, nel passaggio 4. </li><li> Durante la notte la cultura deve essere eliminata se è stato inoculato per oltre 24 ore. </li><li> Tutti C. infezioni rodentium e abitazioni di animali infetti deve essere effettuata in un impianto di livello di biosicurezza 2. </li></ul> 2. Misurazione del colon permeabilità epiteliale Barriera in C. rodentium topi infettati <ol><li> Misurare integrità della barriera in un punto temporale desiderato post-infezione. </li><li> Il giorno del saggio, preparare abbastanza 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano dissolto in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 80 mg ml -1 per gavage ciascun topo con 150 microlitri e preparare la curva standard. </li><li> Scruff il mouse e sonda gastrica con 150 ml di FITC-destrano. Estrarre il cibo dalla gabbia in questo momento. </li><li> Anestetizzare topi 4 ore dopogavaging e raccogliere il sangue il più possibile (~ 450 microlitri) tramite puntura cardiaca. Aggiungere il sangue ad una concentrazione finale del 3% acido citrato destrosio in una provetta da microcentrifuga per scoraggiare coagulazione. Eutanasia i topi e raccogliere i tessuti del colon in PBS per la conta batterica (passi 3,1-3,5) e in formalina al 10% per la fissazione dei tessuti e, infine, colorazione di immunofluorescenza (passi 4,1-4,8). </li><li> Centrifugare i campioni di sangue a 1000 xg per 12 min in una centrifuga a 4 ° C. Raccogliere il siero e diluire a 1/10 e 1/100 in PBS. Aggiungere 100 pl di ciascun campione a questi due diluizioni ad una piastra a 96 pozzetti in replicati. </li><li> Per preparare la curva standard, diluire l&#39;originale 80 mg ml -1 FITC-destrano usato per sonda gastrica i topi in PBS per le seguenti concentrazioni: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, e 0 mg / ml . Aggiungere 100 pl di ciascuna concentrazione di una piastra a 96 pozzetti in triplicato. </li><li> Quantificare la fluorescenza di ciascun campione utilizzando un fluorimetro a una eccitazione wavelength di 485 nm e 535 nm di lunghezza d&#39;onda di emissione. </li><li> Analizzare i dati grezzi tracciando la curva standard. Inserire i dati grezzi per ciascun campione nell&#39;equazione della linea generata dalla curva standard per determinare la concentrazione di FITC-destrano in ciascun campione. </li></ol> Note: <ul><li> Dal punto 4 in poi, tenere i campioni di sangue in ghiaccio e ridurre al minimo l&#39;esposizione alla luce. </li><li> Quando si misura l&#39;integrità della barriera epiteliale un punto di tempo, o prima, 7 giorni dopo l&#39;infezione è ottimale, in quanto gravi danni ai tessuti avviene dopo questo punto. Misurazione integrità della barriera prima che si verificano gravi danni permette di determinare le differenze massime di permeabilità durante C. infezione rodentium tra ceppi di topi. </li><li> Assicurarsi che topi di controllo non infettate sono anche testati per l&#39;integrità della barriera epiteliale. </li></ul> 3. Misura della carica batterica in tessuti di C. rodentium topi infettati <ol><li> Aggiungere 1 ml di PBS sterile unnd un metallo sterilizzato tallone ad un fondo tondo 2 tubi da centrifuga ml utilizzando una tecnica asettica. I singoli tessuti prelevati da ciascun animale sarà posto in tubi separati PBS. Pesare i tubi prima dell&#39;aggiunta del tessuto. </li><li> Rimuovere il cieco e colon dal mouse. Separare il cieco dal colon e spingere il contenuto luminale con una pinzetta. Aggiungere il contenuto in un tubo di PBS. Dopo aver separato le sezioni 0,5 centimetri dal colon distale e cieco per il 10% fissazione in formalina, aprì il colon rimanente e cieco longitudinalmente e lavare con PBS sterile prima di mettere i tessuti in tubi. </li><li> Pesare i tubi PBS con il tessuto e poi omogeneizzare i campioni utilizzando un battitore tallone per 6 min a 30 Hz. </li><li> Utilizzando tecniche asettiche, aggiungere 180 microlitri di PBS sterile per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione omogeneizzato al primo pozzetto in ciascuna riga. Mescolare bene e diluire serialmente, aggiungendo 20 microlitri di ogni precedente e di ottenere diluizioni da 10 -1 (prima sill) a 10 -6. Piastra 10 microlitri di ogni diluizione di ciascun campione in triplicato su una lastra quadrata LB inferiore con una griglia. Incubare per una notte a 37 ° C. </li><li> Contare le unità formanti colonie (CFU), quindi la media dei 3 punti, e registrare la diluizione alla quale è stato contato ogni campione. Moltiplicare media di 50 CFU, come 20 pl del campione originale 1 ml è stato usato, e per il fattore di diluizione alla quale è stato contato il campione risultante in CFU / ml. Infine, dividere per il peso del tessuto per determinare CFU / g. </li></ol> 4. La valutazione istologica e colorazione immunofluorescenza dei tessuti infetti Colon <ol><li> Raccogliere tessuti come nel passo 3,2. Tessuti Conservare in formalina durante la notte, poi lavare con etanolo al 70%. Incorpora tessuti in paraffina e tagliati 5 sezioni micron per la colorazione. Colorazione con ematossilina &amp; eosina per la valutazione istologica e procedere con i seguenti passi per la colorazione di immunofluorescenza. </li><li> Per Deparaffinare tessuti prima della colorazione, posto scorre inuna vaschetta di colorazione Coplin e mettere in 65 ° C bagnomaria per 10 min. Quindi, porre i vetrini in xilene per quattro lavaggi di 2 minuti ciascuna. Vetrini devono poi essere reidratato con due lavaggi di 5 minuti in etanolo al 100%, seguiti da un lavaggio 5 min in ciascuna delle seguenti: 95% di etanolo, 75% etanolo e dH 2 0. Questi lavaggi dovrebbe essere fatto in una cappa per evitare esposizione a vapori nocivi. </li><li> Immergere i vetrini nella vaschetta Coplin con pre-riscaldato tampone sodio citrato e poi posto in un vapore per 30 minuti, poi lasciate riposare per 30 min. Questo processo spezza le proteine ​​legami incrociati formate da fissazione in formalina recuperando potenziali siti antigenici. </li><li> Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Vetrini asciutti e zona marchio intorno al tessuto con una penna PAP per creare una barriera idrofoba, mantenendo i reagenti di colorazione localizzati sul tessuto. </li><li> Tessuto blocco per 1 ora a temperatura ambiente con tampone di bloccaggio (ad esempio α-siero di capra) in una camera umida immunocolorazione. </li><li> Diluire primanticorpo ary alla concentrazione desiderata con tampone di diluizione anticorpo. Versare tampone bloccante ed aggiungere 50-100 ml di anticorpo primario e tessuti. Incubare a 4 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2 h. </li><li> Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Aggiungere 50-100 microlitri di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione anticorpo ai tessuti e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio. Lavare con dH 2 O per 5 minuti, per tre volte. </li><li> Disidratare diapositive, aggiungere DAPI Prolong medio oro di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti. Visualizza vetrini al microscopio a fluorescenza. </li></ol> Note: <ul><li> PBS azide può essere sostituito con PBS preparata come alternativa per evitare la crescita batterica nel mezzo di lavaggio dal punto 4 in poi. </li></ul>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per lo studio di entrambi malattie infettive e colite nei topi. Questo modello unico consente la caratterizzazione di entrambe le risposte dell&#39;ospite, come pure le proprietà di batteri patogeni. La procedura descritta in questo particolare protocollo il successo nell&#39;uso di questo modello. Ci sono diversi passaggi critici di questo protocollo da tenere a mente quando si induce la colite e l&#39;analisi del...

Infezione da batteri patogeni enterici innesca gastrointestinale (GI) infiammazione, nonché intestinale patologia e fisiopatologia, incluse diarrea e disfunzione barriera epiteliale intestinale. I meccanismi di virulenza di batteri patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici per difendersi contro tali infezioni sono poco conosciuti, ma recenti progressi nella modellazione di enterici infezioni batteriche hanno iniziato ad aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell&#39;intestino). La malattia di Crohn malattie infiammatorie dell&#39;intestino (CD) e UC sono malattie complesse di eziologia sconosciuta, caratterizzata da infiammazione cronica intestinale e danni ai tessuti. Molti modelli murini di infiammazione intestinale esistono, da infiammazione spontanea in ceppi geneticamente modificati, come IL10 - / - topi, alle sfide con composti chimici, come destrano solfato sodico (DSS) e dinitrobenzene solfonico (DNBS) 1. È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi presenti nei pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici 2, quindi lo studio dei modelli di colite infettiva offre anche notevoli potenzialità per definire potenzialmente patogeni ospitante . risposte a batteri enterici Citrobacter rodentium colite indotta è uno dei pochi modelli di colite infettiva che è stata ben caratterizzata 1,3, consentendo l&#39;analisi delle risposte dell&#39;ospite ai batteri enterici e ulteriore comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD; un passo essenziale per lo sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici. C. rodentium è un gram negativo fissaggio e effacing (A / E), murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla umana importantepatogeni enteropatogeno E. coli (EPEC) e enteroemorragica E. coli (EHEC) 3-8. La famiglia di una patogeni / E intimamente collegare alla membrana apicale della cellula ospite dell&#39;epitelio cecale e colon, formando un non-invasiva piedistallo struttura simile sulla cellula ospite. Sfida orale con C. rodentium di 10 8 -10 9 organismi produce un robusto modello di colite infettiva caratterizzata da iperplasia del colon o allungamento delle cripte, infiltrazione di cellule mononucleate immunitario e deplezione delle cellule calice 3,4. Il sito iniziale di colonizzazione, poche ore dopo la sfida, è la patch cieco, seguita dalla progressione verso il colon distale 2 o 3 giorni dopo l&#39;infezione 3. In ceppi di topi immunocompetenti, la clearance del patogeno viene raggiunto 3 a 4 settimane dopo l&#39;infezione 1,3,4. Tuttavia, molti ceppi geneticamente modificati, cioè gene carente o knockout (- / -) topi, sono stati trovati per visualizzare Increased suscettibilità alle infezioni con conseguenti danni esagerato e / o infezione e infiammazione cronica 9-14. L&#39;utilizzo di questo modello di colite infettiva in questi ceppi ad eliminazione diretta, molti mancano innate proteine ​​di segnalazione, è stato indispensabile nel rivelare proteine ​​ospite diverse integrali alla risoluzione di infezione intestinale e l&#39;infiammazione.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente / materiale </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Luria Broth </td><td> ABM </td><td> G247 </td><td> Aggiungere 25 g di polvere di LB 1L di acqua. Autoclave prima dell&#39;uso. </td></tr><tr><td> Fondo piatto quadrato con griglia </td><td> Pescatore </td><td> 08-757-11A </td><td></td></tr><tr><td> Falcon cultura tubo </td><td> Sarstedt </td><td> 62.515.006 </td><td></td></tr><tr><td> Lampadina punta dell&#39;ago gastrica gavage </td><td> Strumenti Scienza Belle </td><td> 18060-20 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml siringa </td><td> BD Biosciences </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> 4 kDa FITC-destrano </td><td> Sigma </td><td> FD-4 </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido citrico </td><td> Sigma </td><td> C7129 &lt;/ Td&gt; <td></td></tr><tr><td> Citrato di sodio </td><td> Pescatore </td><td> S279-500 </td><td></td></tr><tr><td> Destrosio </td><td> Pescatore </td><td> D16.1 </td><td></td></tr><tr><td> Acido citrato destrosio </td><td></td><td></td><td> 20 mM di acido ctiric, 110 mM di citrato di sodio, 5 mM destrosio </td></tr><tr><td> Nero piastra a 96 pozzetti </td><td> Pescatore </td><td> 07-200-762 </td><td></td></tr><tr><td> Perle di metallo (5 mm) </td><td> Qiagen </td><td> 69989 </td><td></td></tr><tr><td> Formalina 10% </td><td> Pescatore </td><td> 5F93-4 </td><td></td></tr><tr><td> Flaconcino da 5 ml </td><td> DiaMed </td><td> STK3205 </td><td></td></tr><tr><td> Ematossilina </td><td> Pescatore </td><td> H345-23 </td><td></td></tr><tr><td> Eosina </td><td> Pescatore </td><td> E511-100 </td><td></td></tr><tr><td> Xilene </td><td> Pescatore </td><td&gt; HC700-1GAL </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P5927 </td><td></td></tr><tr><td> Coplin colorazione jar </td><td> VWR </td><td> 47751-792 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio citrato </td><td></td><td></td><td> Citrato di sodio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0 </td></tr><tr><td> Pap penna </td><td> Cedarlane </td><td> Mu22 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di capra </td><td> Sigma </td><td> G902-3 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina di siero bovino (BSA) </td><td> Pescatore </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma </td><td> T8532 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio azide </td><td> Sigma </td><td> SZ002 </td><td></td></tr><tr><td> Tampone di arresto </td><td></td><td></td><td> Siero di capra 2%, 1% BSA, 0,1% triton X-100, Tween 20 0,05%, 0,05% di sodioazide, 0,01 M PBS, pH 7.2, mix &amp; conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Anticorpo tampone di diluizione </td><td></td><td></td><td> 0,1% triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% di sodio azide, EDTA 0,04% </td></tr><tr><td> Tampone di arresto e anticorpi tampone di diluizione per tir </td><td></td><td></td><td> Ricette come sopra, ma senza aggiunta di detergenti (Triton X-100 e Tween 20) </td></tr><tr><td> Prolungare reagente Oro Antifade con DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> P-36.931 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto </td><td> Pescatore </td><td> 12.54SE </td><td></td></tr><tr><td> Agitatore da banco incubazione </td><td> Barnstead Lab Line </td><td> Max Q4000 </td><td></td></tr><tr><td> Fluorimetro </td><td> Perkin Elmer </td><td> Victor2D </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata </td><td> Beckman Coulter </td><td> Microcentrifuga 22R</td><td></td></tr><tr><td> Piroscafo </td><td> Black &amp; Decker </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td> Axio Image.Z1 </td><td></td></tr></tbody></table>

the citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis

Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di malattie infettive e colite, così come i metodi utilizzati per caratterizzare Citrobacter rodentium infezione nei topi. C. rodentium è un batterio gram negativo, murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla clinicamente importante enteropatogeno E. umana patogeni coli e E. enteroemorragica coli. Dopo infezione con C. rodentium, topi immunocompetenti soffrono di perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Istologicamente, allungamento cripta intestinale, infiltrazione di cellule immunitarie, e la deplezione delle cellule calice si osservano. Liquidazione di infezione è raggiunto dopo 3 o 4 settimane. Misurazione della barriera epiteliale intestinale integrità, carica batterica, e danno istologico a tempi diversi dopo l&#39;infezione, consentono la caratterizzazione dei ceppi di topi suscettibili all&#39;infezione. Il meccanismo di virulenzas con il quale batteri patogeni colonizzano il tratto intestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici che difendono contro le infezioni siano poco conosciuti. Pertanto l&#39;C. rodentium modello di infezione batterica enterica è uno strumento prezioso per aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell&#39;intestino). È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi visti in pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici. Pertanto, lo studio di modelli di colite infettiva offre un notevole potenziale per la definizione di risposta dell&#39;ospite potenzialmente patogeni per i batteri enterici. C. rodentium colite indotta da uno di questi modelli è raro che permette l&#39;analisi delle risposte di accoglienza per i batteri enterici, la nostra comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD;essenziale nello sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.

Durante un esperimento di infezione standard, i topi sono infettati con circa 2,5 x 10 8 UFC mediante sonda gastrica di 100 pl C. overnight rodentium cultura. Infezione di topi C57BL / 6 con C. rodentium risultati in perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Anche se un evento raro con C57BL / 6 topi, gli animali possono ammalarsi e richiedere euthanization. Pertanto, i topi devono essere monitorati per grado di perdita di peso e sintomi di disagio come pelliccia piloerect e ...

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The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

Il<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

This protocol  outlines the steps required to produce a robust model of infectious disease and  colitis, as well as the methods used to characterize ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Citrobacter rodentium Mouse Model: Studying Pathogen and Host Contributions to Infectious Colitis

26.3K Views.  BC Children's Hospital. Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

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Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

L&#39;uso di una trappola ottica per lo Studio delle interazioni ospite-patogeno per Dynamic Imaging Live Cell

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Using Click Chemistry to Measure the Effect of Viral Infection on Host-Cell RNA Synthesis

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, it is therefore important to have a quick and reliable way of measuring transcriptional activity in infected cells. Traditionally, transcription has been measured either by incorporation of radioactive nucleosides such as 3H-uridine followed by detection via autoradiography or scintillation counting, or incorporation of halogenated uridine analogs such as 5-bromouridine (BrU) followed by detection via immunostaining. The use of radioactive isotopes, however, requires specialized equipment and is not feasible in a number of laboratory settings, while the detection of BrU can be cumbersome and may suffer from low sensitivity.
The recently developed click chemistry, which involves a copper-catalyzed triazole formation from an azide and an alkyne, now provides a rapid and highly sensitive alternative to these two methods. Click chemistry is a two step process in which nascent RNA is first labeled by incorporation of the uridine analog 5-ethynyluridine (EU), followed by detection of the label with a fluorescent azide. These azides are available as several different fluorophores, allowing for a wide range of options for visualization.
This protocol describes a method to measure transcriptional suppression in cells infected with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12 using click chemistry. Concurrently, expression of viral proteins in these cells is determined by classical intracellular immunostaining. Steps 1 through 4 detail a method to visualize transcriptional suppression via fluorescence microscopy, while steps 5 through 8 detail a method to quantify transcriptional suppression via flow cytometry. This protocol is easily adaptable for use with other viruses.

This method describes the use of click chemistry to measure changes in host cell transcription after infection with the Rift Valley fever virus (RVFV) strain MP-12. Results can be visualized qualitatively via fluorescence microscopy or obtained quantitatively through flow cytometry. This method is adaptable for use with other viruses.

Utilizzando Clicca Chimica per misurare l&#39;effetto dell&#39;infezione virale sulla cellula ospite RNA Sintesi

Many RNA viruses have evolved the ability to inhibit host cell transcription as a means to circumvent cellular defenses. For the study of these viruses, ...

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Un modello di topo per patogeni indotta infiammazione cronica a siti locali e sistemici

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been highly informative on the role of innate and adaptive immune cells and specific cytokines in host immunity against intracellular pathogens. Production of IFN-&#947; by innate cells during sublethal infection with L. monocytogenes is important for activating macrophages and early control of the pathogen1-3. In addition, IFN-&#947; production by adaptive memory lymphocytes is important for priming the activation of innate cells upon reinfection4. The L. monocytogenes infection model thus serves as a great tool for investigating whether new therapies that are designed to increase IFN-&#947; production have an impact on IFN-&#947; responses in vivo and have productive biological effects such as increasing bacterial clearance or improving mouse survival from infection. Described here is a basic protocol for how to conduct intraperitoneal infections of C57BL/6J mice with the EGD strain of L. monocytogenes and to measure IFN-&#947; production by NK cells, NKT cells, and adaptive lymphocytes by flow cytometry. In addition, procedures are described to: (1) grow and prepare the bacteria for inoculation, (2) measure bacterial load in the spleen and liver, and (3) measure animal survival to endpoints. Representative data are also provided to illustrate how this infection model can be used to test the effect of specific agents on IFN-&#947; responses to L. monocytogenes and survival of mice from this infection.

Experimental Infection with &lt;em&gt;Listeria monocytogenes&lt;/em&gt; as a Model for Studying Host Interferon-&amp;#947; Responses

This protocol describes how to inoculate C57BL/6J mice with the EGD strain of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) and to measure interferon-&#947; (IFN-&#947;) responses by natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and adaptive T lymphocytes post-infection. This protocol also describes how to conduct survival studies in mice after infection with a modified LD50 dose of the pathogen.

Infezione sperimentale con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Come modello per lo studio Host Interferone-gamma Risposte

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

Un modello di cultura Bursal-cellula primaria di pollo Ex Vivo per studiare la patogenesi Virus bursite infettiva

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' pathogens (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, and Rickettsia spp.) gain access to the infected cell cytosol by physically and enzymatically degrading the primary vacuolar membrane. Once in the cytosol, these pathogens both proliferate as well as generate sufficient mechanical forces to penetrate the plasma membrane of the host cell in order to infect new cells. Here, we show how this terminal step of the cellular infection cycle of L. monocytogenes (Lm) can be quantified by both colony-forming unit assays and flow cytometry and give examples of how both pathogen- and host-encoded factors impact this process. We also show a close correspondence of Lm infection dynamics of cultured cells infected in vitro and those of hepatic cells derived from mice infected in vivo. These function-based assays are relatively simple and can be readily scaled up for discovery-based high-throughput screens for modulators of eukaryotic cell function.

We describe both in vitro and in vivo infection assays that can be used to analyze the activities of host-encoding factors.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Evaluation of Host-Pathogen Responses and Vaccine Efficacy in Mice

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a striking increase in life expectancy around the globe. Nonetheless, determining vaccine efficacy remains a challenge. Emerging evidence suggests that the current acellular vaccine (aPV) for Bordetella pertussis (B. pertussis) induces suboptimal immunity. Therefore, a major challenge is designing a next-generation vaccine that induces protective immunity without the adverse side effects of a whole-cell vaccine (wPV). Here we describe a protocol that we used to test the efficacy of a promising, novel adjuvant that skews immune responses to a protective Th1/Th17 phenotype and promotes a better clearance of a B. pertussis challenge from the murine respiratory tract. This article describes the protocol for mouse immunization, bacterial inoculation, tissue harvesting, and analysis of immune responses. Using this method, within our model, we have successfully elucidated crucial mechanisms elicited by a promising, next-generation acellular pertussis vaccine. This method can be applied to any infectious disease model in order to determine vaccine efficacy.

Here we present an elegant protocol for in vivo evaluation of vaccine effectiveness and host immune responses. This protocol can be adapted for vaccine models that study viral, bacterial, or parasitic pathogens.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Vaccines are a 20th century medical marvel. They have dramatically reduced the morbidity and mortality caused by infectious diseases and contributed to a ...