We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.

NOTA: Le tre parti del protocollo descrivono l&#39;esposizione acquosa del farmaco DZNep alle zanzare larvali, un&#39;esposizione a base di sangue di DZNep per femmine adulte di studiare l&#39;effetto della fecondità, e SAH idrolasi inibizione da DZNep misurati utilizzando una semplice tecnica colorimetrica. Una rappresentazione schematica di questi test è mostrato in figura 1. 1. immaturi Mosquito sviluppo e la sopravvivenza saggi NOTA: Questa sezione spiega l&#39;uso di un farmaco solubile in acqua che colpisce lo sviluppo larve di zanzara e la sopravvivenza. <ol><li> Hatch A. uova gambiae a 28 ° C in acqua distillata (dH 2 O) e posteriore loro di 2 ° instar larve. </li><li> Prendete un DNAse sei bene, RNAse gratuito piastra di coltura cellulare e versare 10 ml dH 2 O per ogni bene. </li><li> Selezionare le larve di zanzara al 2 ° instar e aggiungere 15 larve per bene. Prima di aggiungere 2 ° instar larve alla piastra, pli ut su un tovagliolo di carta per 2-3 secondi per eliminare l&#39;acqua in eccesso. </li><li> Pozzi Label con nastri colorati di randomizzare esperimento. Etichetta 2 pozzetti per concentrazione di prova su ciascuna piastra (Figura 2). </li><li> Preparare una cloridrato 1 DZNep mm (MW = 298,73) stock soluzione sciogliendo 0,3 mg DZNep in 1 ml di dH 2 O. Aggiungere soluzione madre di DZNep.HCl ai pozzi etichettati per ottenere una concentrazione finale di 0,5 micron e 5,0 micron. NOTA: La soluzione madre può essere conservato a 4 ° C per il breve termine (1 giorno a un mese) o -20 ° C per un lungo periodo (più di un mese). NOTA: aggiunta della soluzione stock con concentrazioni suddetti non cambierà il volume di acqua nei pozzi significativamente. Tuttavia nel caso di concentrazioni molto più elevate, si consiglia di sciogliere il composto nel mezzo larvale per evitare qualsiasi diluizione inutili del composto. </li><li> Aggiungere la stessa quantità di cibo per pesci fiocco di ogni bene. Coprire la piastras e incubare a 28 ° C in un incubatore. </li><li> Registrare la mortalità per le zanzare larve DZNep-trattati e non trattati, dopo un periodo di esposizione di 24 ore. Rimuovere e scartare qualsiasi larve morte. Ripetere questa registrazione ogni giorno fino a quando tutti muoiono larve o pupate ed emergere come gli adulti. Registrare le dimensioni delle larve ogni due giorni, ossia, il giorno 0, 2, 4, 6, 8, fino pupate. </li><li> Analizzare lo sviluppo e mortalità larvale dati mediante un adeguato software di analisi statistica. NOTA: Un grafico a barre può essere utilizzato per rappresentare i dati di mortalità in Microsoft Excel. Analisi multivariata della varianza (MANOVA) eseguita con un software come JMP o SPSS rivelerà se diverse dosi del farmaco determinano sopravvivenza significativamente differente di larve di zanzara. </li></ol> 2. Fecondità Assay somministrando Drug Attraverso alimentatore artificiale a Female zanzare NOTA: Questa sezione descrive l&#39;aggiunta del farmaco al sangue unnd alimentandola a zanzare femmina adulti utilizzando un sistema di alimentazione artificiale. <ol><li> Impostare gabbie zanzara adulta, con uguale numero di zanzare maschio e femmina per il controllo e la gabbia di prova. Fornire una soluzione di zucchero del 10% imbevuto di batuffoli di cotone per entrambe le gabbie fino le femmine sono pronte per l&#39;alimentazione (3-5 giorni è ottimale per la Anopheles gambiae). </li><li> 2 ore prima della somministrazione di sangue, rimuovere le palline di cotone per assicurare le femmine sono affamati. </li><li> Assemblare due alimentatori sanguigni artificiali che consistono di un ampio imbuto rovesciato fondo di vetro (diametro = 50 mm, lunghezza = 70 mm) e una plastica circostante sigillato con colla industriale. Montare tubi di plastica (diametro = 7 mm) a due uscite alimentatori &quot;(diametro 10 mm) tramite connettori per afflusso e il deflusso delle acque. Etichettare i due alimentatori come &quot;controllo&quot; e &quot;5 micron DZNep.&quot; </li><li> Utilizzando un elemento riscaldante disponibile in commercio, impostare il programma per l&#39;alimentazione. In &quot;Menu&quot; andare su &quot;Impostazioni&quot;e selezionare &quot;Valori di riferimento&quot;; appariranno programmi precaricati. Selezionare &quot;SP1&quot; e impostare la temperatura per 37 ° C. NOTA: La resistenza assicura che il sangue somministrata viene mantenuto ad una temperatura costante. Impostazioni del programma aggiuntive possono essere utilizzate per diverse specie di zanzare o di insetti. </li><li> Riempire un secchio con acqua e immergere l&#39;elemento riscaldante in acqua. </li><li> Tagliare un pezzo quadrato di Parafilm (50 mm x 50 mm) e si estendono per fare un film sottile membranosa. Coprire il fondo delle mangiatoie artificiali con il Parafilm. Tagliare un altro pezzo di Parafilm (50 mm x 10 mm), allungare e sigillare i bordi degli alimentatori. </li><li> Assemblare il sistema, collegando gli alimentatori e resistenza dai tubi. Una volta completato, accendere il sistema e selezionare &quot;SP1&quot;. Premere &quot;Enter&quot; per avviare il sistema. NOTA: L&#39;acqua avrà riscaldata a 37 ° C e mantenuta a tale temperatura. </li><li> Monitor the la temperatura dell&#39;acqua con un termometro nel secchio d&#39;acqua. NOTA: I connettori e tubi aiutano a mantenere una costante circolazione di acqua attraverso il sistema in modo che la temperatura del sangue rimane a 37 ° C. </li><li> Riempire un vassoio fondo piatto con una soluzione di candeggina al 10% che verrà utilizzata per decontaminare eventuali sversamenti di sangue. </li><li> Aggiungere 2 ml di sangue di pecora defibrillato in una provetta. Etichettare questo come &quot;Control&quot;. Ripetere il processo per il tubo sperimentale etichettato come &quot;5 micron DZNep&quot; Add 6 ml di soluzione di riserva DZNep (vedi punto 1.5) al tubo sperimentale con l&#39;etichetta &quot;5 micron DZNep&quot; mescolare delicatamente il sangue e droga invertendo più volte. Incubare il tubo 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Utilizzando una pipetta, aggiungere 2 ml di controllo e di sangue di prova per la parte superiore di alimentatori corrispondentemente etichettati. Gettare la pipetta nella soluzione di candeggina. Coprire la gabbia con un sacchetto scuro e respirare l&#39;aria sulla gabbia periodicamente per incoraggiare females per l&#39;alimentazione. </li><li> Lasciate che le zanzare si nutrono per circa 30 min. Una volta che l&#39;alimentazione è completata, spegnere la resistenza, prendere le mangiatoie fuori e striscia la Parafilm. Mettere a bagno l&#39;alimentatore in soluzione di candeggina per circa 5 minuti e risciacquare bene con acqua deionizzata. </li><li> Rimuovere gli alimentatori e mettere batuffoli di cotone con acqua e zucchero sulle gabbie per 48 ore. Inserire un piatto di uova contenente acqua e carta da filtro nelle gabbie durante la notte per facilitare la deposizione delle uova. Etichettare ogni piatto di uova con la rispettiva concentrazione di prova o di controllo. </li><li> Rimuovere il piatto di uova giorno successivo ed esaminare il numero e la struttura di uova al microscopio stereo. Ottenere immagini utilizzando il software Q-colors5. Contare il numero di uova. Analizzare differenza nel numero di uova provenienti da test e di controllo gabbie. NOTA: Un t-test non appaiati può essere utilizzato per determinare se il numero di uova sono significativamente differenti (p ≤0.05). </li></ol> 3. biochimica Assay di Mosquito Enzyme Inhibitionby Drug NOTA: Questa sezione descrive un saggio di attività enzimatica utilizzando DTNB come indicatore per determinare l&#39;effetto di DZNep su SAH idrolasi inibizione in maschio adulto e zanzare femmina. <ol><li> Preparare una soluzione 0,1 M Na 2 HPO 4 (sodio fosfato bibasico) aggiungendo 14,19 g di Na 2 HPO 4 a 1 L di dH 2 O. Quindi, preparare una soluzione 0,1 M NaH 2 PO 4 (sodio fosfato monobasico) aggiungendo 13,79 g di NaH 2 PO 4 a 1 L di dH 2 O. </li><li> Titolare il M Na 2 HPO 4 soluzione 0.1 con la soluzione 4 0.1 M NaH 2 PO a pH 8,5. NOTA: Questa sarà la soluzione madre di lavoro di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparare una soluzione di omogeneizzazione 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) aggiungendo 0,3% Triton X-100. NOTA: La soluzione di omogeneizzazione può essere conservato a 4 ° C. </li><li> Prepare una soluzione 1.6 mM SAH (MW = 384,4) sciogliendo 6,15 mg di SAH in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). </li><li> Preparare una soluzione 1.6 mM DTNB (MW = 396.4) sciogliendo 6,3 mg di DTNB in 10 ml di 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Mantenere la soluzione DTNB fresco sul ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparare una DZNep.HCl 1 mM (MW = 298,73) soluzione sciogliendo 0,3 mg di DZNep in 1 ml dH 2 O. Successivamente, diluire la soluzione 1 mM DZNep in una serie di concentrazioni da 1,000 a 0,002 mM mM in dH 2 O. </li><li> Per misurare la SAH idrolasi inibizione da DZNep, preparare un estratto enzimatico crudo di zanzare: Omogeneizzare 10 zanzare adulte non sangue-fed in 1 ml di ghiacciata 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), contenente 0,3% Triton X- 100, utilizzando un omogeneizzatore fibra di vetro. Trasferire l&#39;omogeneizzato in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Centrifugare l&#39;omogeneizzato per 5 minuti a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire il surnatante in un ambiente pulito1,5 ml provetta. Utilizzare il surnatante come fonte dell&#39;enzima per il saggio biochimico SAH. </li><li> Per il trattamento vuota (cioè non DZNep, senza enzimi), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, e 100 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) per i singoli pozzetti di una 96 pozzetti, micropiastra fondo piatto. </li><li> Per il controllo (cioè non DZNep), aggiungere 50 microlitri 1.6 SAH mM, 50 microlitri 1.6 DTNB mM, 50 microlitri 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) e 50 microlitri enzima (SAH idrolasi ottenuto da estratto grezzo) all&#39;individuo pozzi. </li><li> Per i trattamenti DZNep, aggiungere 50 ml 1.6 SAH mm, 50 ml 1.6 DTNB mm, 50 microlitri di enzimi e 50 ml concentrazione DZNep selezionato singoli pozzi. Preparare 4 repliche per il trattamento e il controllo. </li><li> Leggere la densità ottica (OD) dei campioni enzimatici SAH a 405 nm per 5 minuti a intervalli di 20 sec utilizzando un lettore di micropiastre a 96 pozzetti. </li><li> Sottrarre la DO vuoto dal controllo di unnd trattamento OD ottenuto da ciascun pozzetto. Calcolare la percentuale rimanente attività di idrolasi SAH utilizzando la seguente equazione:% residuo attività = (Trattamento OD / controllo OD) x 100. </li></ol>

<ol>
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K., Cantoni, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perturbation+of+biochemical+transmethylations+by+3-deazaadenosine+in+vivo.">Perturbation of biochemical transmethylations by 3-deazaadenosine in vivo.</a> Biochemical Pharmacology. 28, 1897-1902 (1979).</li><li>Lu, Y. X., Denlinger, D. L., Xu, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+(PRC2)+protein+ESC+regulates+insect+developmental+timing+by+mediating+H3K27me3+and+activating+prothoracicotropic+hormone+gene+expression.">Polycomb repressive complex 2 (PRC2) protein ESC regulates insect developmental timing by mediating H3K27me3 and activating prothoracicotropic hormone gene expression.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288, 23554-23564 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Ci sono diversi passaggi vitali per l&#39;efficace applicazione di questo protocollo. Per il saggio larvale, occorre prestare attenzione a etichettare e replicare ogni concentrazione correttamente. Randomizzazione campioni di prova e aggiungendo la quantità di farmaco designato a rispettivi pozzetti di test è una parte importante di questo set up sperimentale. Prima di aggiungere 2 ° instar larve di zanzara ad una micropiastra a 96 pozzetti, ogni larva può essere messo su un tovagliolo di carta per 2-3 se...

La malaria è responsabile per il maggior numero di decessi insetti correlati al mondo. Si stima che circa 219 milioni di casi si verificano ogni anno in tutto il mondo, causando circa 660.000 morti, soprattutto in Africa 1. Nonostante gli sforzi concertati, la malaria programmi devono affrontare diverse sfide. Mentre insetticide trattati zanzariere e coperte componenti chiave forma irrorazione residue del programma, la resistenza agli insetticidi in popolazioni locali ostacolano questi sforzi 2. Il rapido aumento delle popolazioni di zanzare resistenti agli insetticidi è in gran parte attribuibile alla capacità delle zanzare di malaria di adattarsi rapidamente ai cambiamenti nel loro ambiente e sfruttare diverse nicchie 3,4,5. Per superare gli attuali meccanismi di resistenza agli insetticidi, l&#39;esplorazione di nuovi obiettivi insetticida e composti di nuova generazione è garantito. Un protocollo semplice, step-by-step per determinare l&#39;efficacia di insetticidi sperimentali sulle diverse fasi di vita della malaria mosquitoes avrebbero migliorare significativamente questi sforzi. Studi farmacologici di effetti dei farmaci sulle linee cellulari e modelli animali hanno stabilito l&#39;uso di farmaci epigenetici come un utile strumento per modulare la genetica e la fisiologia delle cellule e degli organismi. Metilazione del DNA e modificazione degli istoni sono due meccanismi epigenetici che influenzano l&#39;espressione genica in organismi pluricellulari senza cambiare la sequenza del DNA sottostante 6. Modificazioni post traduzionali quali metilazione svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento dell&#39;integrità cellulare e l&#39;espressione genica, e possono influenzare alcuni processi fondamentali 7,8,9. La ricerca in alcune specie di insetti hanno evidenziato l&#39;importanza di epigenetica in processi che coinvolgono oogenesi e staminali manutenzione cella 10, così come compensazione del dosaggio 11. Tuttavia, sono ancora da esplorare questi aspetti in vettori di malattie. Utilizzo di un composto a modulare questo sistema in zanzare potrebbe fornirci inluoghi nel romanzo percorsi di destinazione insetticida. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) è un inibitore della metilazione dell&#39;istone noto, che hanno un impatto su vari tipi di tumori sono stati studiati 12,13,14,15,16. DZNep è un farmaco stabile idrosolubile epigenetica che inibisce indirettamente istone lisina N -methyltransferase (EZH2), un componente del complesso Polycomb repressione 2 (PRC2) in cellule di mammifero. PRC2 svolge un ruolo importante nel regolare la crescita delle cellule staminali in organismi pluricellulari, e metilazione è un aspetto fondamentale della PRC2 mediato silenziamento genico. Nei topi immunocompromessi, cellule pre-trattati con DZNep hanno dimostrato di essere meno cancerogeno 17. Questo farmaco sta diventando utilizzato per lo studio di altre malattie, come la malattia del fegato grasso non-alcolica, in cui è implicato EZH2 18. DZNep è un consolidato S -adenosylhomocysteine ​​(SAH) inibitore idrolasi 19, 20. L&#39;inibizione dei risultati idrolasi SAH in unaccumulo di SAH e, a sua volta, porta alla inibizione dell&#39;attività metiltransferasi limitando gruppi donatori di metile disponibili. SAH è un derivato aminoacido utilizzato da molti organismi, inclusi gli insetti, nelle loro vie metaboliche. Un recente studio ha dimostrato che DZNep in basse dosi possono influenzare diapausa e ritardare lo sviluppo negli insetti 21. Qui, un protocollo robusto per studiare gli effetti di un composto solubile in acqua su diverse fasi di vita di zanzare si sviluppa. Le tre parti di questo protocollo sono le istruzioni per esaminare gli effetti di un composto idrosolubile sulle zanzare immaturi, adulti femmine si nutrono di sangue, e l&#39;attività enzimatica di maschio adulto e zanzare femmina. Innanzitutto, DZNep viene sciolto in acqua per studiare lo sviluppo zanzara immaturo e sopravvivenza. Questa operazione viene eseguita in due concentrazioni di confrontare le differenze derivanti da aumento di 10 volte in esposizione al farmaco. Per esplorare l&#39;effetto del farmaco sulla adulti zanzare femmina, DZNepsi aggiunge al sangue di pecora defibrillato e alimentato artificialmente il sangue alle femmine. Successivamente, il risultato del farmaco sulla fecondità viene esaminato. Infine, un saggio di attività enzimatica viene eseguita utilizzando 5,5&#39;-dithiobis- (acido 2-nitrobenzoico) (DTNB) come indicatore per determinare l&#39;effetto di DZNep sulla SAH idrolasi inibizione maschio adulto e zanzare femmina. Mentre questo protocollo è sviluppato con una zanzara malaria, Anopheles gambiae, può essere facilmente adattato per studiare gli effetti dei composti di interesse in qualsiasi specie di zanzara o altri insetti. Le tecniche descritti in questo protocollo non possono essere applicate in modo efficiente per un farmaco con limitata o nessuna solubilità in acqua o mezzi acquosi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="668">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:219px;">Name of the Reagent/Equipment&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td style="width:192px;">Company</td>
			<td style="width:133px;">Catalgue Number</td>
			<td style="width:125px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12565561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell culture plate</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7682-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Sorvall Fresco</td>
			<td>76003758</td>
			<td>A different centrifuge can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colored tape rolls</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S68134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTNB</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DZNep.HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SMLO305</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Egg dish cups</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter papers</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-795E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass feeders</td>
			<td>Virginia Tech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass tissue homogenizer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating element</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:133px;">NC0520091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Incubator</td>
			<td>Percival scientific</td>
			<td>I36VLC8</td>
			<td>A different incubator can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, &#160;2 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>22-283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge tube, 1.5 ml</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>4910 000.069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-3154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M-8643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pH meter&#160;</td>
			<td>Mettler Toledo 7easy</td>
			<td>S20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plate reader</td>
			<td>Spectramax</td>
			<td>M2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SAH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9384</td>
			<td>store at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

toxicological assays for testing effects of an epigenetic drug on development, fecundity and survivorship of malaria mosquitoes

Resistenza insetticida pone un grave problema per i programmi di controllo della malaria. Le zanzare si adattano a una vasta gamma di cambiamenti nell&#39;ambiente rapidamente, rendendo il controllo della malaria un problema onnipresente nei paesi tropicali. L&#39;emergere di popolazioni resistenti agli insetticidi garantisce l&#39;esplorazione di nuovi percorsi di destinazione della droga e composti per il controllo del vettore zanzara. Farmaci epigenetici sono ben stabiliti nella ricerca sul cancro, tuttavia, non si sa molto circa i loro effetti sugli insetti. Questo studio fornisce un semplice protocollo per esaminare gli effetti tossicologici di 3 Deazaneplanocin A (DZNep), un farmaco epigenetico sperimentale per la terapia del cancro, sul vettore della malaria, Anopheles gambiae. Un aumento di concentrazione-dipendente della mortalità e riduzione delle dimensioni è stata osservata in zanzare immaturi esposti a DZNep, mentre il composto ha ridotto la fecondità delle zanzare adulte rispetto a controllare i trattamenti. Inoltre, c&#39;è stata una diminuzione tossicodipendenti in S -adenosilomocisteina (SAH) attività di idrolasi in zanzare in seguito all&#39;esposizione a DZNep rispetto per controllare i trattamenti. Questi protocolli forniscono il ricercatore con una semplice procedura, step-by-step per valutare più endpoint tossicologici per un farmaco sperimentale e, a sua volta, dimostrano un approccio multi-polo unico per esplorare gli effetti tossicologici di farmaci o composti di epigenetici idrosolubili interessi contro le zanzare vettore e altri insetti.

La figura 1 è una rappresentazione schematica dei saggi; descrive le varie fasi della procedura descritta in questo articolo. Poiché il protocollo si basa su diversi cicli di vita zanzare, non vi è alcuna particolare sequenza da seguire per gli esperimenti qui descritti. L&#39;utente può scegliere di effettuare uno o più test contemporaneamente, a seconda della disponibilità di esempio. Figura 2 mostra la piastra impostato per lo sviluppo e la s...

Watch this Scientific Journal Video about Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes at JoVE.com

Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.

Saggi tossicologici per gli effetti di prova di un epigenetica droga sullo sviluppo, Fecondità e Sopravvivenza di malaria zanzare

Insecticidal resistance poses a major problem for malaria control programs. Mosquitoes adapt to a wide range of changes in the environment quickly, making ...

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Research

JoVE Journal

Biology

8.4K Views.  Virginia Tech. A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition. 

Video: Toxicological Assays for Testing Effects of an Epigenetic Drug on Development, Fecundity and Survivorship of Malaria Mosquitoes

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This video protocol demonstrates a method used by the James laboratory to microinject DNA constructs into Anopheles stephensi embryos for the generation of transformed mosquitoes. Techniques for preparing microinjection needles, collecting and preparing embryos and performing the microinjection are illustrated.

Anopheles stephensi mosquitoes are vectors for malaria inhabiting India and throughout Asia. This video demonstrates the technique for performing microinjections of this species with transgenes that will confer resistance to the malaria to the mosquito. Much of the methodology demonstrated in this video is applicable to microinjection techniques of other mosquito species.

Iniezione di An. Gli embrioni stephensi per generare la malaria resistenti zanzare

The introduction of exogenous genes into the genomes of mosquitoes requires microinjection techniques tailored to the specific species of interest. This ...

Ricerca

Biologia

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes (A. aegypti) and Infection Phenotype Determination

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of the virus in the mosquito tissues. This protocol is routinely used for studying mosquito-virus interactions, especially for identification of novel host factors that are able to determine vector competence. The entire experiment must be conducted in a BSL2 laboratory. Similar to Plasmodium falciparum infections, proper attire including gloves and lab coat must be worn at all times. After the experiment, all the materials that came in contact with the virus need to be treated with 75% ethanol and bleached before proceeding with normal washing. All other materials need to be autoclaved before discarding them.

Protocol for Dengue Infections in Mosquitoes A. aegypti and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for the dengue virus, it must be evaluated for it's role in preventing viral infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of dengue infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for growing up the virus in culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocollo per la dengue in Zanzare (A. aegypti) e Fenotipo Determinazione infezione

The purpose of this procedure is to infect the Aedes mosquito with dengue virus in a laboratory condition and examine the infection level and dynamic of ...

Protocol for Plasmodium falciparum Infections in Mosquitoes and Infection Phenotype Determination

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito.    This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed.  The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the mosquito. This protocol illustrates how the extent of plasmodium infections of mosquitoes can be assayed. The techniques for preparing the gametocyte culture, membrane feeding mosquitoes human blood, and assaying viral titers in the mosquito midgut are demonstrated.

Protocollo per Plasmodium falciparum infezioni in Fenotipo Determinazione Zanzare e infezione

Once a gene is identified as potentially refractory for malaria, it must be evaluated for its role in preventing Plasmodium infections within the ...

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocollo per saggi RNAi in zanzare adulte (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Preventing the Spread of Malaria and Dengue Fever Using Genetically Modified Mosquitoes

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced, as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission. Population replacement strategy, the idea that transgenic mosquitoes can be released into the wild to control disease transmission, is introduced as well as the concept of genetic drive and the design criterion for an effective genetic drive system. The ethical considerations of releasing genetically-modified organisms into the wild are also discussed.

Prevenire la diffusione della malaria e la dengue utilizzo Zanzare geneticamente modificate

In this candid interview, Anthony A. James explains how mosquito genetics can be exploited to control malaria and dengue transmission.   Population ...

Building a Better Mosquito: Identifying the Genes Enabling Malaria and Dengue Fever Resistance in A. gambiae and A. aegypti Mosquitoes

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections.   Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus infections. Explanation is given for how key refractory genes, those genes conferring resistance to vector pathogens, are identified in the mosquito and how this knowledge can be used to generate transgenic mosquitoes that are unable to carry the malaria parasite or dengue virus.

Costruire un Mosquito migliore: l&#39;identificazione dei geni Abilitazione malaria e febbre dengue Resistenza in A. gambiae e A. aegypti zanzare

In this interview, George Dimopoulos focuses on the physiological mechanisms used by mosquitoes to combat Plasmodium falciparum and dengue virus ...

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase (COX/SDH) Double-labeling Histochemistry

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of aging suggests a role for mtDNA mutations, which can alter bioenergetics homeostasis and cellular function, in the aging process 3. A wealth of evidence has been compiled in support of this theory 1,4, an example being the mtDNA mutator mouse 5; however, the precise role of mtDNA damage in aging is not entirely understood 6,7.
Observing the activity of respiratory enzymes is a straightforward approach for investigating mitochondrial dysfunction. Complex IV, or cytochrome c oxidase (COX), is essential for mitochondrial function. The catalytic subunits of COX are encoded by mtDNA and are essential for assembly of the complex (Figure 1). Thus, proper synthesis and function are largely based on mtDNA integrity 2. Although other respiratory complexes could be investigated, Complexes IV and II are the most amenable to histochemical examination 8,9. Complex II, or succinate dehydrogenase (SDH), is entirely encoded by nuclear DNA (Figure 1), and its activity is typically not affected by impaired mtDNA, although an increase might indicate mitochondrial biogenesis 10-12. The impaired mtDNA observed in mitochondrial diseases, aging, and age-related diseases often leads to the presence of cells with low or absent COX activity 2,12-14. Although COX and SDH activities can be investigated individually, the sequential double-labeling method 15,16 has proved to be advantageous in locating cells with mitochondrial dysfunction 12,17-21.
Many of the optimal constitutions of the assay have been determined, such as substrate concentration, electron acceptors/donors, intermediate electron carriers, influence of pH, and reaction time 9,22,23. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) is an effective and reliable electron donor 22. In cells with functioning COX, the brown indamine polymer product will localize in mitochondrial cristae and saturate cells 22. Those cells with dysfunctional COX will therefore not be saturated by the DAB product, allowing for the visualization of SDH activity by reduction of nitroblue tetrazolium (NBT), an electron acceptor, to a blue formazan end product 9,24. Cytochrome c and sodium succinate substrates are added to normalize endogenous levels between control and diseased/mutant tissues 9. Catalase is added as a precaution to avoid possible contaminating reactions from peroxidase activity 9,22. Phenazine methosulfate (PMS), an intermediate electron carrier, is used in conjunction with sodium azide, a respiratory chain inhibitor, to increase the formation of the final reaction products 9,25. Despite this information, some critical details affecting the result of this seemly straightforward assay, in addition to specificity controls and advances in the technique, have not yet been presented.

Visualization of Mitochondrial Respiratory Function using Cytochrome C Oxidase / Succinate Dehydrogenase COX/SDH Double-labeling Histochemistry

The cytochrome c oxidase/sodium dehydrogenase (COX/SDH) double-labeling method allows for direct visualization of mitochondrial respiratory enzyme deficiencies in fresh-frozen tissue sections. This is a straightforward histochemical technique and is useful in investigating mitochondrial diseases, aging, and aging-related disorders.

Visualizzazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando Citocromo C Ossidasi / succinato deidrogenasi (COX / SDH) Doppio etichettatura Istochimica

Mitochondrial DNA (mtDNA) defects are an important cause of disease and may underlie aging and aging-related alterations 1,2. The mitochondrial theory of ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

A Multi-detection Assay for Malaria Transmitting Mosquitoes

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, several traits are typically characterized using molecular assays to aid in epidemiological studies. These traits include species identification, insecticide resistance, parasite infection status, and host preference. Since populations of the Anopheles gambiae complex are morphologically indistinguishable, a polymerase chain reaction (PCR) is traditionally used to identify species. Once the species is known, several downstream assays are routinely performed to elucidate further characteristics. For instance, mutations known as KDR in a para gene confer resistance against DDT and pyrethroid insecticides. Additionally, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) or Plasmodium parasite DNA detection PCR assays are used to detect parasites present in mosquito tissues. Lastly, a combination of PCR and restriction enzyme digests can be used to elucidate host preference (e.g., human vs. animal blood) by screening the mosquito bloodmeal for host-specific DNA. We have developed a multi-detection assay (MDA) that combines all of the aforementioned assays into a single multiplex reaction genotyping 33SNPs for 96 or 384 samples at a time. Because the MDA includes multiple markers for species, Plasmodium detection, and host blood identification, the likelihood of generating false positives or negatives is greatly reduced from previous assays that include only one marker per trait. This robust and simple assay can detect these key mosquito traits cost-effectively and in a fraction of the time of existing assays.

Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.

Un test multi-rilevamento per la malaria Trasmissione Zanzare

The Anopheles gambiae species complex includes the major malaria transmitting mosquitoes in Africa. Because these species are of such medical importance, ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolli per testare la tossicità di romanzo chimiche insetticide per le zanzare

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...