Ringraziamo il Dr. Randy Elkins, Robin Kastenmayer, Ted Torrey, Dan Pare e Tovi Lehman per la lettura critica di manoscritti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Intramurale della Divisione di ricerca intramurale, Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive, National Institutes of Health, e dal Programma nazionale di ricerca di base 973 della Cina, # 2007CB513103. Ringraziamo NIAID intramurale editor di Rae Brenda Marshall per l&#39;assistenza.

Tecniche asettiche devono essere applicati a tutti i materiali che saranno somministrati in animali al fine di evitare l&#39;introduzione accidentale di agenti infettivi esogeni in topi che possono confondere i risultati sperimentali. 1. L&#39;infezione di topi da laboratorio con sangue stadio parassiti della malaria <ol><li> A temperatura ambiente, disgelo due fiale contenenti il ​​sangue congelato parassiti della malaria stadio da attraversare. In questo esempio, due ceppi di roditori parassita della malaria da Plasmodium utilizzati sono yoelii yoelii e Plasmodium nigeriensis yoelii. </li><li> Montare una siringa con un calibro 22-30 (G) l&#39;ago e redige 400 ml di sterile, di grado farmaceutico PBS (pH 7,4). </li><li> Utilizzando la stessa siringa, elaborare 100 l di sangue infetto scongelati; invertire la siringa su e giù fino a quando il contenuto è omogeneo misto. (Opzionale: una pipetta può essere utilizzato per trasferire PBS e il sangue infetto in un tubo di raccolta prima di trasferire in una siringa per iniezione). </li><li> Iniettare 200 ul di parassita che contiene la soluzione direttamente nel peritoneo di un mouse. Al termine, scartare la siringa in un contenitore taglienti. (Vedi anche Materiali complementari per la manutenzione di topi di laboratorio). In generale, la dimensione standard del inoculo è compresa tra 100-500 microlitri, a seconda dei livelli di infezioni parassita nei materiali originali congelato. </li><li> Iniettare i due ceppi di parassiti da attraversare in due topi ciascuno. I topi saranno positivi microscopicamente 3 a 5 giorni dopo le iniezioni. Quando parasitemias raggiungere tra 1-5%, passare alla fase successiva. </li></ol> 2. Clone infezione mista di topi <ol><li> Prima di infezione clone misti, raccogliere il sangue coda dalle due topi donatori infettati con ceppi diversi parassita per l&#39;esame microscopico di strisci colorati Giemsa fluidificare il sangue (Fig. 3), e per la misurazione della densità dei globuli rossi (vedi Materiali supplementari per le procedure dettagliate) . </li><li> Calcolare il volume di una soluzione fisiologica (1,5% w / v citrato trisodico biidrato, 0,85% w / v di cloruro di sodio) e il sangue del mouse necessario per produrre una miscela di inoculo, utilizzando la parassitemia e rosso sangue le misurazioni della densità delle cellule ottenute in precedenza. </li><li> Regolare la soluzione parassita ad una concentrazione finale di un milione di cellule infette rossi del sangue per 100μl. </li><li> Combina il sangue infetto da due donatori in un rapporto 1:1 per ottenere un misto clone di inoculo. Quando i due cloni parentali si differenziano per il tasso di crescita, regolare le proporzioni di una più rapida crescita dei genitori ad una crescita lenta clone dei genitori per 1:2 o 1:5. </li><li> Iniettare 100 ul del campione misto nel peritoneo di ogni topo di essere infetti. (Vedi anche punto 3,9 a determinare il numero di topi da iniettare) </li><li> Utilizzando questo metodo, infettare ogni due mouse con i ceppi singoli genitori. Il singolo-clone infezioni consentirà di determinare la trasmissione di successo dei due ceppi parentali. </li></ol> 3. Le zanzare di alimentazione <ol><li> Preparare tre gabbie contenenti 300-500 adulti (maschi e femmine) le zanzare anofele stephensi ciascuno, età 5-7 giorni dopo l&#39;emergere di pupe. I contenitori sono coperti con una rete sicura da un coperchio di plastica o metallo. Due gabbie sono per l&#39;alimentazione sui cloni dei genitori; la gabbia terzo è per la preparazione di un incrocio. </li><li> A partire quattro giorni dopo la mixed-clone di infezione, preparare Giemsa macchiato di sottili strisci di sangue dalla coda dei topi infetti. </li><li> Esaminare il strisci sotto un microscopio attraverso la scansione di almeno 50 campi microscopici ad ingrandimento 1000x e determinare se gametociti maschili e femminili sono presenti. </li><li> Gametociti maschili e femminili sono riconoscibili per la presenza di grandi granuli vacuolo e di grandi dimensioni (Fig. 3). Gametociti maschili e femminili hanno citoplasma rosa e blu, rispettivamente. Se gametociti sono presenti, seguire passo 3.6. </li><li> Se gametociti sono assenti, continuare a monitorare ogni giorno fino a che non appaiono. Se gametociti sono presenti, continuare il passo successivo. </li><li> Iniettare 50 ml di cocktail di farmaci anestetici contenenti 33 mg / ml di ketamina e 3 mg / mL di xylazina nel peritoneo di un mouse per anestetizzare ogni topo infetto (per 20 grammi di peso corporeo del mouse). Ultima dose di ketamina e xilazina è 82,5 e 7,5 mg / kg, rispettivamente. </li><li> Posizionare i topi a faccia in giù sulla cima di una gabbia contenente adulto zanzare Anopheles stephensi che sono stati affamati di approvvigionamento di zucchero per 24 ore e consentono di alimentare le zanzare per 30 minuti senza interruzioni. </li><li> Mantenere le zanzare in una insectary in condizioni standard (temperatura è mantenuta tra 24-26 ° C; vedere anche Metodi supplementare per la manutenzione del laboratorio di zanzare). </li><li> Utilizzare un mouse infetti per ogni 50-100 zanzare femmine. Euthanize i topi immediatamente dislocazione cervicale dopo l&#39;alimentazione, mentre i topi sono ancora sotto anestesia. </li></ol> 4. Mosquito Midg dissezioneUTS e oocisti di conteggio <ol><li> Nove giorni dopo la poppata, le zanzare saranno esaminate per oocisti in midgut dell&#39;insetto. La presenza di oocisti nelle zanzare che si nutrono di topi infettati singolo clone indica che gametociti dei due ceppi parentali sono infettive. </li><li> Di sezionare un midgut zanzara, utilizzare un aspiratore collegato ad un piccolo contenitore per raccogliere 5-10 zanzare infette dalla gabbia. </li><li> Utilizzando gas CO 2, anestetizzare le zanzare e trasferirli in un piatto di vetro Petri sul ghiaccio. Separare ed eliminare le zanzare maschio. Le antenne dei maschi sono notevolmente più folta rispetto alle femmine. </li><li> Riempire due siringhe con PBS e in forma con 26 calibro mezzo pollice (G ½) aghi. Deposito di circa 100 l di PBS da una siringa su un vetrino. </li><li> Trasferimento 5-10 zanzare femmina anestetizzato sulla goccia di PBS e il luogo di diapositive su un microscopio da dissezione. </li><li> Utilizzando gli aghi stesso, togliere le ali ogni zanzara e gambe, poi, tenendo l&#39;insetto al torace e l&#39;addome posteriore, estrarre il corpo senza fino alla midgut, un bianco sac-come corpo, viene rilasciato. Staccare il midgut e scartare il resto del corpo. </li><li> Aggiungere più PBS sulla midgut se le diapositive sono asciutte. Il midgut degenererà se lascia secca. Posizionare un vetrino sulla midguts. </li><li> Esaminare il midguts sotto un microscopio ottico con un ingrandimento 100x. Contare il numero di oocisti in ogni midgut (Fig. 3). Oocisti sono riconoscibili come strutture circolari spesse pareti che si trovano sulla superficie esterna del midguts. </li><li> Al termine, disporre di siringhe, aghi e far scorrere in un contenitore taglienti. </li><li> Se oocisti sono assenti nel midguts, mangimi zanzare con i topi infettati con il maggior numero di gametociti e dare un tempo più lungo di alimentazione. La temperatura è fondamentale per questo passaggio. Assicurarsi che la temperatura è impostata a 24 a 26 ° C. </li></ol> 5. Raccolta sporozoiti da zanzare per centrifugazione <ol><li> Preparare provette sporozoite come segue: tagliare il coperchio di una pulizia di 0,5 ml di tubo di centrifuga, un buco (0,1-0,2 mm di diametro) nella parte inferiore del tubo con una fiammata 19 ago G. </li><li> Riempire 1 / 3 del tubo con lana di vetro. Inserire il tubo in un filtro da 1,5 mL tubo di raccolta (un tubo è sufficiente per sporozoiti raccolto da circa 100 zanzare) </li><li> Il giorno 17 di alimentazione messaggio, raccogliere le zanzare (Fase 4) dalle gabbie in un piccolo contenitore con un aspiratore. </li><li> Utilizzare gas CO 2 per anestetizzare le zanzare. </li><li> Separare le femmine dalle zanzare maschio. Trasferire le zanzare femmine anestetizzato dal contenitore per un piatto di vetro Petri sul ghiaccio. </li><li> Preparare due siringhe con aghi 26 G ½ pieno di PBS. Deposito di circa 100 l di PBS da una siringa su un vetrino. </li><li> Trasferire le zanzare su un vetrino da microscopio. Togliere la testa le zanzare &#39;, ali, gambe, addome e sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Utilizzando punta fine pinze trasferire i toraci in 0,5 ml di PBS in un 1,5 mL omogeneizzatore (mortaio e pestello). Conservare il toraci su ghiaccio (sporozoite rimane infettivi per 2-3 h). </li><li> Omogeneizzare la toraci sul ghiaccio per liberare sporozoiti dalle ghiandole salivari (vedi figura 3), e trasferire i lisati (omogenati) nel tubo riempito di lana di vetro (Fase 5,1-5,2) usando una pipetta di vetro. </li><li> Centrifugare per 10 a 20 sec a 1000 rpm a temperatura ambiente. </li><li> Raccogliere il flow-through (la sospensione sporozoite purificato) utilizzando una siringa con un ago 22-30 G. (Opzionale: calo 10-50 microlitri della flow-through su un vetrino da microscopio, posizionare una copertura antiscivolo e visualizzare gli sporozoiti vivere sotto un microscopio ottico standard, ingrandimento 400X, vedi anche Fig. 3) </li><li> Iniettare ip 0,1-0,5 mL di sospensione sporozoite in topi (fino a 200.000 parassiti può essere raccolto da una zanzara, vedi rif 12). In un caso di successo, l&#39;animale si infetta 72 ore dopo l&#39;iniezione. </li></ol> 6. Clonazione Progeny si utilizza la diluizione limitata <ol><li> Settantadue ore dopo le iniezioni sporozoite, raccogliere il sangue coda dalle due topi donatori infettati con ceppi diversi parassita per l&#39;esame microscopico dopo colorazione di Giemsa strisci di sangue sottile e per la misurazione della densità dei globuli rossi (vedi Materiali supplementari per le procedure dettagliate). </li><li> Scegli un mouse visualizzando una parassitemia 0,1-1% e le cui cellule infette globuli rossi contengono parassiti per lo più single, come donatore per la procedura di clonazione. Ripetere il passo 6,1 giorno successivo, se i topi sono microscopicamente negativi. Se gli animali non sono infetti entro 14 giorni, ripetere il passo 2 a 5 e determinare la presenza di sporozoiti al punto 5.11). </li><li> Diluire il sangue coda raccolte in un freddo 1:01 soluzione di Ringer siero di vitello e dei mammiferi (2,7 mM di cloruro di potassio, 1,8 mM di cloruro di calcio, cloruro di sodio 154 mM) in modo da raggiungere una truffaconcentrazione da 0,6 a 1 cella di sangue infetto rosso per 100 l, e memorizzare l&#39;inoculo sul ghiaccio. In questo modo, la maggior parte del mouse individuo dovrebbe ricevere uno o zero parassiti. </li><li> Per via endovenosa iniettare 100 ml di sangue infetto diluito in ogni da 50 a 100 topi. </li><li> Cinque a sette giorni dopo, sullo schermo i topi per la presenza di parassiti fase sangue esaminando Giemsa-macchiate strisci di sangue sottile. In un esperimento riuscito, 20-50% dei topi infettati e mostrerà parassitemia del 0,1-5,0% al giorno 8 l&#39;infezione. </li></ol> 7. Caratterizzazione di Progeny utilizzando marcatori genetici <ol><li> Colleziona 20-40 l di sangue del mouse in una coda di 1,5 mL provetta contenente 0,2 ml di acqua refrigerata soluzione di citrato fisiologica salina, mescolare brevemente nel vortex e centrifugare per 3 min a 3000 rpm a temperatura ambiente per far sedimentare le cellule del sangue. Estrarre il DNA immediatamente o tenere il pellet a -80 ° C. </li><li> Preparare DNA parassita utilizzando qualsiasi metodo di estrazione del DNA. Per l&#39;isolamento rapido di DNA, utilizzare un modello ad alta Pure PCR preparazione kit (Roche Applied Bioscience). </li><li> Ricombinante progenie vengono identificati dopo genotipizzazione mediante microsatelliti (MS) o singoli polimorfismi nucleotidici (SNP) su cromosomi diversi che possono differenziare i due ceppi parentali della croce genetica. Un metodo semplificato utilizzando una singola primer fluorescente marcato per MS genotipizzazione di P. yoelii può essere utilizzato (vedi rif 8,9). </li></ol> 8. Crioconservazione di sangue allo stadio parassiti della malaria <ol><li> Raccogliere 0,5-1 ml di sangue infetto mediante puntura cardiaca da un mouse anestetizzati con parassitemia del 5-20% in 5-10 ml di soluzione fisiologica salina fredda. </li><li> Centrifugare per 5 min a 2000 rpm a temperatura ambiente. Gettare il surnatante. </li><li> Aggiungere goccia a goccia il volume di 2x Glycerolyte 57 soluzione (Fenwal Laboratories) sul pellet di sangue e mescolare bene. </li><li> Trasferire la sospensione in cryotubes (0,2-0,5 ml per provetta). </li><li> Conservare il sangue criopreservati a -80 ° C (fino a 1 mese) o in azoto liquido. </li></ol> 9. Rappresentante dei risultati: In un esperimento riuscito, il 5-10% delle linee clonato sarà indipendente progenie ricombinante. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una rappresentazione schematica del ciclo di vita e gli eventi di ricombinazione genetica nel corso di un incrocio. Eventi di ricombinazione genetica si svolgono durante la fase iniziale di sviluppo nella zanzara. Dopo la fecondazione di &quot;aploidi&quot; gameti maschili e femminili di diverse origini genetiche nel midgut della zanzara, &quot;diploide&quot; zigoti sono formate. Lo zigote rappresenta l&#39;unica tappa diploide del ciclo di vita dei parassiti; meiosi segue entro 12 ore dalla fecondazione, e tutte le fasi successive nella zanzara e mammiferi rimangono aploidi. Gli zigoti risultanti si sviluppano in ookinetes e oocisti. Crescita e la divisione mitotica di ogni oocisti produce migliaia di sporozoiti, che vengono rilasciati in hemoceal zanzare &#39;. Quelli sporozoiti che migrano verso le ghiandole salivari sono in grado di essere trasmessi a un ospite mammifero, dove lo sviluppo del fegato e globuli rossi fasi avviene. Nel corso dei cicli di globuli rossi, alcuni parassiti possono differenziarsi in maturare gametociti maschili e femminili. Il ciclo di vita del parassita si completa quando questi gametociti sono prese da un altro la trasmissione zanzara, perpetuando. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Ereditarietà dei geni nucleari in parassiti della malaria e la produzione di progenie ricombinante. Ricombinazione genetica può essere generato attraverso il riassortimento dei cromosomi o da eventi di crossover. Progenie omozigote prodotto da autofecondazione tra gameti del clone stessi genitori 1 o 2 (A e D), rispettivamente. B) progenie eterozigote prodotto dalla fertilizzazione incrociata tra gameti di due diversi cloni dei genitori, nuclei ricombinante (ovali blu) che è costituita da riassortimento cromosomiche solo. C) progenie eterozigote prodotta da fertilizzazione incrociata tra gameti di due cloni differenti genitore, nuclei ricombinante (ovali rosso) è formata da incroci tra il non-sorella cromatidi dei cromosomi omologhi. <img src="/files/ftp_upload/2365/2365fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Morfologia della malaria roditore parassita Plasmodium yoelii. A) fase anello, B) trofozoite, C) schizonte, D) merozoiti, E) immaturi gametocyte maschile, F) gametocyte maturo maschio, G) immaturi gametocyte femminile, H) gametocyte Donna matura, I) midgut oocisti con il 10 ° giorno dopo alimentazione (oocisti mature indicato dalle frecce; ingrandimento 200x), J) zanzara ghiandole salivari (ingrandimento 100x), K) sporozoiti (ingrandimento 400x).

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Dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio nella malaria da Plasmodium yoelii roditore, che è applicabile anche alla produzione di croci genetica in malarie altri roditori. Infezioni di topi con singoli cloni dei genitori sono di solito eseguite per determinare la trasmissione di successo dei parassiti dei genitori per garantire che i genitori sono competenti nel produrre gameti funzionali prima di eseguire una croce. Trasmissione di successo attraverso una zanzara è...

SUPPLEMENTARI MATERIALI: <ul><li> Mantenimento di topi di laboratorio </li><li> Manutenzione di laboratorio zanzare </li><li> L&#39;esame microscopico di strisci di sangue sottili colorati con Giemsa </li><li> Misura della densità dei globuli rossi </li></ul> Mantenimento di topi di laboratorio Femmine di ceppo inbred topo di laboratorio BALB / c, dai 5 agli 8 settimane di età, sono utilizzati nello studio. I topi sono alloggiati in uno standard a fondo compatto gabbia in policarbonato con filo-bar coperchio, dotato di alimentatore e una bottiglia d&#39;acqua. I topi sono mantenute ad una temperatura costante (25 ± 1 ° C) ore 12:12 luce: ciclo scuro. I topi sono autorizzati a nutrirsi 2018S Harlan Teklad globale del 19% di proteine ​​dieta dei roditori estruso (sterilizzabile; da Harlan-Teklad) e dotate di bere ad libitum acidificato acqua. Gli esperimenti sugli animali sono eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso l&#39;Istituto Nazionale di Allergologia e Malattie Infettive sotto protocollo LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland). Manutenzione di laboratorio zanzare Le zanzare sono da un laboratorio di razza colonia di Anopheles stephensi. Gli adulti sono mantenuti in gabbie di nylon tenuti in una temperatura e umidità controllate camera (23 a 25 ° C per Plasmodium yoelii e Plasmodium chabaudi, e 19 a 21 ° C per Plasmodium berghei; 80-95% di umidità; sul 12:12 ore di luce: ciclo scuro). Zanzare adulte sono alimentati con il 10% di glucosio e 2,00% para-aminobenzoico (PABA) soluzione di acqua integrato. Per ottenere alta qualità adulti, 500 larve si sviluppano in una condizione di bassa densità in 1 L di acqua distillata in un 1.000 cm 3 piatto aperto fornito con circa 1 mg di bicarbonato di sodio. Dopo la schiusa, le larve sono dati TetraMin polvere (PETCO) fino a quando si sviluppano in fase di pupa e sono trasferiti al gabbie zanzara adulta per emergenti. L&#39;esame microscopico di strisci di sangue sottili colorati con Giemsa Con forbici pulite tagliare la punta (1,0 mm) della coda del topo infetto. Porre una goccia (0.5-1.0 mL) di sangue coda su un vetrino pulito. Topo sangue si fermerà in 1-2 min. Posizionare un vetrino pulito diffusore sulla parte superiore della goccia di sangue, mantenendola ad un angolo di 45 ° rispetto alla diapositiva campione, e permettere al sangue di assorbire per tutta la larghezza del diffusore. Tenere il vetrino e spingere in avanti il ​​vetrino diffusore rapidamente e senza intoppi per la produzione di uno striscio sottile. Lasciare che il film di sangue secco, e poi immergere i vetrini in metanolo assoluto. Lasciare che il vetrino asciugare ancora una volta prima di coprire con Giemsa (10% Giemsa colorante in acqua distillata). Dopo l&#39;incubazione del film fluidificare il sangue per 10-15 minuti a temperatura ambiente, risciacquare con cura i vetrini con acqua di rubinetto e lasciare asciugare all&#39;aria. Esaminare il numero di globuli rossi infetti (iRBC; vedi Figura 3 per la morfologia di RBC infetti) sotto un microscopio ottico con olio di immersione con ingrandimento 1000x (con lente obiettivo 100x) e calcolare parassitemia (il numero di iRBC per 100 RBC contati). Diversi ceppi di parassiti della malaria variare del tasso di crescita e la patogenicità. Monitoraggio della fase parasitaemias sangue può essere eseguita 24 ore dopo le iniezioni, a seconda della dose dei parassiti della malaria nel sangue stadio. Per esempio, i topi saranno microscopicamente positivo 24 ore quando iniettato con 10 7 globuli rossi infetti intraperitoneale o 10 6 RBC infetti per via endovenosa. Misura della densità dei globuli rossi Come i livelli di parasitaemias, globuli rossi (RBC) densità in topi infettati varia nel corso dell&#39;infezione. Densità RBC deve essere misurato entro 1-2 ore prima dell&#39;inizio della singola infezione e mixed-clone e gli esperimenti di clonazione. Ci sono due metodi di misura della densità di RBC: un conteggio manuale utilizzando Neubauer emocitometro e un conteggio automatico utilizzando un Cellometer (Nexcelom Bioscience). In entrambi i metodi, prelevare 1 ml di sangue del mouse coda utilizzando un capillare di vetro (VWR) e diluire in 10 ml di PBS e mescolare bene. Per utilizzare un emocitometro Neubauer, carico 20 l di sospensione sul emocitometro. Posizionare il emocitometro su un microscopio ottico, con lenti dell&#39;obiettivo 10x. Il emocitometro contiene una griglia suddivisa in 9 grandi piazze, e 4 grandi piazze in un angolo sono ulteriormente suddivisi in 16 piccoli quadrati. Contare il numero totale di cellule in ciascuna delle 16 piccole piazze nelle quattro piazze d&#39;angolo. Per evitare il pregiudizio o il conteggio delle cellule che si sovrappongono una linea della griglia, conta una cella come &quot;in&quot; se si sovrappone le linee superiore o destro e &quot;out&quot; se si sovrappone le linee di basso o sinistra. Stimare il numero di celle per una piazza piccola e dividere per 0,00625 (il volume di una piccola piazza è 6,25 nL). Questo restituisce il numero di cellule per microlitro (&amp;mu, L). Da questi dati, calcolare la densità finale delle cellule rosse del sangue moltiplicando con 10.000 (un fattore di diluizione). Sciacquare il vetrino e la camera di conteggio con acqua distillata e 70% di etanolo, aria secca. In alternativa, caricare 20 l di sospensione su un vetrino da camera Cellometer conteggio. Inserire il vetrino in una camera scivolo Cellometer (il lettore). Avviare il software Cellometer, selezionare l&#39;opzione &quot;globuli rossi&quot; opzione e immettere un fattore di diluizione di 10.000. Registrare la densità di RBC.

protocol for production of a genetic cross of the rodent malaria parasites

Variazione di risposta ai farmaci antimalarici e della patogenicità dei parassiti della malaria è di importanza biologica e medica. Mappatura collegamento ha portato alla identificazione di successo di geni o loci sottostante vari tratti di parassiti della malaria di roditori 1-3 e gli esseri umani 4-6. Il parassita della malaria Plasmodium yoelii è una delle specie di malaria molti isolato da roditori selvatici africani ed è stato adattato a crescere in laboratorio. Questa specie riproduce molte delle caratteristiche biologiche dei parassiti della malaria umana; marcatori genetici come microsatelliti e amplificato frammento lunghezza polimorfismo (AFLP) i marcatori sono stati sviluppati anche per il parassita 7-9. Così, gli studi genetici in parassiti della malaria roditori possono essere eseguite per completare le ricerche sul Plasmodium falciparum. Qui, noi dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio in P. yoelii che sono stati pionieri di Drs. David Walliker, Richard Carter, ei suoi colleghi presso l&#39;Università di Edimburgo 10. Incroci genetici in P. yoelii e altri parassiti della malaria roditori sono condotte da infettando i topi Mus musculus con un inoculo contenente gametociti di due cloni geneticamente distinte che si differenziano per fenotipi di interesse e permettendo zanzare di nutrirsi di topi infettati 4 giorni dopo l&#39;infezione. La presenza di gametociti maschili e femminili nel sangue mouse è microscopicamente confermato prima della somministrazione. Entro 48 ore dopo il pasto, nel midgut della zanzara, i gametociti aploide differenziarsi in gameti maschili e femminili, fertilizzare, e forma uno zigote diploide (Fig. 1). Durante lo sviluppo di uno zigote in un ookinete, meiosi sembra verificarsi 11. Se lo zigote è il risultato di fertilizzazione incrociata tra gameti di due parassiti geneticamente distinte, scambi genetici (riassortimento cromosomiche e cross-over tra i non-sorella cromatidi di una coppia di cromosomi omologhi;. Fig. 2) possono verificarsi, con conseguente ricombinazione di materiale genetico di loci omologhi. Ogni zigote subisce due successive divisioni nucleari, portando a quattro nuclei aploidi. Un ookinete sviluppa in un oocisti. Una volta che il oocisti matura, migliaia di sporozoiti (la progenie della croce) sono prodotti ed emessi in hemoceal zanzara. Sporozoiti vengono raccolte dalle ghiandole salivari e iniettato in un nuovo ospite murino, dove lo sviluppo fase pre-eritrocitaria e eritrocitaria avviene. Forme eritrocitaria sono clonati e classificati in relazione ai caratteri distintivi delle linee parentali prima mappatura linkage genetico. Infezioni controllo dei singoli cloni dei genitori vengono eseguite nello stesso modo come la produzione di un incrocio.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici di<em&gt; Plasmodium yoelii</em&gt; Ed è applicabile ad altri parassiti della malaria roditori.

Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

protocol-for-production-genetic-cross-rodent-malaria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.1K Views.  National Institutes of Health. Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici di Plasmodium yoelii Ed è applicabile ad altri parassiti della malaria roditori.

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In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

Imaging in vivo del transgenico parassiti Leishmania in un host live

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocollo per la raccolta e la colorazione ematociti concentrati dal Mosquito febbre gialla Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocollo Chelex semplice per l&#39;estrazione del DNA da<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Genetic Manipulation in &lt;em&gt;&amp;Delta;ku80&lt;/em&gt; Strains for Functional Genomic Analysis of &lt;em&gt;Toxoplasma gondii&lt;/em&gt;

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

La manipolazione genetica in<em&gt; Δku80</em&gt; Ceppi per analisi genomica funzionale di<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.

Many experimental systems have been utilized to understand the mechanisms regulating T cell development and function in an immune response. Here a genetic approach using retroviral transduction is described, which is economic, time efficient, and most importantly, highly informative in identifying regulatory pathways.

Trasduzione retrovirale di cellule T helper come un approccio genetico per studiare meccanismi che controllano la loro differenziazione e funzione

Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents ...

A Simple Red Blood Cell Lysis Method for the Establishment of B Lymphoblastoid Cell Lines

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new method with a powerful and simple strategy for the establishment of B-LCLs, the red blood cell lysis method. This method simplified the PBMC separation procedure with red blood cell removal, and used as little as 0.5 mL of whole blood for establishing EBV-immortalized cell lines, which can proliferate to large cell numbers in a relatively short amount time with a 100% success rate. The method is simple, reliable, time saving, and applicable to treating a large number of the clinical samples.

A simple red blood cell lysis method for establishing B-LCLs was developed with high immortalization efficiency, requiring a small amount of blood and saving time from initiation to cryopreservation.

Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l&#39;istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

A number of methods exist for the transformation of B lymphocytes by the Epstein Barr virus in vitro into immortalized cell lines. We have developed a new ...

Phenotypic Analysis of Rodent Malaria Parasite Asexual and Sexual Blood Stages and Mosquito Stages

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. However, effective malaria parasite targets for vaccine and chemotherapy development are still limited. This is largely due to the unavailability of relevant and practical in vivo infection models for human Plasmodium species, most notably for P.&#160;falciparum and P. vivax. Therefore, rodent malaria species have been extensively used as practical alternative in vivo models for malaria vaccine, drug targeting, immune response, and functional characterization studies of conserved Plasmodiumspp. genes. Indeed, rodent malaria models have proven to be invaluable, especially for exploring mosquito transmission and liver stage biology, and were indispensable for immunological studies. However, there are discrepancies in the methods used to evaluate the phenotypes of transgenic and wild-type asexual and sexual blood-stage parasites.&#160;Examples of these discrepancies are the choice of an intravenous vs. intraperitoneal infection of rodents with blood-stage parasites and the evaluation of male gamete exflagellation. Herein, we detail standardized experimental methods to evaluate the phenotypes of asexual and sexual blood stages in transgenic parasites expressing reporter-gene or wild-type rodent malaria parasite species. We also detail the methods to evaluate the phenotypes of malaria parasite mosquito stages (gametes, ookinetes, oocysts, and sporozoites) inside Anopheles mosquito vectors. These methods are detailed and simplified here for the lethal and non-lethal strains of P. berghei and P. yoelii but can also be applied with some adjustments to P. chabaudi and P. vinckei rodent malaria species.

Due to the striking similarities of the life cycle and biology of rodent malaria parasites to human malaria parasites, rodent malaria models have become indispensable for malaria research. Herein, we standardized some of the most important techniques used in the phenotypic analysis of wild-type and transgenic rodent malaria species.

Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

Recent advances in genetics and systems biology technologies have promoted our understanding of the biology of malaria parasites on the molecular level. ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate hosts, respectively. While pathogenic symptoms of leishmaniasis can vary widely, from benign cutaneous lesions to highly fatal visceral disease forms depending on the infective species, all Leishmania species reside inside host macrophages during the vertebrate stage of their lifecycle. Leishmania infectivity is therefore directly related to its ability to invade, survive and replicate within parasitophorous vacuoles (PVs) inside macrophages. Thus, assessing the parasite&#39;s ability to replicate intracellularly serves as a dependable method for determining virulence. Studying leishmaniasis development using animal models is time-consuming, tedious and often difficult, particularly with the pathogenically important visceral forms. We describe here a methodology to follow the intracellular development of Leishmania in bone marrow-derived macrophages (BMMs). Intracellular parasite numbers are determined at 24 h intervals for 72 - 96 h following infection. This method allows for a reliable determination of the effects of various genetic factors on Leishmania virulence. As an example, we show how a single allele deletion of the Leishmania Mitochondrial Iron Transporter gene (LMIT1) impairs the ability of the Leishmania amazonensis mutant strain LMIT1/&#916;Lmit1 to grow inside BMMs, reflecting a drastic reduction in virulence compared to wild-type. This assay also allows precise control of experimental conditions, which can be individually manipulated to analyze the influence of various factors (nutrients, reactive oxygen species, etc.) on the host-pathogen interaction. Therefore, the appropriate execution and quantification of BMM infection studies provide a non-invasive, rapid, economical, safe and reliable alternative to conventional animal model studies.

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

All pathogenic Leishmania species reside and replicate inside macrophages of their vertebrate hosts. Here, we present a protocol to infect murine bone marrow-derived macrophages in culture with Leishmania, followed by precise quantification of intracellular growth kinetics. This method is useful for studying individual factors influencing host-pathogen interaction and Leishmania virulence.

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...