Gli autori vorrebbero riconoscere il sostegno da parte del &quot;Animalerie Centrale de Gif-sur-Yvette&quot; per la zootecnia. Questo lavoro è stato sostenuto da fondi da ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 e ANR-11-JSV2-002-01) a Michael Schubert, dalla sovvenzione dell&#39;Unione Europea FP6 &quot;Embryomics&quot; e dalla concessione ANR &quot;ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process &quot;di Jean-François Nicolas e Nadine Peyrieras. João Emanuel Carvalho è finanziato da una borsa di studio di dottorato FCT (SFRH / BD / 86878/2012). Le richieste di vettori qui descritte possono essere indirizzate direttamente agli autori.

1. Preparazione di strumenti e reagenti <ol style="margin-left: 40px;"><li> Trasferimento pipette Pasteur <ol><li> Generare una serie di pipette Pasteur transfer con diversi diametri di punta tirando 230 millimetri lunghi pipette Pasteur sopra una fiamma a velocità diverse. Assicurarsi che il cono è più a lungo possibile per un controllo più fini di aspirazione. </li><li> Con un scrivano diamante, graffiare la pipetta lungo una linea perpendicolare alla lunghezza della pipetta. Con entrambe le mani estrarre la pipetta parallelamente alla sua lunghezza per generare un taglio smussato. Rapidamente fiamma lucidare la pipetta senza incollarsi la punta. </li><li> Variare il diametro della punta con la fase degli ovociti / embrioni essere pipettati: 300-400 micron per ovociti non fecondati (circa 150 micron di diametro), 600 micron per le uova fecondate (circa 500 micron di diametro), 200-400 micron per neurulae tratteggiata. Utilizzare pipette con un tubo di aspirazione bocca monitorati per trasferire ovociti / embrioni da un piattoall&#39;altro. </li></ol></li><li> Gli aghi da iniezione <ol><li> Manipolare i capillari con i guanti per garantire condizioni di assenza di RNasi. Utilizzare vetro borosilicato capillari filamento con dimensioni di 1,20 millimetri OD, ID 0,94 millimetri, lunghezza 10 mm. </li><li> Se capillari sono tirati al tipo di riscaldamento-filamento ago estrattore descritto nella lista dei materiali, utilizzare le seguenti impostazioni: Heat 600, Pull 50, Velocity 80, Tempo 60, pressione 200 o 300. In caso contrario, assicurarsi che la forma, che è cruciale per iniezioni successo, è come mostrato in figura 2 con le seguenti proprietà: 4-8 micron di diametro punta esterna 2 cm lunghezza del cono. NOTA: aghi può essere tirato prima che la stagione riproduttiva e usato per tutta la stagione. </li></ol></li><li> Soluzione di fenolo Rosso stock 5% (4x) <ol><li> Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva. </li><li> In un tubo micron filtrazione 0.22, pesare 25 mg di fenolo polvere rossa. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di DNase- e RNase-free acquala provetta contenente la polvere. </li><li> Spin per 3-5 min a 18.000 xg a temperatura ambiente per filtrare sterilizzare la soluzione e rimuovere i cristalli che potrebbero ostruire l&#39;ago di iniezione. </li><li> Conservare a 4 ° C o memorizzare 250 microlitri aliquote a -20 ° C. </li></ol></li><li> 0,25 mg soluzione di poli-lisina / ml <ol><li> Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva. </li><li> Disciogliere 5 mg di poli-L-lisina in 20 ml di acqua distillata. Conservare 5 ml aliquote a -20 ° C. </li><li> Utilizzare un&#39;aliquota scongelati immediatamente e solo una volta per assicurare l&#39;adesione riproducibili e robusto degli ovociti al piatto poli-lisina rivestite. </li></ol></li><li> sintesi di mRNA <ol><li> Preparare fresco prima di ogni stagione riproduttiva. </li><li> Linearizza 5 pg di DNA di interesse con l&#39;enzima adeguata (di solito per 2 ore, a 37 ° C). Per controllare la completezza della digestione, eseguire 2% in volume della miscela di digestione su un 1% agarosio-TBE gel in tampone TBE a 150 W per 20 min. </li><li> Estrarre la lineaDNA rized con 25: 24: 1 fenolo (pH 8.0): cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa (superiore). </li><li> Estrarre la fase acquosa nuovo con 24: 1 di cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa. </li><li> Precipitare il DNA linearizzato con 100: 10: 300 DNA linearizzato: 3 M acetato di sodio (pH 5.2): 100% di etanolo per una notte a -20 ° C. </li><li> Centrifugare 20 min a 18.000 xga 4 ° C. Sciacquare in 70% di etanolo. </li><li> Centrifugare 10 min a 18.000 xga 4 ° C. Lasciate asciugare e risospendere in acqua RNase-free ad una concentrazione finale di 0,5 mg / mL. </li><li> Trascrivere 1 mg di DNA linearizzato utilizzando un kit di sintesi di mRNA con la polimerasi del caso, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Estrarre il mRNA con 5: 1 fenolo (pH 4,7): soluzione di arresto cloroformio e acetato di ammonio fornito con il kit. </li><li> Vortex per 20 secondi, centrifuge 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa. </li><li> Estrarre la fase acquosa nuovo con 24: 1 di cloroformio: alcool isoamilico. Vortex per 20 sec, centrifugare 10 min a 18.000 xg e raccogliere la fase acquosa. </li><li> Precipitare il mRNA con 100% di isopropanolo notte a -20 ° C. </li><li> Centrifugare 20 min a 18.000 xga 4 ° C. Risciacquare in 80% di etanolo. </li><li> Centrifugare 10 min a 18.000 xga 4 ° C. Lasciare pellet asciugare a temperatura ambiente per non più di 5-10 min come sarà poi difficile risospendere. Risospendere in DNase- e acqua RNase-free per una concentrazione finale di almeno 2 mg / mL per assicurare un dignitoso concentrazione mRNA finale nel mix di iniezione. </li><li> Per controllare la qualità e le dimensioni del prodotto di trascrizione, eseguire 0,5 ml di mRNA su un 1% agarosio-TBE gel senza RNasi in tampone TBE a 150 W per 20 min. Negozio 2 aliquote microlitri a -80 ° C. </li></ol></li><li> Piatti Poly-lisina rivestite NOTA: Poly-lisina coapiatti ted sono utilizzati per immobilizzare gli oociti durante l&#39;iniezione. <ol><li> Per ciascuna piastra di Petri coltura cellulare 35 mm (5 in totale), coprire il fondo del piatto Petri con 1 ml della / soluzione di poli-lisina ml 0,25 mg scongelati. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Per ogni piatto Petri coltura cellulare 35 mm (5 in totale), trasferire la soluzione 0,25 mg / ml di poli-lisina in un&#39;altra cella-cultura piastra di Petri da 35 mm. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Eliminare il / soluzione poli-lisina ml 0,25 mg. </li><li> Lasciare le piastre di Petri a secco, capovolto a temperatura ambiente per 2 ore. </li><li> Memorizzare i piatti poli-lisina rivestite avvolto in un involucro di plastica a 4 ° C per evitare la contaminazione per una settimana massimo. </li></ol></li><li> Piatti agarosio rivestite NOTA: Sono usati per cultura iniettato embrioni. L&#39;agarosio fornisce un ammortizzatore per gli embrioni iniettati e impedisce loro di attaccarsi al fondo del piatto. <ol><li> Fare acqua di mare artificiale (ASW) con 37-38 g / L commsali erciali + 0,25 NaHCO mm 3 in acqua ad osmosi inversa. </li><li> Sciogliere agarosio ad una concentrazione 1% in 0,22 micron ASW filtrata riscaldando la soluzione in un forno a microonde. </li><li> Rapidamente versare la soluzione di agarosio calda da una piastra da 35 mm Petri in un altro per assicurare un rivestimento molto sottile agarosio del piatto. </li><li> Conservare i piatti agarosio rivestite avvolto in Saran avvolgono a 4 ° C per evitare la contaminazione per una settimana massimo. </li></ol></li><li> Mix iniezione e caricamento degli aghi di iniezione <ol><li> Circa 2 ore prima di iniziare le iniezioni, fare un mix di iniezione 2 ml in RNase e acqua priva di DNase con concentrazioni finali di 1-1,8 mg / mL di mRNA, 15% glicerolo, 1,25% rosso fenolo. NOTA: I colori rosso fenolo della soluzione, che consente il monitoraggio dell&#39;efficienza di iniezione e l&#39;identificazione degli embrioni iniettati con successo. Glicerolo favorisce mRNA diffusione all&#39;interno dell&#39;ovocita. </li><li> Centrifugare 4 minuti a 18.000 xg percristalli pellet. Tenere in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Con una pipetta 10 microlitri, raccogliere 0,5 microlitri della miscela di iniezione, evitando il fondo del tubo, dove sono stati pellettato i cristalli. </li><li> Backfill almeno due aghi da iniezione (in caso si rompe durante l&#39;iniezione) pipettando il calo di 0,5 ml di miscela di iniezione alla grande apertura dell&#39;ago. </li><li> Installare gli aghi in un barattolo di archiviazione con liquido nella parte inferiore a 4 ° C per evitare l&#39;evaporazione della miscela di iniezione. Che il mix iniezione lentamente viaggiare alla punta dell&#39;ago di iniezione per almeno 1 ora per minimizzare la formazione di bolle. </li><li> Conservare mix iniezione aggiuntiva a -80 ° C per un massimo di tre altri usi, dopo di che la qualità mRNA deteriora (dati non mostrati). </li></ol></li></ol> 2. Raccolta di materiale biologico, microiniezione e Cultura Embrione <ol style="margin-left: 40px;"><li> Ovociti e spermatozoi collezione NOTA: Vedere Theodosiouet al. 12 per un protocollo dettagliato per indurre la deposizione delle uova e per la raccolta dei gameti. <ol><li> Shock maschi e femmine in ASW a 23 ° C per 24 ore. </li><li> Una o due ore prima del tramonto, trasferire il numero di adulti in singoli tazze in ASW a 19 ° C, perché la maggior parte degli adulti si riproducono 1-2 ore dopo il tramonto. </li><li> Risciacquare 35 millimetri piatti Petri in ASW filtrato e lasciarli asciugare capovolto per evitare gli ovociti di attaccarsi al fondo del piatto. </li><li> Dopo la deposizione delle uova, raccogliere immediatamente spermatozoi e ovociti con una pipetta 1000 ml. <ol><li> Tenere spermatozoi e ovociti separato da anfiosso adulti perché il contatto è dannoso per la salute dei gameti (dati non riportati). </li><li> Inoltre, evitare di sorprendente adulti, che porta a movimenti che dissipano, e quindi diluite, sia spermatozoi e ovociti. Per mantenere lo sperma attiva più a lungo possibile e ottimizzare tasso di fecondazione, raccogliere lo sperma come concentrato possibile. </li></ol></li><li> Manteneresperma su ghiaccio in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Trasferimento ovociti in filtrato ASW nelle 35 millimetri piatti pre-risciacquato Petri. </li><li> Trasferimento 100-500 ovociti con una già tirato 300-400 micron trasferimento pipetta Pasteur a un altro 35 millimetri piastra di Petri per eseguire le iniezioni. </li><li> Fertilizzare il resto della frizione come controllo per gli spermatozoi e qualità ovocita o per altri esperimenti. </li></ol></li><li> Iniezione di ovociti <ol><li> Installare l&#39;ago di iniezione sulla micromanipolatore a 50 ° rispetto al piano orizzontale. NOTA: Angoli di meno di 50 ° spingeranno gli ovociti in tutto sul piatto, mentre gli angoli superiori a 50 °, non potrà esercitare un controllo adeguato della posizione dell&#39;ago rispetto al ovocita. </li><li> Sotto un ambito dissezione fluorescente con 25X oculari, trasferire 30 ovociti con il 300-400 micron trasferimento pipetta Pasteur su un piatto poli-lisina rivestite contenenti filtrata ASW. </li><li> Depositare gli ovociti lungo una linea per trasportarefuori iniezioni in modo ordinato e per distinguere iniettati da ovociti non iniettato. Iniettare piccoli numeri (30 ovociti) per minimizzare il tempo di esposizione di ovociti a poli-lisina, che tende a deformare embrioni di sviluppo (dati non mostrati). </li><li> Utilizzare l&#39;illuminazione campo scuro per rendere gli ovociti quanto traslucido possibile. </li><li> Con la manopola movimento grossolano del micromanipolatore, portare l&#39;ago per l&#39;iniezione vicino a un ovocita. </li><li> Con una pinza sottile, tagliare aprire l&#39;ago al livello in cui la punta comincia ad essere curvato. Con pulsante con l&#39;iniettore, verificare che mix iniezione rosso è effettivamente defluisce dell&#39;ago. </li><li> A 200 ingrandimenti e con la manopola movimento fine del micromanipolatore, spostare delicatamente l&#39;ago di iniezione all&#39;interno del nucleo dell&#39;ovocita. NOTA: Se è inserito troppo superficialmente, la soluzione iniettata non rimarrà all&#39;interno dell&#39;ovocita. Se inserita troppo lontano, l&#39;ovocita sarà distrutto. </li><li> Iniettare con 1-3 impulsi di 120 msec DURATion e 1-10 pressione psi. Se l&#39;ago è abbastanza bene, iniettare con flusso continuo a pressione costante. Assicurarsi che il volume di iniezione corrisponde a 1/5 a 1/3 del volume di un singolo ovocita. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, estrarre l&#39;ago rapidamente per evitare perdite dell&#39;ovocita. </li><li> Verificare che la soluzione iniettata rimane all&#39;interno dell&#39;ovocita e che dopo un paio di secondi, la soluzione iniettata si diffonde in tutto l&#39;ovocita. </li><li> Passare al prossimo ovocita in linea. </li><li> Mantenere alcuni embrioni uninjected di ogni serie come controllo negativo per stimare la fluorescenza di fondo durante la scansione per gli embrioni iniettati. </li></ol></li><li> Fecondazione, selezione degli embrioni iniettati e della cultura degli embrioni <ol><li> Fertilizzare gli ovociti non appena una serie è stata iniettata. Come qualità ovocitaria diminuisce con il tempo, l&#39;iniezione e fecondare ovociti entro 1 ora dopo la deposizione delle uova 12. </li><li> A seconda della concentrazione degli spermatozoi, aggiungere 1-5 gocce di sperma di ovociti eagitare il piatto. NOTA: La busta concimazione dovrebbe risulteranno sulle embrioni dopo circa 1 min. </li><li> Lasciare gli embrioni di staccarsi dal piatto poli-lisina rivestite, mentre l&#39;iniezione di un&#39;altra serie di ovociti. </li><li> Trasferire gli embrioni con il micron trasferimento pipetta Pasteur 600 in una piastra di Petri agarosio rivestite. Rimuovere gli embrioni dal piatto poli-lisina rivestite appena possibile, se possibile prima della fase 2 cellule. NOTA: In caso di prolungata esposizione al poli-lisina, gli embrioni tendono a diventare blastulae densamente imballato, appiattita sul lato toccare il fondo del piatto. </li><li> Al 2-cell a 4 celle stage, selezionate con un ambito dissezione fluorescenza con filtro DSR embrioni successo-iniettati, vale a dire, quelli con una morfologia normale che presentano un segnale rosso fluorescente rosso fenolo-derivato. </li><li> Mantenere gli embrioni in cultura in filtrato ASW in piastre di Petri agarosio rivestite a 19 ° C fino allo stadio desiderato perimaging in vivo. </li></ol></li></ol>

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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+retinoic+acid-Hox+hierarchy+controls+both+anterior/posterior+patterning+and+neuronal+specification+in+the+developing+central+nervous+system+of+the+cephalochordate+amphioxus.">A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus.</a> Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).</li><li>Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+expression+of+FoxD+reporter+constructs+in+amphioxus+embryos.">Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos.</a> Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).</li><li>Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cis-regulation+of+the+amphioxus+engrailed+gene:+insights+into+evolution+of+a+muscle-specific+enhancer.">Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer.</a> Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).</li><li>Holland, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+amphioxus+genome+illuminates+vertebrate+origins+and+cephalochordate+biology.">The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology.</a> Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).</li><li>Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposition+of+the+vertebrate+Tol2+transposable+element+in+Drosophila+melanogaster.">Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster.</a> Gene. 425, 64-68 (2008).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+at+specific+genomic+loci+of+amphioxus+Branchiostoma+belcheri+using+TALEN+method.">Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method.</a> J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).</li><li>Zhang, Q. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+culture+of+two+lancelets+and+production+of+the+second+filial+generations+in+the+laboratory.">Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory.</a> J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).</li><li>Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+aquaculture+of+the+Japanese+lancelet+Branchiostoma+japonicum+for+7+years.">Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years.</a> J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).</li><li>Benito-Guti&#233;rrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+generating+year-round+access+to+amphioxus+in+the+laboratory.">Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory.</a> PLoS One. 8, e71599 (1371).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

In questo articolo, presentiamo, per la prima volta, un protocollo dettagliato e riproducibile per l&#39;iniezione di B. ovociti lanceolatum, che, dopo il B. floridae 13,14 e B. belcheri 15, è quindi la terza specie anfiosso, per cui tale tecnica è stata descritta. È importante sottolineare che il protocollo qui descritto comprende inoltre la descrizione di sistemi vettore adatto per la produzione di proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum da mR...

Durante lo sviluppo, una singola cellula dà origine ad un intero organismo in un processo altamente complesso che coinvolge entrambi divisioni e movimenti delle cellule. Per comprendere meglio i principi biologici alla base delle dinamiche del comportamento delle cellule, i biologi dello sviluppo hanno iniziato ad utilizzare in tecniche di imaging in vivo basato sulla fluorescenza. Compartimenti specifici di cellule, come le membrane cellulari, possono sia essere etichettati da trattamenti con coloranti fluorescenti, un approccio ostacolato dalla mancanza di specificità e di penetrazione del tessuto 1, o dall&#39;introduzione specifica negli embrioni di mRNA esogeni codificanti proteine ​​fluorescenti 2. Diverse tecniche possono essere utilizzate per l&#39;erogazione efficace dei composti esogeni, quali mRNA. Questi includono, ma non sono limitati a, microiniezione, elettroporazione, bombardamenti con microparticelle, lipofezione e trasduzione 3,4. Sebbene tutti questi approcci possono essere utilizzati per introdurre composti esogeni in unsviluppo dell&#39;embrione, solo microiniezione consente l&#39;applicazione di quantità predefinite e precisi in ogni cella 3. Tecniche di microiniezione sono stati descritti per tutti i principali sistemi di modelli di sviluppo 4 (ad esempio, i moscerini della frutta, vermi nematodi, zebrafish, rane, topi), oltre che per alcuni modelli alternativi di 4, compresi quelli utilizzati per gli studi comparativi volti a comprendere l&#39;evoluzione dei meccanismi di sviluppo (ad esempio, anemoni di mare, vermi anellidi, ricci di mare, tunicati ascidie, l&#39;anfiosso Cephalochordata). Cephalochordates, che insieme con i tunicati e vertebrati stabiliscono il phylum cordati, particolarmente modelli adatto per studiare l&#39;evoluzione dei Cordati e la diversificazione dei vertebrati da un antenato invertebrato 5-8. Il lignaggio Cephalochordata discostato molto presto durante l&#39;evoluzione dei cordati; e cephalochordates esistenti, che si suddividono in tre generi (Branchiostoma, Asymmetron e Epigonichthys), assomigliano vertebrati sia in termini di anatomia generale e l&#39;architettura del genoma 5-8. Delle circa 30 specie di cephalochordates che sono stati descritti finora, cinque sono disponibili per gli studi embriologici e sviluppo 6,9: Asymmetron lucayanum (il lancelet Bahama), Branchiostoma floridae (l&#39;anfiosso Florida), Branchiostoma lanceolatum (l&#39;anfiosso europeo), Branchiostoma belcheri (l&#39;anfiosso cinese) e Branchiostoma japonicum (l&#39;anfiosso giapponese). Adulti maturi di tre di queste specie (B. lanceolatum, B. belcheri e B. japonicum) possono essere indotti a deporre le uova su richiesta durante la stagione riproduttiva 10,11. Inoltre, almeno per B. lanceolatum, la deposizione delle uova efficiente può anche essere indotta in acqua di mare artificiale 12, rendendo in tal modo questa particolare specie Cephalochordata accessibile per laboratorIES che non hanno accesso ad acqua di mare naturale. La combinazione, in B. lanceolatum, di un accesso comodo e affidabile per gli embrioni con un metodo di consegna efficiente, come ad esempio la microiniezione, finora l&#39;unica tecnica di consegna sviluppata in anfiosso (sia in B. floridae e B. belcheri) 13-15, consentirà lo sviluppo di un romanzo suite di tecniche manipolative, tra cui lignaggio tracing- e approcci basati sul comportamento di cellule dinamica. Un protocollo per la microiniezione di mRNA efficace per esprimere le proteine ​​fluorescenti in B. lanceolatum embrione è stato sviluppato di conseguenza. Inoltre, per fornire un kit di strumenti di base per l&#39;imaging dal vivo di B. embrioni lanceolatum, sistemi di vettori sono stati sviluppati che permettono associata alla membrana ed espressione nucleare di proteine ​​fluorescenti. Per membrane targeting, maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) è stato fuso con la casella CAAX umana HRAS e localizzazione nucleare di mCherry e eGFP eraottenute per fusione alla esone zebrafish istone 2B (H2B) (Figura 1, File supplementare 1). Inoltre, con lo scopo di ottimizzare la traduzione della proteina, le sequenze Kozak e codoni dei costrutti sono stati modificati e adattati all&#39;uso in B. lanceolatum. Nel loro insieme, il metodo di iniezione e di espressione vettori qui presentati serviranno da base per la generazione di nuovi approcci sperimentali per cephalochordates, in particolare analisi utilizzando la più recente a fluorescenza a base di tecniche di imaging in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1009">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:156px;">Company</td>
			<td style="width:143px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:413px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Consumables</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td>culture-treated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Filtration unit (Stericup 1L)</td>
			<td style="width:156px;">Fisher</td>
			<td style="width:143px;">W21719</td>
			<td>0.22 micron filtration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Spin-X tubes</td>
			<td style="width:156px;">Costar</td>
			<td style="width:143px;">8160</td>
			<td>0.22 micron filtration tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries</td>
			<td style="width:156px;">WPI</td>
			<td style="width:143px;">E212</td>
			<td style="width:413px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Pasteur Pipettes</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>230 mm long</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Aspiration tube</td>
			<td style="width:156px;">Dutscher</td>
			<td style="width:143px;">75056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Capillaries for injection needles</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">BF 120-94-10</td>
			<td>Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reagents</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Low-melting agarose</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">A9414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol Red</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">114537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Glycerol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">G2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Poly-L-Lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">H2O Dnase, Rnase-free</td>
			<td style="width:156px;">Gibco</td>
			<td style="width:143px;">10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">mMessage mMachine SP6 Transcription kit</td>
			<td style="width:156px;">Ambion</td>
			<td style="width:143px;">AM1340</td>
			<td>mRNA synthesis kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phenol pH8</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">24:1 chloroform:isoamylic alcohol</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">C0549</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">5:1 phenol pH4.7:chloroform</td>
			<td style="width:156px;">SIGMA</td>
			<td style="width:143px;">P1944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Reef Crystal salts (200 kg)</td>
			<td style="width:156px;">Europrix&#160;</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>Commercial salts</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Equipment</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:297px;">Fluorescent dissecting scope with 200x magnification&#160;</td>
			<td style="width:156px;">Leica</td>
			<td style="width:143px;">MZ16F</td>
			<td>25x oculars, DSR and GFP2 filters</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:156px;">Marzhauzer</td>
			<td style="width:143px;">M-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Injector</td>
			<td style="width:156px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:143px;">model II or III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Needle puller</td>
			<td style="width:156px;">Sutter</td>
			<td style="width:143px;">P97</td>
			<td>heating-filament needle puller</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:297px;">Fine forceps</td>
			<td>FINE SCIENCE TOOLS GMBH</td>
			<td>11252-30</td>
			<td>Dumont #5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression of fluorescent proteins in branchiostoma lanceolatum by mrna injection into unfertilized oocytes

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.

Il protocollo descritto sopra fornisce la base per la microiniezione di B. ovociti lanceolatum e quindi per l&#39;introduzione nella sviluppare B. embrioni lanceolatum di mRNA che codificano proteine ​​fluorescenti per l&#39;imaging in vivo. Sebbene la tecnica è certamente robusto ed affidabile, il tasso di successo di iniezioni utilizzando questo protocollo rimane variabile (Tabella 1). La spiegazione molto probabile per questo fatto interessante è l&#...

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Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

Riportiamo qui l&#39;espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l&#39;iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici.

L&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti in<em&gt; Branchiostoma lanceolatum</em&gt; By mRNA iniezione in ovociti non fecondate

We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Expression of Fluorescent Proteins in Branchiostoma lanceolatum by mRNA Injection into Unfertilized Oocytes

10.9K Views.  Institut Pasteur.  Riportiamo qui l'espressione robusto ed efficiente di proteine ​​fluorescenti dopo l'iniezione di mRNA in oociti fecondati di Branchiostoma lanceolatum. Lo sviluppo della tecnica microiniezione in questo chordate basale aprirà la strada di una profonda innovazioni tecniche in questo sistema modello emergente, tra cui imaging in vivo e manipolazioni gene-specifici. 

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Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

Manipolazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Maturazione di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; ovociti, seguito da Iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi, per studiare lo sviluppo embrionale

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced skeletal muscle regeneration is a widely used, powerful model system to study the events involved in muscle regeneration as well as the mechanisms and different players. Indeed, a detailed knowledge of this process is essential for a better understanding of the pathological conditions that lead to skeletal muscle degeneration, and it aids in identifying new targeted therapeutic strategies. The present work describes a detailed and reproducible protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in mice through a single intramuscular injection of cardiotoxin (CTX). CTX belongs to the family of snake venom toxins and causes myolysis of myofibers, which eventually triggers the regeneration events. The dynamics of skeletal muscle regeneration is evaluated by histological analysis of muscle sections. The protocol also illustrates the experimental procedures for dissecting, freezing, and cutting the Tibialis Anterior muscle, as well as the routine Hematoxylin &#38; Eosin staining that is widely used for subsequent morphological and morphometric analysis.

This manuscript describes a detailed protocol to induce acute skeletal muscle regeneration in adult mice and subsequent manipulations of the muscles, such as dissection, freezing, cutting, routine staining, and myofiber cross-sectional area analysis.

Induzione di acuta muscolo scheletrico Rigenerazione da cardiotossina Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

The advent of 3D in vitro organoids that mimic the in vivo tissue architecture and morphogenesis has greatly advanced the ability to study key biological questions in cell and developmental biology. In addition, organoids together with recent technical advances in gene editing and viral gene delivery promises to advance medical research and development of new drugs for treatment of diseases. Organoids grown in vitro in basement matrix provide powerful model systems for studying the behavior and function of various proteins and are well suited for live-imaging of fluorescent-tagged proteins. However, establishing the expression and localization of the endogenous proteins in ex vivo tissue and in in vitro organoids is important to verify the behavior of the tagged proteins. To this end we have developed and modified tissue isolation, fixation, and immuno-labeling protocols for localization of microtubules, centrosomal, and associated proteins in ex vivo intestinal tissue and in in vitro intestinal organoids. The aim was for the fixative to preserve the 3D architecture of the organoids/tissue while also preserving antibody antigenicity and enabling good penetration and clearance of fixative and antibodies. Exposure to cold depolymerizes all but stable microtubules and this was a key factor when modifying the various protocols. We found that increasing the ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) concentration from 3 mM to 30 mM gave efficient detachment of villi and crypts in the small intestine while 3 mM EDTA was sufficient for colonic crypts. The developed formaldehyde/methanol fixation protocol gave very good structural preservation while also preserving antigenicity for effective labeling of microtubules, actin, and the end-binding (EB) proteins. It also worked for the centrosomal protein ninein although the methanol protocol worked more consistently. We further established that fixation and immuno-labeling of microtubules and associated proteins could be achieved with organoids isolated from or remaining within the basement matrix.

Immuno-fluorescent Labeling of Microtubules and Centrosomal Proteins in Ex Vivo Intestinal Tissue and 3D In Vitro Intestinal Organoids

We present protocols for isolation of intestinal 3D structures from in vivo tissue and in vitro basement matrix embedded organoids, and detail different fixation and staining protocols optimized for immuno-labeling of microtubule, centrosomal, and junctional proteins as well as cell markers including the stem cell protein Lgr5.

Immuno-fluorescenza etichettatura dei microtubuli e proteine centrosomali in tessuto intestinale Ex Vivo e 3D In Vitro intestinale Organoids

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Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. The high transfection efficiency permits at least 4 distinct mRNAs to be co-transfected with ~87% efficiency. Most of the electroporated mRNAs are degraded during the first 2 h post-electroporation, permitting time-sensitive experiments to be carried out in the developing embryo. Finally, we describe how to dynamically image live embryos electroporated with mRNAs that encode various subcellular targeted fluorescent proteins.

We report messenger RNA (mRNA) electroporation as a method that permits fast and efficient expression of multiple proteins in the quail embryo model system. This method can be used to fluorescently label cells and record their in vivo movements by time-lapse microscopy shortly after electroporation.

Espressione rapida ed efficiente di più proteine negli embrioni aviari utilizzando l'elettroporazione dell'mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Hemogenic Reprogramming of Human Fibroblasts by Enforced Expression of Transcription Factors

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human HSC emergence in vitro are required to overcome limitations in studying this complex developmental process. Here, we describe a protocol to generate hematopoietic stem and progenitor-like cells from human dermal fibroblasts employing a direct cell reprogramming approach. These cells transit through a hemogenic intermediate cell-type, resembling the endothelial-to-hematopoietic transition (EHT) characteristic of HSC specification. Fibroblasts were reprogrammed to hemogenic cells via transduction with GATA2, GFI1B and FOS transcription factors. This combination of three factors induced morphological changes, expression of hemogenic and hematopoietic markers and dynamic EHT transcriptional programs. Reprogrammed cells generate hematopoietic progeny and repopulate immunodeficient mice for three months. This protocol can be adapted towards the mechanistic dissection of the human EHT process as exemplified here by defining GATA2 targets during the early phases of reprogramming. Thus, human hemogenic reprogramming provides a simple and tractable approach to identify novel markers and regulators of human HSC emergence. In the future, faithful induction of hemogenic fate in fibroblasts may lead to the generation of patient-specific HSCs for transplantation.

This protocol demonstrates the induction of a hemogenic program in human dermal fibroblasts by enforced expression of the transcription factors GATA2, GFI1B and FOS to generate hematopoietic stem and progenitor cells.

Riprogrammazione emogenica dei fibroblasti umani mediante l'espressione forzata dei fattori di trascrizione

The cellular and molecular mechanisms underlying specification of human hematopoietic stem cells (HSCs) remain elusive. Strategies to recapitulate human ...

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls are composed of cellulose and non-cellulosic polysaccharides together with proteins, phenolic compounds and water. 90% of the cell wall is composed of&#160;polysaccharides (e.g., pectins) and arabinogalactan proteins (AGPs). The fluorescent immunolocalization of specific glycan epitopes in plant histological sections remains a key tool to uncover remodeling of wall polysaccharide networks, structure and components.
Here, we report an optimized fluorescent immunolocalization procedure to detect glycan epitopes from AGPs and pectins in plant tissues. Paraformaldehyde/glutaraldehyde fixation was used along with LR-White embedding of the plant samples, allowing for a better preservation of the tissue structure and composition. Thin sections of the embedded samples obtained with an ultra-microtome were used for immunolocalization with specific antibodies. This technique offers great resolution, high specificity, and the chance to detect multiple glycan epitopes in the same sample. This technique allows subcellular localization of glycans and detects their level of accumulation in the cell wall. It also permits the determination of spatio-temporal patterns of AGP and pectin distribution during developmental processes. The use of this tool may ultimately guide research directions and link glycans to specific functions in plants. Furthermore, the information obtained can complement biochemical and gene expression studies.

This protocol describes in detail how the plant material for immunolocalization of Arabinogalactan proteins and pectins is fixed, embedded in a hydrophilic acrylic resin, sectioned and mounted on glass slides. We show cell wall related epitopes will be detected with specific antibodies.

Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

Vitrificazione del volume minimo degli ovociti felini immaturi

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of oocytes and surrounding follicular cells. It is vital to separate both follicular cells and oocytes for various research purposes such as for primary culture of follicular cells, analysis of gene expression, oocyte maturation and in vitro fertilization, etc. The conventional method uses forceps to separate both compartments, which is laborious, time consuming and has high damage to the oocyte. Here, we have established a simple method to separate both compartments using a pulled glass capillary. Under a stereomicroscope, oocytes and follicular cells can be easily separated by pipetting in a pulled fine glass capillary (the diameter depends on the follicle diameter). Compared with the conventional method, this new method has high efficiency in separating both oocytes and follicular cells and has low damage to the oocytes. More importantly, this method can be applied to early-stage follicles including at the pre-vitellogenesis stage. Thus, this simple method can be used to separate follicular cells and oocytes of zebrafish.

Here, we present a simple method for separating follicular cells and oocytes in zebrafish ovarian follicles, which will facilitate investigations of ovarian development in zebrafish.

Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give rise to aneuploidy occur during meiosis in oocytes, but why oocyte meiosis is error-prone is still not fully understood. During cell division, cells prevent errors in chromosome segregation by activating the spindle assembly checkpoint (SAC). This control mechanism relies on detecting kinetochore (KT)-microtubule (MT) attachments and sensing tension generated by spindle fibers. When KTs are unattached, the SAC is activated and prevents cell-cycle progression. The SAC is activated first by MPS1 kinase, which triggers the recruitment and formation of the mitotic checkpoint complex (MCC), composed of MAD1, MAD2, BUB3, and BUBR1. Then, the MCC diffuses into the cytoplasm and sequesters CDC20, an anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) activator. Once KTs become attached to microtubules and chromosomes are aligned at the metaphase plate, the SAC is silenced, CDC20 is released, and the APC/C is activated, triggering the degradation of Cyclin B and Securin, thereby allowing anaphase onset. Compared to somatic cells, the SAC in oocytes is not as effective because cells can undergo anaphase despite having unattached KTs. Understanding why the SAC is more permissive and if this permissiveness is one of the causes of chromosome segregation errors in oocytes still needs further investigation. The present protocol describes the three techniques to comprehensively evaluate SAC integrity in mouse oocytes. These techniques include using nocodazole to depolymerize MTs to evaluate the SAC response, tracking SAC silencing by following the kinetics of Securin destruction, and evaluating the recruitment of MAD2 to KTs by immunofluorescence. Together these techniques probe mechanisms needed to produce healthy eggs by providing a complete evaluation of SAC integrity.

Error in chromosome segregation is a common feature in oocytes. Therefore, studying the spindle assembly checkpoint gives important clues about the mechanisms needed to produce healthy eggs. The present protocol describes three complementary assays to evaluate spindle assembly checkpoint integrity in mouse oocytes.

Valutazione dell'integrità del checkpoint dell'assemblaggio del mandrino negli ovociti di topo

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

L'espressione di proteine ​​fluorescenti in

L'espressione di proteine fluorescenti in