Questo prodotto è ottimizzato per livellare le proteine con il tag della proteina di fluorescenza e per visualizzare la posizione e l'espressione della proteina di interessanti individui di laboratorio di zebrafish. È particolarmente utile per l'imaging di proteine espresse a bassa abbondanza. Il nostro metodo semplifica e accelera il processo di costruzione del donatore.
Questi componenti, ad eccezione del CDS, sono precedentemente incorporati nella dorsale. Anche il donatore è stato ottimizzato per aumentare l'efficienza. Il flusso di lavoro dello schermo di trasmissione accumula nuclei ereditabili al minor costo in termini di tempo e fatica.
Il pesce zebra è l'organismo modello ampiamente utilizzato nella ricerca sulle infezioni e sull'immunità. Siamo particolarmente interessati ai meccanismi alla base della sepsi. Dal momento che ora siamo in grado di eseguire facilmente l'etichettatura della fluorescenza utilizzando il nostro protocollo, cercheremo di etichettare un'immagine, le proteine della sepsi e le cellule nel pesce zebra.
Per iniziare, mettete una femmina sana di pesce zebra e due maschi sani di zebrafish in una vasca di accoppiamento. Usa un divisore per separare i maschi dalle femmine per prepararli all'accoppiamento. Il giorno della microiniezione, preparare la miscela per microiniezione con ghiaccio in un ambiente privo di RNasi.
Utilizzando un puntale per pipetta privo di RNASI, caricare la soluzione per microiniezione nell'ago. Posizionare l'ago caricato in un micro manipolatore collegato a un micro iniettore. Al microscopio, usa una pinzetta appuntita per tagliare la punta dell'ago pizzicandolo delicatamente fino a quando non si rompe.
Regolare la pressione di iniezione fino a quando l'ago espelle costantemente una gocciolina di un nanolitro. Quindi, rimuovi il divisore dalla vasca di accoppiamento e lascia che i pesci si riproducano per sei minuti. Raccogli e trasferisci gli embrioni in una capsula di Petri contenente un tampone embrionale.
Esamina la salute degli embrioni al microscopio ottico e rimuovi gli ovuli o i detriti non fecondati. Mettere da parte 20 embrioni sani in una capsula di Petri separata come controlli non iniettati ed etichettare la capsula. Usando un piccolo pennellino, trasferisci e allinea delicatamente gli embrioni sani allo stadio di una cellula sulle scanalature di una piastra per microiniezione riscaldata a temperatura ambiente.
Rimuovere il tampone in eccesso dalla piastra. Con l'aiuto della punta di un ago, regola delicatamente la posizione di ogni embrione in modo che l'asta dell'animale sia rivolta verso l'ago. Iniettare un nanolitro della soluzione miscelata nel palo animale.
Dopo l'iniezione, sciacquare delicatamente gli embrioni in una piastra a 6 pozzetti con tampone embrionale. Posizionare la piastra in un incubatore a temperatura costante di 28,5 gradi Celsius. A 10 ore dalla fecondazione, esaminare lo sviluppo embrionale al microscopio stereo e rimuovere gli embrioni morti.
A 24 ore dalla fecondazione, raccogli gli embrioni in provette da 1,5 millilitri per la genotipizzazione e getta con cura l'acqua in eccesso. Aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi contenente proteinasi K a ciascuna provetta. Incubare le provette a 56 gradi Celsius per un'ora, quindi a 95 gradi Celsius per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 200 microlitri di etanolo e mescolare bene. Centrifugare la provetta a 19.000 G per 10 minuti e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70%. Centrifugare nuovamente e asciugare il pellet all'aria prima di scioglierlo in 50 microlitri di acqua bidistillata.
Utilizzare un microlitro di estratto per preparare la miscela di reazione per la PCR. Dopo la PCR, eseguire gel di agarosio con due microlitri di prodotti PCR per confermare il successo dell'amplificazione. Eseguire la digestione enzimatica per valutare l'efficienza degli sgRNA.
Mescolare delicatamente la soluzione digestiva e incubarla a temperatura ambiente, seguendo le istruzioni del produttore. Esegui i gel di agarosio per i prodotti digeriti insieme ai controlli PCR non digeriti per confermare la digestione. Per analizzare l'efficienza dell'sgRNA, apri il sito Web TIDE e fai clic su Avvia TIDE.
Inserire la sequenza guida dell'sgRNA nel frame della sequenza guida. Fare clic su Sfoglia per caricare il risultato del sequenziamento del controllo wild type nel campo del cromatogramma del campione di controllo. Allo stesso modo, caricare il risultato del sequenziamento del campione modificato nel campo del cromatogramma del campione di prova.
Fare clic su Aggiorna vista per analizzare i risultati. Per iniziare, utilizzare la clonazione indipendente dalla legatura o LIC con esonucleasi III per costruire il plasmide donatore. Primer di progettazione F1 con una sequenza sovrapposta con l'elemento vettoriale 1 e parte dell'elemento 2.
Primer di progettazione R2 con una parte dell'elemento 1, dell'elemento 2 e dell'elemento 3. Progettare il primer F2 per includere gli elementi 3 e 4 e la sequenza 5 primi del CDS che segue il sito bersaglio dell'sgRNA. Primer di progettazione R1 con la sequenza di tre numeri primi della sequenza di rivestimento e una sequenza di sovrapposizione con il vettore.
Utilizzare il CDNA del pesce zebra come modello ed eseguire la PCR con i primer progettati. Purificare i prodotti PCR utilizzando la precipitazione dell'etanolo. Digerire il vettore donatore con enzimi di restrizione come pCI e Acc65I e purificare il vettore donatore digerito.
Quantificare i frammenti di PCR purificati e il vettore donatore digerito utilizzando l'elettroforesi su gel di DNA. Successivamente, preparare la miscela LIC con il vettore donatore purificato e incubare su ghiaccio per 60 minuti. Aggiungere un microlitro di EDTA 0,5 molari per fermare la reazione.
Pipettare su e giù per mescolare la soluzione. Incubare la miscela di reazione a 60 gradi Celsius per cinque minuti. Raffreddare i prodotti LIC con ghiaccio.
Quindi, trasformare le cellule competenti DH5-Alpha utilizzando prodotti LIC. Placcare le cellule trasformate su piastre Luria-Bertani contenenti l'ampicillina e farle crescere per 16 ore. Dopo l'incubazione, prelevare singole colonie dalle piastre LIC per l'analisi della digestione enzimatica e il sequenziamento del DNA.
Estrarre e purificare i plasmidi del donatore corretti con un kit di purificazione. Iniettare embrioni di zebrafish con una miscela di microiniezione per gene knockin'12 a 48 ore dopo la microiniezione, sotto un microscopio a stereofluorescenza, osservare la fluorescenza delle larve di zebrafish. Utilizzando un metodo di screening consolidato, seleziona le larve fluorescenti e allevarle separatamente.
A un mese di età, raccogli un pezzetto di pinna da ogni pesce zebra anestetizzato in una provetta PCR etichettata. Posizionare il pesce zebra anestetizzato corrispondente in una piastra a 6 pozzetti riempita con acqua filtrata sterilizzata con raggi UV, corrispondente all'etichetta sul tubo. Estrarre il DNA genomico utilizzando il metodo della lisi alcalina.
Progettare un primer in avanti a monte del braccio di omologia sinistro e un primer inverso sull'inserto. Eseguire la PCR, mirando alla giunzione cinque primi della sequenza. Esaminare gli embrioni F1 ottenuti accoppiando il pesce zebra F schermato con il pesce zebra wild type per i modelli di espressione GFP.
Genotipizzare gli embrioni F1 utilizzando la PCR a giunzione. La fluorescenza specifica ereditabile è stata osservata nei muscoli di tutta la progenie F1, indicando il successo della marcatura GFP del connettione 39.9. La fluorescenza specifica ereditabile è stata rilevata nel cristallino di tutta la progenie F2, suggerendo il successo dell'etichettatura mCherry del connettione 44.1.
Il corretto battito delle connessioni 39.9 e 44.1 è stato verificato attraverso reazioni a catena della polimerasi di giunzione.
