We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the &#8220;priority programmes&#8221; SPP1316 and SPP1617.

<ol>
	<li>Simpson, C. G., Brown, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primer+extension+assay.">Primer extension assay.</a> Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).</li><li>Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+labeled+oligonucleotide+extension:+a+rapid+and+quantitative+protocol+for+primer+extension.">Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension.</a> Biotechniques. 35, 90-94 (2003).</li><li>Schuster, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+mazEF+Toxin-Antitoxin+Homologue+from+Staphylococcus+equorum.">Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum.</a> J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).</li><li>Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+paralogous+yefM-yoeB+loci+from+Staphylococcus+equorum+encode+functional+toxin-antitoxin+systems.">Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems.</a> Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).</li><li>Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+in+bacteria+and+archaea.">Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea.</a> Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).</li><li>Schuster, C. F., Bertram, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+are+ubiquitous+and+versatile+modulators+of+prokaryotic+cell+fate.">Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate.</a> FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).</li><li>Goeders, N., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxin-antitoxin+systems+as+multilevel+interaction+systems.">Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems.</a> Toxins. 6, 304-324 (2014).</li><li>Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+interferases,+sequence-specific+endoribonucleases+from+the+toxin-antitoxin+systems.">mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems.</a> Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).</li><li>Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacillus+subtilis+MazF-bs+(EndoA)+is+a+UACAU-specific+mRNA+interferase.">Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase.</a> FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Staphylococcus+aureus+MazF+specifically+cleaves+a+pentad+sequence,+UACAU,+which+is+unusually+abundant+in+the+mRNA+for+pathogenic+adhesive+factor+SraP.">et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP.</a> J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA+interferases,+MazF-mt3+and+MazF-mt7+from+Mycobacterium+tuberculosis+target+unique+pentad+sequences+in+single-stranded+RNA.">The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA.</a> Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).</li><li>Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+MazFSa,+an+endoribonuclease+from+Staphylococcus+aureus.">Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus.</a> J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).</li><li>Marmur, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+procedure+for+the+isolation+of+deoxyribonucleic+acid+from+micro-organisms.">A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms.</a> J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).</li><li>Emory, S. A., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ompA+5'+untranslated+RNA+segment+functions+in+Escherichia+coli+as+a+growth-rate-regulated+mRNA+stabilizer+whose+activity+is+unrelated+to+translational+efficiency.">The ompA 5' untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency.</a> J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).</li><li>Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+promoters+for+the+ompA+gene+which+encodes+a+major+outer+membrane+protein+of+Escherichia+coli.">Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli.</a> Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).</li><li>Schleifer, K. H., Kilpper-B&#228;lz, R., Devriese, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+arlettae+sp.+nov.,+S.+equorum+sp.+nov.+and+S.+kloosii+sp.+nov.:+Three+New+Coagulase-Negative,+Novobiocin-Resistant+Species+from+Animals.">Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals.</a> Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .</li><li>Yu, H., Goodman, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+HIV-1+and+avian+myeloblastosis+virus+reverse+transcriptase+fidelity+on+RNA+and+DNA+templates.">Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates.</a> J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).</li><li>Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substitution+of+the+use+of+radioactivity+by+fluorescence+for+biochemical+studies+of+RNA.">Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA.</a> RNA. 13, 2042-2050 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose that would present a conflict of interest.

Primer extension fluorescente è un metodo semplice e rapido per determinare l&#39;estremità 5 &#39;di RNA, sia per TSP- o l&#39;identificazione di trasformazione secondaria dell&#39;RNA. Grazie all&#39;uso di primer fluorescenti, le reazioni possono essere impostati e gestiti senza misure di sicurezza supplementari (a differenza in caso di primer marcati radioattivamente). Poiché i campioni vengono rilevati mediante fluorescenza, possono essere esposte mentre l&#39;elettroforesi è in corso che consente l&#39;analisi...

Estensione Primer 1 è un metodo molecolare per determinare l&#39;estremità 5 &#39;di molecole di RNA specifici fino ad una risoluzione di una base. Il vantaggio di altri metodi come 5&#39;-RACE (amplificazione rapida delle estremità del cDNA) è il tempo di ritorno veloce e la capacità di analizzare facilmente una miscela di diverse lunghezze di molecole di RNA. Questo metodo funziona sottoponendo molecole di RNA per invertire le reazioni di trascrizione utilizzando primer fluorescenti specifiche, generando frammenti di cDNA di alcune lunghezze. Queste molecole di cDNA vengono eseguiti insieme reazioni di sequenziamento tradizionali Sanger 2 su gel di poliacrilammide denaturante e possono essere rilevate da loro fluorescenza a causa dell&#39;uso di primer fluorescente. Le lunghezze dei frammenti di cDNA vengono quindi valutati rispetto alla scala sequenziamento, consentendo la mappatura delle estremità 5 &#39;RNA. Tradizionalmente, le reazioni di estensione dei primer sono utilizzati in combinazionecon isotopi radioattivi per rilevare molecole di cDNA su film X-ray. A causa di rischi per la salute, problemi di smaltimento e maneggevolezza, protocolli più recenti utilizzano fluorescenza per la rilevazione del primer extension con sequenziatori automatici, benché la loro sensibilità è leggermente inferiore. Utilizzando primer fluorescente, la procedura di radio-marcatura ricorrenti può essere omesso, come primer fluorescenti sono stabili per un lungo periodo di tempo (più di un anno nelle nostre mani). Il metodo che descriviamo qui utilizza un sequenziatore automatizzato gel, ma con lievi modifiche, sequenziatori capillari può essere utilizzato anche per la separazione cDNA e rilevamento 3. Il parallelismo tra analisi del gel permette di rilevare anche una piccola quantità di RNA scissione o trasformazione. Un altro vantaggio è l&#39;alta risoluzione di questo metodo, come scissione o la trasformazione anche di una sola base del terminale può essere rilevato. Per quanto riguarda la rilevazione di RNA scissione o trasformazione, typically due diversi tipi di estensioni di primer si distinguono. In un caso, il trattamento enzimatico è fatto in vitro utilizzando RNA purificato e l&#39;enzima purificato, mentre nell&#39;altro caso, la lavorazione avviene in vivo e l&#39;RNA risultante viene purificato. In entrambi i casi l&#39;RNA viene sottoposto ad un primer extension effettuata in vitro, tuttavia, a seconda della fonte di RNA, il metodo o è chiamato un primer extension vivo o in vitro. Nel protocollo presentiamo, ci concentriamo esclusivamente sulla vivo primer extension in, a causa della facilità d&#39;uso (non proteine ​​purificate necessario) e la possibilità di determinare punti di partenza trascrizionali e trasformazione in una sola volta. Tuttavia, in vitro estensioni di primer sono in linea di principio configurare allo stesso modo e questo protocollo può servire come punto di partenza. Il metodo qui illustrato può essere applicato a molte specie batteriche purché siano suscettibili di altapurezza e alto rendimento preparazione di acidi nucleici. La ricerca nel nostro laboratorio si concentra sulla portata normativa di tossina-antitossina (TA) Sistemi di 4,5, un campo in cui è ampiamente utilizzato il metodo primer extension. TA-sistemi sono piccoli elementi genetici presenti nei genomi procariotici che consistono di una proteina tossica stabile e endogenamente attiva e una proteina o RNA antitossina lo più instabile che contrasta la tossicità 6,7. Attività di tossina è a volte esercitata da inibizione della replicazione, sintesi della parete cellulare o altri meccanismi, ma il più delle volte per attività RNasi 8,9. Tipicamente, RNasi specificità è determinata effettuando diverse prove, una delle quali è il metodo di primer extension. Reazioni primer extension sono adatti per questa applicazione, come miscela di frammenti di lunghezza clivati ​​e completi possono essere analizzati simultaneamente per determinare la loro 5 &#39;estremità. Utilizzando un mix di in vitro e in vivo estensioni di primer, laspecifica RNasi clivaggio tossina, ad esempio, specificità di sequenza può essere determinata 10-13. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1. Panoramica della procedura di primer extension. Le colture batteriche sono incubate e trattati in base alle esigenze sperimentali. L&#39;RNA totale viene estratto dalle cellule, trattate con DNasi I per rimuovere tracce di DNA e sottoposti ad una reazione di trascrizione inversa utilizzando bersaglio specifici primer di DNA fluorescenti rendimento cDNA. Il DNA genomico o plasmidi vengono estratti e successivamente utilizzati per fluorescenti reazioni di sequenziamento Sanger per il confronto dimensioni con i frammenti di cDNA. Prodotti primer extension vengono eseguiti insieme a prodotti di sequenziamento Sanger su un gel denaturante di poliacrilammide di urea e analizzati con un laser automatico e microscopio. La base sequenziamento che si allinea con la band cDNA è il lav base 5 &#39;del cDNA (freccia blu). Maggiori informazioni in Fekete, et al. 3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52134/52134fig1highres.jpg" target="_blank">Fate clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> Una panoramica di tutta la procedura di primer extension può essere trovato in Figura 1. In breve, le cellule batteriche vengono coltivate, raccolte, il pellet cellulare lisato e l&#39;RNA estratto. RNA purificato viene quindi trattato con DNasi I per rimuovere tracce di molecole di DNA che potrebbero agire come modelli per la trascrittasi inversa. Primer fluorescenti specifici sono aggiunti al RNA, ibridato alla regione di interesse e successivamente trascrizione inversa, con conseguente DNA a singolo filamento complementare (cDNA). Una scaletta sequenziamento è stato creato da sequenziamento Sanger tradizionale impiegando primer fluorescenti e separati su un gel di poliacrilammide denaturante a fianco del primer frammenti di estensione di cDNA. La risultantegel viene analizzato confrontando le bande fluorescenti, che permette l&#39;identificazione delle estremità 5 &#39;di interesse. Punti di partenza di trascrizione e siti di lavorazione sono poi valutato individualmente in sequenza comparazioni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1200">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;"><a name="RANGE!A1:D16">Name</a></td>
			<td style="width:196px;">Supplier</td>
			<td style="width:244px;">Catalog Number(s)</td>
			<td style="width:363px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/&#181;l)</td>
			<td style="width:196px;">NEB / Roche</td>
			<td style="width:244px;">NEB: M0277-T / Roche: 10109118001</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:21px;width:399px;">DNase I (RNase free)</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2222</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">FastPrep-24 Instrument&#160;</td>
			<td style="width:196px;">MPBio</td>
			<td align="right">116004500</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:399px;">Fluorescently labeled primers</td>
			<td style="width:196px;">Biomers</td>
			<td style="width:244px;">n/a</td>
			<td style="width:363px;">5&#8217; DY-681 modification of &#8220;ordinary&#8221; DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software</td>
			<td style="width:196px;">Li-Cor</td>
			<td style="width:244px;"></td>
			<td style="width:363px;">Product discontinued</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">NanoDrop 2000</td>
			<td style="width:196px;">Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM9915G</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Plasmid mini preparation kit</td>
			<td style="width:196px;">QIAGEN</td>
			<td align="right">12125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RapidGel-XL-40% Concentrate</td>
			<td style="width:196px;">USB</td>
			<td style="width:244px;">US75863</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">RNA STORAGE BUFFER</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td>AM7000</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Roti-Aqua-P/C/I</td>
			<td style="width:196px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:244px;">X985.3</td>
			<td style="width:363px;">Alternative: &#8220;Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)&#8221; from Ambion (AM9720)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">SUPERase&#8226;In RNase Inhibitor</td>
			<td style="width:196px;">Ambion (life technologies)</td>
			<td style="width:244px;">AM2696</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:399px;">Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP</td>
			<td style="width:196px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:244px;">RPN2538</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">TRIzol reagent</td>
			<td style="width:196px;">life technologies</td>
			<td style="width:244px;">15596-026</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:399px;">Zirconia/Silica Beads 0.1 mm</td>
			<td style="width:196px;">BioSpec</td>
			<td style="width:244px;">11079101z</td>
			<td style="width:363px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence based primer extension technique to determine transcriptional starting points and cleavage sites of rnases in vivo

Fluorescenza estensione primer a base (FPE) è un metodo molecolare per determinare i punti di partenza di trascrizione o siti di trasformazione di molecole di RNA. Ciò è ottenuto mediante trascrizione inversa di RNA di interesse utilizzando specifici primer fluorescente e successiva analisi dei frammenti di cDNA risultante dalla elettroforesi su gel denaturante di poliacrilammide. Contemporaneamente, un tradizionale reazione di sequenziamento Sanger viene eseguito sul gel per mappare le estremità dei frammenti di cDNA alle loro basi corrispondenti esatti. In contrasto con 5&#39;-RACE (Rapid Amplification di cDNA Ends), in cui il prodotto deve essere clonato e sequenziato più candidati, la maggior parte dei frammenti di cDNA generato dall&#39;estensione del primer può essere simultaneamente rilevata in una corsa di gel. Inoltre, l&#39;intera procedura (da trascrizione inversa di analisi finale dei risultati) può essere completato in un giorno lavorativo. Usando primer fluorescente, l&#39;uso di isotopi radioattivi pericolosi reagenti etichettatopossono essere evitati e tempi di lavorazione sono ridotti come i prodotti possono essere rilevati durante la procedura di elettroforesi. Nella seguente protocollo, si descrive un metodo di estensione in vivo di primer fluorescente per rilevare in modo affidabile e rapido l&#39;estremità 5 &#39;di RNA dedurre trascrizionale punti di partenza e siti di lavorazione RNA (ad esempio, dai componenti di sistema tossina-antitossina) a S. aureus, E. coli e altri batteri.

Come illustrato nella figura 6, una reazione di primer extension può essere utilizzato per determinare i punti di partenza trascrizionali di trascritti di interesse e può aiutare a dedurre regioni promotrici (tipicamente identificati da -10 e -35 elementi). Il più alto (più lunga) frammento di cDNA rappresenta il &#39;estremità del mRNA 5 e quindi può essere facilmente mappato rispetto alla scala sequenziamento. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52134/52134fig6...

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Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Fluorescenza base tecnica Primer Extension determinare trascrizionali punti di partenza e siti di taglio di RNasi<em&gt; In Vivo</em

Fluorescence based primer extension (FPE) is a molecular method to determine transcriptional starting points or processing sites of RNA molecules. This is ...

fluorescence-based-primer-extension-technique-to-determine

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Based Primer Extension Technique to Determine Transcriptional Starting Points and Cleavage Sites of RNases In Vivo

26.8K Views.  University of Tübingen. We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.