Questo protocollo descrive la preparazione del campione di RNA e la configurazione NMR per le misurazioni della dispersione di rilassamento del protone R1rho per esaminare lo scambio confermativo nelle molecole di RNA. Poiché i protoni vengono sondati, il metodo non ha bisogno di etichettatura isotopica e può accedere direttamente a caratteristiche strutturali come l'accoppiamento di basi spostato. La pipetta è abbastanza modulare nel senso che la dispersione di rilassamento R1rho può essere misurata anche se il campione è prodotto con un metodo diverso.
Inizia preparando il campione di plasmide e impostando una trascrizione in vitro e una reazione di scissione come descritto nel manoscritto di testo. Incubare la reazione a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi diluire un microlitro del campione dieci volte nella soluzione di carico.
Ed esegui un microlitro su un gel PAGE denaturante. Se la reazione di scissione ha successo, ridimensionare la reazione al volume desiderato ed eseguirla durante la notte. Quindi eseguire un altro gel PAGE denaturante e valutare se la reazione di scissione è stata completata.
In caso di scissione incompleta, riscaldare la soluzione di reazione in un forno a microonde convenzionale a 450 watt per 15 secondi. Quindi raffreddare lentamente la soluzione a 37 gradi Celsius per 40 minuti per rianvanere l'RNA e la guida alla scissione. E nota la formazione di un nuovo precipitato.
Aggiungere più pirofosfatasi inorganica e RNasi H.Incubare la reazione per una o tre ore a 37 gradi Celsius. Quindi confermare il completamento della reazione di scissione con page denaturante. Quando la reazione di scissione della RNasi H è completata, spegnere la reazione aggiungendo EDTA a una concentrazione finale di 50 millimolari.
E vortice completamente. Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. E concentrare la soluzione su un volume iniettabile in un sistema HPLC per la purificazione.
Prima di aggiungere il campione concentrato e purificato al tubo NMR, pulire il tubo lavandolo con abbondante acqua. Quindi reagente di decontaminazione della RNasi, acqua ed etanolo al 95%. Dopo il risciacquo finale con acqua, lasciarlo asciugare.
Risciacquare lo stantuffo con acqua e utilizzare una salvietta priva di lanugine per pulire con reagente di decontaminazione RNase ed etanolo al 95%. Dopo aver asciugato il tubo e lo stantuffo, aggiungere il 10% D2O al campione NMR. Utilizzare una grande punta della pipetta per trasferire il campione di RNA nel tubo NMR, scorrendolo lungo il lato della parete del tubo.
Inserire lo stantuffo nel tubo spingendolo verso il basso con un rapido movimento di torsione per rimuovere le bolle d'aria, quindi tirare lo stantuffo lentamente verso l'alto senza creare nuove bolle d'aria. E fissalo con un film di cera di paraffina. Creare un nuovo set di dati basato su un set di dati HSQC di carbonio protonico aromatico utilizzato su campioni di RNA completamente etichettati per l'assegnazione dell'RNA.
Impostare i parametri generali e i parametri specifici di RD. Quindi impostare la potenza di blocco dello spin protonico a 1,2 kilohertz per il test. Genera un elenco vd di test con una sola voce, zero millisecondi, imposta TDF1 su uno e aggiorna D30 per eseguire uno spettro di test.
Dopo aver impostato un elenco vd di test, aggiornare D30 e TDF1. E traccia l'intensità del picco per diverse lunghezze di blocco di rotazione. Identificare la lunghezza del blocco di rotazione alla quale l'intensità del picco originale diminuisce a un terzo.
Dal risultato delle esecuzioni dei test, creare l'elenco vd finale da utilizzare nell'esperimento. Selezionare il numero di scansioni in modo che il picco più debole dell'elenco abbia un rapporto segnale/rumore di almeno 10. I risultati di diverse reazioni di scissione dei trascritti in tandem sono mostrati qui.
Un RNA bersaglio a 20 nucleotidi è stato generato in una reazione di successo. Le reazioni infruttuose hanno provocato una scissione incompleta e fallita del campione. L'iniezione HPLC del campione di RNA ha rivelato un picco per l'RNA bersaglio puro a 38 minuti.
Mentre i prodotti più lunghi e più corti erano ben separati dal picco di interesse. L'analisi della forcina dell'RNA ha mostrato che il numero di protoni imino osservati corrispondeva al numero di protoni imino attesi da una simulazione della struttura secondaria. Lo spettro HSQC del carbonio protonico delle risonanze aromatiche dell'RNA ha mostrato quattro segnali dopo il ripiegamento.
E solo tre segnali prima di piegare. Nel rappresentante sulle curve di risonanza ottenute per due diversi atomi di H8 e due diverse forcine di RNA sintetico, il G6H8 sperimenta uno scambio confermativo. Mentre l'A4H8 non lo fa.
Per G6H8, sono stati selezionati i poteri di blocco dello spin colorati e sono stati registrati i dati di risonanza off. Nel costrutto CG in cui lo scambio è lento, i valori della riga R1rho rispetto al grafico di offset mostravano già una leggera asimmetria della curva, indicando il segno della differenza di spostamento chimico delta omega. Questo diventa ancora più evidente nel grafico R2 più REX in cui il contributo R1 viene rimosso.
D'altra parte, il costrutto GC sperimenta uno scambio più veloce e i valori R1rho rispetto al grafico offset hanno presentato una curva più ampia in cui l'estrazione di delta omega diventa meno evidente anche nel grafico R2 più REX. Una volta chiarite le dinamiche dell'RNA, gli stati possono essere caratterizzati e intrappolati. Questi stati intrappolati possono, ad esempio, essere testati in saggi biologici.
Questo metodo ci consente di osservare spostamenti funzionali e rilevanti dell'accoppiamento di basi in un complesso di miRNA di microRNA attivo, riarrangiamenti del loop nell'RNA ribosomiale e stabilità della coppia di basi su rigonfiamenti a singolo nucleotide.
