Name: use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins
Uploaded: 2014-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Questo lavoro è supportato dal Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council (BBSRC), la Royal Society e l&#39;Università di Nottingham.

1 Determinazione della fluorescenza intensità Change su Binding di Mant-marcato Nucleotide. <ol><li> Aggiungere 1 mM mant-nucleotide marcato a 1 mM cinesina (concentrazioni finali) in un tampone di reazione adeguato. In genere un buffer che beneficia della crescita dei microtubuli e la stabilità è utilizzato (vedi la discussione). Un buffer comunemente usato contiene 80mm piperazina-bis-2-ethanesulfonic acido (TUBI) pH6.9, 1mM MgCl2 e 1mM glicole etilenico-bis-2-acido aminoether tetraacetico (EGTA). Nota: La concentrazione di chinesina indicato in tutti i protocolli si riferisce alla concentrazione di siti di legame del nucleotide (cioè, domini motore). Esistono diverse kinesins come monomeri, dimeri o tetrameri e così possono contenere più di un sito nucleotide-binding per molecola. </li><li> Dopo un periodo di incubazione (1-3 min) e utilizzando un fluorimetro standard, di rilevare lo spettro di emissione per il complesso-nucleotide chinesina mant-etichettati. Utilizzare lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365nm emisura emessa luce 400-500 nm con incrementi di 1 nm. </li><li> Fare una soluzione di 1mM nucleotide Mant-marcato nello stesso tampone di reazione utilizzato nel passaggio 1.1. </li><li> Misurare lo spettro di emissione per il solo campione mant nucleotide, come precedentemente descritto (vedi punto 1.2). </li><li> Normalizza gli spettri di segnale alla lunghezza d&#39;onda di picco dell&#39;intensità di fluorescenza dello spettro di mant nucleotide in soluzione (cioè senza chinesina) dividendo per questo valore. </li><li> Tracciare lo spettro normalizzato (ad esempio, la Figura 2B) per osservare le differenze di intensità di fluorescenza tra il mantATP-bound e / o mantADP-bound cinesina e mant nucleotide in soluzione. </li></ol> 2 Misura delle costanti di associazione e dissociazione Prezzo della mantATP <ol><li> Per una soluzione di fino a 20 mM cinesina (vedi discussione) in qualsiasi appropriata Mg 2 + tampone -free (ad esempio, 80MM TUBI pH6.9, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), aggiungere 1mM (concentrazione finale) etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 1 mM (concentrazione finale) ditiotreitolo (DTT). Nota: L&#39;aggiunta di Tween20 al buffer è raccomandato in quanto riduce / previene la perdita di proteine ​​cinesina sulla colonna utilizzato per lo scambio di buffer (Piazza di 2.3 e 3.3) </li><li> Incubare la soluzione a 25 ° C per 15 min. </li><li> Separata nucleotide libero e EDTA dalla cinesina utilizzando una colonna di filtrazione G-25 gel Sephadex flusso di gravità in base alle istruzioni del produttore (vedere l&#39;elenco dei materiali). <ol><li> Equilibrare la colonna con almeno 3 volumi di colonna di un adeguato buffer di -free Mg 2 + (vedere il punto 2.1). Caricare la soluzione-cinesina contenente nella colonna. Preparare una provetta di raccolta aggiungendo un volume appropriato di soluzione di cloruro di magnesio 100mM al tubo vuoto, tale che la concentrazione finale di cloruro di magnesio è 1 mM dopo il prelievo della soluzione chinesina. Aggiunta immediata di cloruro di magnesio aiuta StabiliSE il kinesin libero-nucleotide. </li><li> Eluire la cinesina utilizzando un apposito tampone -free Mg 2 +. Kinesine sono instabili quando liberi di nucleotide per cui è importante lavorare velocemente. Conservare il kinesin libero-nucleotide su ghiaccio e consumare entro 1-2 ore. </li></ol></li><li> Durante o prima della preparazione di kinesin libero-nucleotide, preparare una serie concentrazione mantATP nello stesso tampone di reazione come la soluzione finale di kinesin libero-nucleotide. Determinare l&#39;intervallo di concentrazioni di mantATP necessarie in funzione della concentrazione di cinesina disponibile con una serie tipica che varia 0,1-50 mM (vedere il punto 2.5 e discussione). </li><li> Preparare una serie concentrazione di kinesin libero-nucleotide. Per ogni concentrazione di mantATP (punto 2.4), una concentrazione di kinesin libero-nucleotide deve essere preparato in modo tale che il nucleotide mant-marcato è da 5 a 10 volte l&#39;eccesso molare rispetto cinesina nucleotidiche siti di legame. </li><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione sul-flo fermatow fluorimetro a 365 nm e raccogliere emessa luce&gt; 400 nm usando un filtro passa-lungo. </li><li> Partendo con la più bassa concentrazione di mantATP, mescolare il mantATP con una concentrazione adeguata di kinesin libero-nucleotide in un rapporto 1: 1 v / v utilizzando un fluorimetro stopped-flow (Figura 3A e 3B Inset). Nota: I reagenti sono diluiti del 50% al momento della miscelazione. Mantenere una nota della concentrazione nucleotide sia pre che post miscelazione (ad esempio, 3,0 / 1,5 micron) per evitare confusione. </li><li> Montare la variazione di intensità di fluorescenza misurata ad ogni concentrazione di mantATP ad una funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (cioè, Fluorescenza = A 0 .exp (k .t obs) + (m. t + c), dove A 0 è l&#39;ampiezza, obs k è la costante di velocità e t è il tempo, vedi Figura 3B e discussione). Da questi attacchi determinare untasso costante (k obs) ad ogni concentrazione di mantATP. Ogni obs k è una convoluzione di una costante di associazione e di dissociazione frequenza (Figura 1, k 1 ek -1). </li><li> Deconvolve le associazione e dissociazione dei tassi costanti tracciando k oss contro la concentrazione mantATP (ad esempio, Figura 3C). Montare questi dati ad una funzione lineare (cioè, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) per ottenere il gradiente e Y intercetta. Il gradiente rappresenta la costante di velocità di associazione mantATP (Figura 1, k 1) con le unità M -1 s -1. L&#39;intercetta rappresenta la costante di velocità di dissociazione (Figura 1, k -1) con unità di s -1 (vedi la discussione). Nota: Questo approccio può essere applicato anche per determinare l&#39;associazione ADP e dissociazionecostanti di velocità (Figura 1, k -4 e 4 k) utilizzando mantADP come il nucleotide. </li></ol> 3 Misura della dissociazione Costante per mantADP <ol><li> Ad una soluzione di 2 mM kinesina in un tampone di reazione idoneo (ad esempio, TUBI 80 mm pH6.9, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), aggiungere 50 mM mantADP (concentrazione finale). </li><li> Incubare a 25 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso mantADP e altro nucleotide libero da buffer di scambio la cinesina nel buffer di reazione prescelto utilizzando una colonna Sephadex G-25 (vedere elenco dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Il dominio motore cinesina dovrebbe ora essere caricato con mantADP. </li><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione sul fluorimetro stopped-flow a 365 nm e raccogliere emessa luce&gt; 400 nm usando un filtro passa-lungo. </li><li> Mescolare il complesso mantADP.kinesin (~ 1μM) con un 50 volte o più molar eccesso di ATP non marcato in un rapporto 1: 1 v / v utilizzando un fluorimetro stopped-flow (Figura 4A e 4B Inset). </li><li> Montare la diminuzione di intensità di fluorescenza osservata nel tempo per una singola funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (cioè, Fluorescenza = A 0 .exp (k .t obs) + (m.t + c), dove A 0 è l&#39;ampiezza, obs k è la costante di velocità e t è il tempo, vedere la Figura 4B e discussione). Il obs k determinata da questa forma è la costante di velocità di dissociazione di ADP (figura 1, k 4) con unità di s -1 (vedi la discussione). </li></ol>

<ol>
	<li>Marx, A., Hoenger, A., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+kinesin+motor+proteins.">Structures of kinesin motor proteins.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66, 958-966 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+kinesin+ATP+turnover+to+translocation+and+microtubule+regulation:+one+engine,+many+machines.">Coupling of kinesin ATP turnover to translocation and microtubule regulation: one engine, many machines.</a> J. Muscle Res. Cell Motil. 33, 377-383 (2012).</li><li>Yun, M., Zhang, X., Park, C. G., Park, H. W., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+structural+pathway+for+activation+of+the+kinesin+motor+ATPase.">A structural pathway for activation of the kinesin motor ATPase.</a> EMBO J. 20, 2611-2618 (2001).</li><li>Hirose, K., Akimaru, E., Akiba, T., Endow, S. A., Amos, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+conformational+changes+in+a+kinesin+motor+catalyzed+by+interaction+with+microtubules.">Large conformational changes in a kinesin motor catalyzed by interaction with microtubules.</a> Mol. Cell. 23, 913-923 (2006).</li><li>Kikkawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Switch-based+mechanism+of+kinesin+motors.">Switch-based mechanism of kinesin motors.</a> Nature. 411, 439-445 (2001).</li><li>Friel, C. T., Bagshaw, C. R., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysing+the+ATP+turnover+cycle+of+microtubule+motors.">Analysing the ATP turnover cycle of microtubule motors.</a> Methods Mol. Biol. 777, 177-192 (2011).</li><li>Bagshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+analogues+at+a+glance.">ATP analogues at a glance.</a> J. Cell Sci. 114, 459-460 (2001).</li><li>Friel, C. T., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+kinesin-13+MCAK+has+an+unconventional+ATPase+cycle+adapted+for+microtubule+depolymerization.">The kinesin-13 MCAK has an unconventional ATPase cycle adapted for microtubule depolymerization.</a> EMBO J. 30, 3928-3939 (2011).</li><li>Gilbert, S. P., Webb, M. R., Brune, M., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+processive+ATP+hydrolysis+by+kinesin.">Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin.</a> Nature. 373, 671-676 (1995).</li><li>Sadhu, A., Taylor, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinetic+study+of+the+kinesin+ATPase.">A kinetic study of the kinesin ATPase.</a> J. Biol. Chem. 267, 11352-11359 (1992).</li><li>Woodward, S. K., Eccleston, J. F., Geeves, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+the+interaction+of+2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP+with+myosin+subfragment+1+and+actomyosin+subfragment+1:+characterization+of+two+acto-S1-ADP+complexes.">Kinetics of the interaction of 2'(3')-O-(N-methylanthraniloyl)-ATP with myosin subfragment 1 and actomyosin subfragment 1: characterization of two acto-S1-ADP complexes.</a> Biochemistry. 30, 422-430 (1991).</li><li>Hackney, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ADP-stimulated+ADP+release+and+dissociation+of+tethered+kinesin+from+microtubules.+Implications+for+the+extent+of+processivity.">Pathway of ADP-stimulated ADP release and dissociation of tethered kinesin from microtubules. Implications for the extent of processivity.</a> Biochemistry. 41, 4437-4446 (2002).</li><li>Lockhart, A., Cross, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+motility+of+the+Eg5+microtubule+motor.">Kinetics and motility of the Eg5 microtubule motor.</a> Biochemistry. 35, 2365-2373 (1996).</li><li>Chen, C. J., Porche, K., Rayment, I., Gilbert, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATPase+pathway+that+drives+the+kinesin-14+Kar3Vik1+powerstroke.">The ATPase pathway that drives the kinesin-14 Kar3Vik1 powerstroke.</a> J. Biol. Chem. 287, 36673-36682 (2012).</li><li>Moyer, M. L., Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+of+ATP+hydrolysis+by+monomeric+and+dimeric+kinesin.">Pathway of ATP hydrolysis by monomeric and dimeric kinesin.</a> Biochemistry. 37, 800-813 (1998).</li><li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=real-time+measurement+of+rapid+inorganic+phosphate+release+using+a+novel+fluorescent+probe+and+its+application+to+actomyosin+subfragment+1+ATPase.">real-time measurement of rapid inorganic phosphate release using a novel fluorescent probe and its application to actomyosin subfragment 1 ATPase.</a> Biochemistry. 33, 8262-8271 (1994).</li><li>Goodrich, J. A., Kugel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Binding and Kinetics for Molecular Biologists. 4, 69-97 (2006).</li><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods Cell Biol. 95, 221-245 (2010).</li><li>Olmsted, J. B., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+and+nucleotide+requirements+for+microtubule+polymerization+in+vitro.">Ionic and nucleotide requirements for microtubule polymerization in vitro.</a> Biochemistry. 14, 2996-3005 (1975).</li><li>Brinkley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules:+a+brief+historical+perspective.">Microtubules: a brief historical perspective.</a> J. Struct Biol. 118, 84-86 (1997).</li><li>Ostap, E. M., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+kinetic+characterization+of+the+Acanthamoeba+myosin-I+ATPase.">Biochemical kinetic characterization of the Acanthamoeba myosin-I ATPase.</a> J. Cell Biol. 132, 1053-1060 (1996).</li><li>Eccleston, J. F., Moore, K. J., Brownbridge, G. G., Webb, M. R., Lowe, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+approaches+to+the+study+of+the+p21ras+GTPase+mechanism.">Fluorescence approaches to the study of the p21ras GTPase mechanism.</a> Biochem. Soc. Trans. 19, 432-437 (1991).</li><li>Ahmadian, M. R., Wittinghofer, A., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+methods+in+the+study+of+small+GTP-binding+proteins.">Fluorescence methods in the study of small GTP-binding proteins.</a> Methods Mol. Biol. 189, 45-63 (2002).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui, vi presentiamo i protocolli per l&#39;osservazione e l&#39;analisi della cinetica delle transizioni tra gli stati nucleotidiche per una cinesina. Questi protocolli utilizzano il metodo rapida miscelazione stopped-flow in combinazione con nucleotidi fluorescente. Metodi di questo tipo sono stati ampiamente utilizzati per studiare nucleotide vincolante e dissociazione per una varietà di kinesins 9-11,13-16. I metodi descritti non consentono l&#39;osservazione di rilascio fosfato (Figura 1, punto 3). Tuttavia, stopped-flow fluorescenza può essere utilizzata per osservare questa transizione utilizzando una proteina di rilevamento fosfato di accoppiare la produzione di fosfato ad una variazione di intensità di fluorescenza 17. I metodi presentati uso nucleotidi marcati con il piccolo methylanthraniloyl fluoroforo (Mant), che in genere mostrano un aumento di intensità di fluorescenza quando si lega alle proteine. Inoltre, il fluoroforo mant, quando coniugato sia al 2 &#39;o 3&#39; la posizione sulla ribose, spesso ha poco o nessun effetto sulla vincolante, dissociazione o idrolisi del nucleotide 9-12. Nucleotidi Mant-marcati sono facilmente reperibili da fonti commerciali (vedere l&#39;elenco dei materiali) e sono forniti come miscele del 2 &#39;e 3&#39; coniugato quanto rapidamente riequilibrare quando purificato di un singolo isomero 8. Nucleotidi Mant-marcato fare ottimi molecole giornalista con cui si possono osservare le cinetiche di legame del nucleotide e di dissociazione. L&#39;uso di nucleotidi fluorescente significa che la lettura dei saggi descritti è un cambiamento in tempo reale di intensità di fluorescenza. Ciò rende questi saggi ideale per stopped-flow fluorescenza, che permette una rapida miscelazione dei reagenti e l&#39;osservazione in tempo reale delle variazioni di fluorescenza associate alla reazione successiva. La combinazione di stopped-flow come la tecnica di miscelazione e fluorescenza come metodo di rilevamento produce un sistema che è ef relativamente campioneficiente. Ad esempio, per acquisire i dati mostrati nella Figura 3C richiede 0,8-1,0 mg di purificato kinesin-13, MCAK, e di acquisire i dati mostrati nella Figura 4B richiede ~ 0,3 mg di purificato kinesin-13, MCAK. Uno svantaggio dell&#39;uso di mant come fluoroforo è che è incline a photobleaching. Ciò può essere osservato in isolamento da chinesina cinetica di reazione miscelando una soluzione di mant nucleotide marcato con tampone di reazione, in assenza di chinesina, nel flusso fermato. Una lenta diminuzione di intensità di fluorescenza si osserva come il gruppo mant diventa sbiancato. Oltre la gamma di tempi utilizzati nei protocolli descritti photobleaching del gruppo Mant è ben descritto da una funzione lineare. Pertanto, un modo semplice per correggere i dati per fotoscolorimento è per adattarsi ad una funzione esponenziale con una linea di base descritto da una funzione lineare (cioè, m + c) anziché la linea di base piatta più comune, descritto da un singolo parametro. vincolante mantATP Quando si misura costanti di velocità di associazione e dissociazione di mantATP (Sezione 2) l&#39;ADP, che rimane associato al sito nucleotide-binding kinesina in assenza di microtubuli, deve essere rimosso. Questo permette associazione mantATP e dissociazione (Figura 1, punto 1), da osservare in isolamento da dissociazione ADP. Per raggiungere questo obiettivo la chinesina è incubato con almeno un eccesso di 50 volte di EDTA su siti di legame del nucleotide (Passo 2.1). L&#39;EDTA sequestra Mg 2 + ioni causando Mg 2 + a dissociarsi dalla tasca nucleotide-binding, che si traduce nel rilascio del nucleotide 11. Pertanto, nello svolgimento passaggi 2,1-2,3, è indispensabile utilizzare un buffer libero di Mg 2 +. La proteina kinesin libero-nucleotide è buffer di scambio per separarlo sia dal nucleotide libero e da EDTA. Per realizzare questa separazione, un usa e getta a caduta gecolonna l filtrazione è sufficiente ed è semplice e rapido da usare (vedere l&#39;elenco dei materiali). L&#39;interazione di mantATP con nucleotide cinesina libera viene effettuata in un intervallo di concentrazioni mantATP (Passo 2.4) per consentire deconvoluzione delle costanti di associazione e dissociazione dei tassi (punto 2.8). La teoria alla base di esperimenti di questo tipo è ben descritto nel riferimento 18 In esecuzione di questi esperimenti si comincia con la più bassa concentrazione di mantATP. Ciò elimina la necessità di fasi di lavaggio tra diverse concentrazioni. Probabilmente sarà necessario regolare la sensibilità del fluorimetro stopped-flow come concentrazione mantATP viene aumentata. La concentrazione mantATP deve essere sempre superiore di almeno 5 volte rispetto alla concentrazione di cinesina nucleotidiche siti di legame per mantenere condizioni di pseudo primo ordine. Tuttavia, poiché la concentrazione di mantATP viene aumentata, la variazione del segnale può diventare inondato come frazione di nucleotide che si lega a chinesina diminuisce. Therefore, la concentrazione della chinesina è anche aumentato per ogni nuova concentrazione di mantATP tale che la concentrazione di mantATP è mai superiore a 10 volte l&#39;eccesso molare rispetto siti di legame del nucleotide (Passo 2.6). mantADP Dissociazione Sebbene associazione e dissociazione dei tassi costanti per mantADP possono essere determinati con lo stesso metodo descritto per mantATP (sezione 2). La dissociazione di ADP da una cinesina può essere osservata direttamente dal precarico del sito nucleotide-binding con mantADP (Passi 3,1-3,3) Il complesso mantADP.kinesin viene poi mescolato con un eccesso di ATP senza etichetta (punto 3.5). L&#39;eccesso senza etichetta ATP impedisce la rilegatura del mantADP alla cinesina e quindi permette la reazione di dissociazione (Figura 1, k 4) da osservare in isolamento da un&#39;associazione di mantADP. In questo test la concentrazione di ATP non marcato deve essere almeno un eccesso molare di 50 volte di NUCleotide siti di legame. La teoria alla base di questo saggio è ben descritta in riferimento 18. Questo metodo diretto fornisce un valore più preciso per il tasso costante di dissociazione rispetto alla estrapolazione per l&#39;asse y descritto al punto 2.8. Inclusione di microtubuli I metodi descritti possono essere utilizzati per determinare la cinetica di legame nucleotidico e dissociazione in presenza di microtubuli. I microtubuli vengono introdotti alla siringa nucleotide contenente prima della miscela nel flusso fermato: la siringa inferiore nella Figura 3B e 4B (Inserti). In questa configurazione, la chinesina incontrerà il nucleotide allo stesso tempo se corrisponde ai microtubuli. Microtubuli stabilizzati sono utilizzati, in cui la durata del polimero tubulina viene esteso mediante l&#39;uso di una sostanza chimica o stabilizzante, come taxolo, o un analogo GTP nonhydrolysable, come guanosina-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, vedere l&#39;elenco dei materiali). E &#39;possibile utilizzare due cicli di polimerizzazione della tubulina con GMPCPP fare microtubuli che possono essere conservati per molti mesi a 9,19 azoto liquido. L&#39;uso di microtubuli pre-preparati riduce in modo significativo le difficoltà pratiche di esecuzione di tali test. Per includere microtubuli nei saggi, è importante utilizzare un tampone di reazione adatta per la stabilità dei microtubuli. Il buffer di scelta è TUBI based, con il buffer più comunemente usato contenente 80 mM pH 6.9 TUBI, 1 MgCl 2 e 1 EGTA mm mm (noto come BRB80) 20,21. I metodi descritti non sono limitati da utilizzare con kinesins, ma possono essere adattati e applicati a qualsiasi proteina di legame nucleotide. Ad esempio, i metodi simili sono stati applicati al ciclo fatturato ATP dei membri della famiglia miosina di motori molecolari 12,22 e l&#39;uso di mant etichettato nucleotidi guanosina estende ulteriormenteMetodi di questo tipo di idrolizzare proteine ​​GTP 23,24.

Le kinesins sono una superfamiglia di proteine ​​caratterizzate da un dominio motore altamente conservata 1. Il dominio motore cinesina interagisce con i microtubuli in modo nucleotide-dipendente. I membri della famiglia cinesina visualizzano una gamma di funzioni da kinesins translocating, che trasportano merci in modo diretto lungo i microtubuli, a kinesins finali vincolante non translocating microtubuli, che regolano la dinamica dei microtubuli 2,3. Kinesine utilizzano il fatturato di adensosine-5&#39;-trifosfato (ATP) per regolare la loro interazione con il citoscheletro dei microtubuli 4-6. La conformazione del dominio motore chinesina e quindi la sua affinità per il microtubulo dipende dal suo stato di nucleotidi: ATP, ADP, ADP.Pi o nessun nucleotide possono essere vincolati (Figura 1). Per comprendere il meccanismo molecolare di una cinesina, è necessaria una comprensione del rapporto tra il fatturato ATP e l&#39;interazione dei microtubuli. Ilto, è un obiettivo importante nel campo kinesin è quello di caratterizzare le proprietà funzionali dei diversi stati nucleotidi e la cinetica delle transizioni tra di loro sia in presenza che in assenza di microtubuli. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Figura 1 Il più semplice ciclo fatturato ATP per una cinesina si compone di quattro possibili stati: (Φ) libero-nucleotide, ATP-bound, ADP.P i -bound e ADP-legato Ognuno dei quattro transizioni è caratterizzato da un in avanti e. costante indietro rate (k x e k -x, rispettivamente). Per capire come il ciclo chimica del fatturato ATP è accoppiata al ciclo meccanico dell&#39;interazione microtubuli, si deve determinare la fase del ciclo fatturato ATP è limitante in assenza di microtubmoduli e quindi determinare come il ciclo è alterata dalla presenza di microtubuli. Il più semplice ciclo di fatturato ATP è costituito da quattro singole fasi chimici: (1) ATP legame al sito vuoto (Φ indica il sito vuoto, cioè, kinesin libero-nucleotide); (2) scissione ATP; (3) dissociazione fosfato e (4) ADP dissociazione (Figura 1). Il fattore limitante imposta la costante di velocità per l&#39;intero ciclo di fatturato ATP. Pertanto, per determinare quale passo è fattore limitante ciascuna delle singole transizioni devono essere misurati e confrontati con la costante di velocità per il ciclo completo. Metodi per misurare il volume d&#39;affari complessivo di ATP costante tasso di ciclo qui non descritti, ma si possono trovare in riferimento 7 Qui, descriviamo i metodi con cui costanti di velocità per i singoli passaggi chimici possono essere determinati. Ci sono un certo numero di metodi disponibili per studiare le singole transizioni nel ciclo di fatturato di una proteina nucleotide idrolizzante. I metodi qui presentati assumono advantage delle proprietà di nucleotidi marcati con il fluoroforo methylanthraniloyl, solitamente indicato come mant, che mostrano un cambiamento di intensità di fluorescenza dopo il legame alla proteina 8. Il gruppo mant è usato perché la sua piccola dimensione significa che, quando accoppiato al ribosio (Figura 2A), si ha in genere poco o nessun effetto sulla cinetica di legame del nucleotide o idrolisi 9-12. Qui, vi presentiamo i protocolli che descrivono l&#39;uso di nucleotidi mant-marcato, in combinato disposto con stopped-flow fluorescenza, per consentire l&#39;osservazione del legame nucleotide e dissociazione nel ciclo fatturato ATP di una cinesina.

<table><tbody><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;triphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-202</td><td>mantATP</td></tr><tr><td>2&amp;rsquo;/3&amp;rsquo;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&amp;rsquo;-diphosphate&amp;nbsp;</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-201</td><td>mantADP</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Roche</td><td># 10519979001</td><td>The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&amp;nbsp;mM in 100&amp;nbsp;mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;. Concentration should be verified by absorption at 260&amp;nbsp;nm (e = 15,400&amp;nbsp;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&amp;nbsp;&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>0.5&amp;nbsp;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Melford</td><td>MB1015</td><td>1&amp;nbsp;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td></tr><tr><td>NAP-5 column</td><td>GE Healthcare</td><td># 17-0853</td><td>G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Biosciences</td><td># NU-405</td><td>nonhydrolysable analogue of GTP</td></tr><tr><td>Stopped-flow fluorimeter&amp;nbsp;</td><td>Applied Photophysics</td><td>SX20</td><td>A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&amp;nbsp;-&amp;nbsp;100&amp;nbsp;sec to be monitored.</td></tr></tbody></table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

La superfamiglia cinesina di microtubuli associati proteine ​​motrici condividono un dominio motore caratteristica che sia idrolizza ATP e lega i microtubuli. Kinesine mostrano differenze tra la superfamiglia sia in fatturato ATP e nell&#39;interazione microtubuli. Queste differenze personalizzare kinesins specifici per varie funzioni, come il trasporto merci, microtubuli scorrevole, depolimerizzazione dei microtubuli e la stabilizzazione dei microtubuli. Per comprendere il meccanismo di azione di un chinesina è importante capire come il ciclo chimica del fatturato ATP è accoppiata al ciclo meccanico di interazione microtubuli. Per sezionare il ciclo di fatturato ATP, un approccio è quello di utilizzare nucleotidi fluorescente di visualizzare singole fasi del ciclo. Determinazione della cinetica di ogni transizione nucleotide nel ciclo di fatturato ATP permette la tappa limitante o passi per il ciclo completo di identificare. Per un chinesina, è importante conoscere la tappa limitante, inl&#39;assenza di microtubuli, in quanto questo passaggio viene generalmente accelerato diverse migliaia di volte quando la cinesina interagisce con i microtubuli. Il ciclo in assenza di microtubuli viene poi confrontata con quella in presenza di microtubuli per comprendere appieno ATP ciclo fatturato di un chinesina. La cinetica di singoli nucleotidi transizioni sono generalmente troppo veloce per osservare mescolando manualmente reagenti, in particolare in presenza di microtubuli. Un dispositivo di miscelazione rapida, ad esempio un fluorimetro stopped-flow, che permette cinetica da osservare su scale temporali di appena qualche millisecondo, può essere utilizzato per monitorare tali transizioni. Qui, descriviamo i protocolli in cui la rapida miscelazione dei reagenti di stopped-flow viene utilizzato in combinazione con nucleotidi fluorescente a sezionare il ciclo fatturato ATP di una cinesina.

Un aumento di intensità di fluorescenza del gruppo Mant è tipicamente osservato dopo legame del nucleotide Mant-marcato ad una cinesina. Tuttavia, l&#39;entità di tale cambiamento del segnale dipende dalla particolare chinesina in questione. Pertanto, è utile effettuare misurazioni di equilibrio per confermare sia la presenza e l&#39;entità di un cambiamento di intensità di fluorescenza prima di passare al test cinetici. Rappresentativa spettri di fluorescenza per mantATP e mantADP, sia in soluzione che in complesso con il chinesina-13, MCAK, sono mostrati in Figura 2B. Questi dati evidenziano l&#39;aumento di intensità di fluorescenza visualizzata da entrambe mantATP e mantADP sul legame MCAK. Il cambiamento di intensità di fluorescenza in seguito al legame di Mant nucleotide ad una cinesina viene utilizzato per riferire sulla associazione e dissociazione sia di ATP e ADP (sezioni 2 e 3). Nel caso di MCAK, una differenza di intensità di fluorescenza è osservata tra mantATP.kinesin e mantADP.kinesin <sup&gt; 9. Figura 3A illustra la reazione che si verifica su di miscelazione mantATP con kinesin libero-nucleotide. Dati rappresentativi che illustrano l&#39;aumento di intensità di fluorescenza che si verifica dopo il legame del mantATP al kinesin-13, MCAK è mostrato in Figura 3B. I dati del tipo mostrato in Figura 3B è raccolto in un intervallo di concentrazioni mantATP. Una trama delle costanti di velocità (k OB) determinato rispetto alla concentrazione mantATP è mostrato in Figura 3C. Montaggio questi dati ad una funzione lineare (cioè, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) permette di deconvoluzione delle costanti di velocità che contribuiscono a k OB (punto 2.8). Pertanto, consentendo di determinare sia l&#39;associazione e la costante di dissociazione per mantATP (Figura 1, k 1 ek <em&gt; -1 rispettivamente). Figura 4A illustra la reazione che si verifica al momento miscelazione mantADP.kinesin con un eccesso di ATP non marcato. I dati in figura 4B mostra la diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza osservata per mantADP sulla dissociazione dal kinesin-13, MCAK. Inserendo questi dati a una funzione esponenziale (Passo 3.6) la costante di velocità di dissociazione di mantADP è determinata direttamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Figura 2. nucleotidi marcati con il methylanthraniloyl fluoroforo (Mant) vengono utilizzati per isolare le singole fasi del ciclo di fatturato ATP. (A) Struttura del mantATP che mostra la posizione del fluoroforo mant coniugato sia al 2 &#39;o 3&#39; posizione sul ribosio. (B) normalizzato spettri di fluorescenza per mantATP e mantADP in soluzione (maxp) e un mantATPd mantADP in complesso con la cinesina MCAK (MATP + MCAK e MADP + MCAK). Gli spettri mantATP sono normalizzati per la fluorescenza al massimo per mantATP in soluzione e spettri mantADP sono normalizzati a fluorescenza a max per mantADP in soluzione. Gli spettri dei nucleotidi mant mescolati con MCAK sono raccolti in 1 min dopo la miscelazione. La concentrazione dei reagenti e delle impostazioni fluorimetro sono come descritto nel protocollo passi 1.1 e 1.2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Figura 3 Misura della costante di velocità associazione di mantATP. (A) Schema raffigurante la reazione che avviene dopo miscelazione da stopped-flow: mantATP (MATP) si lega a-nucleotide libero cinesina. L&#39;intensità di fluorescenza del gruppo Mant aumenti su legame alla proteina. (B) variazione del segnale di fluorescenza (nero) osservato dopo la miscelazione mantATP (25 M) con MCAK (5 M nulibero-cleotide,). Questo dato è in forma (rossa tratteggiata) per una singola funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa, che rappresenta photobleaching del fluoroforo Mant (vedi discussione) Inserto:. Contenuto delle siringhe prima della miscelazione sul fluorimetro stopped-flow. (C) costanti di velocità (k OB) stabiliti per la reazione di mantATP con MCAK libero-nucleotide rilevate in concentrazioni di mantATP. Questo terreno avrà una regione lineare con il gradiente è la costante di associazione (Figura 1, k 1) con unità di M -1 s -1 e l&#39;intercetta y è la costante di velocità di dissociazione (Figura 1, k -1) con unità di s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> . Figura 4 Misura della costante di velocità di dissociazione per mantADP (A) Schema raffigurante la reazione che avviene dopo miscelazione da stopped-flow: cinesina precaricato con mantADP viene diluito in un eccesso di ATP senza etichetta. Dissociare mantADP è sostituito dal senza etichetta ATP, impedendo così la reazione posteriore di associazione mantADP (vedi la discussione). L&#39;intensità di fluorescenza del gruppo Mant scende sulla dissociazione dalla proteina. Diminuzione (B) fluorescenza osservata sulla dissociazione del mantADP dalla cinesina MCAK. Il segnale di fluorescenza (nero) è in forma (rossa tratteggiata) per un singolo esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (vedi la discussione). La costante di velocità determinato è la costante di velocità di dissociazione di mantADP (figura 1, k4) Nel riquadro:.. Contenuto delle siringhe prima della miscelazione su un fluorimetro stopped-flow <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins at JoVE.com

Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesine sono caratterizzati dall&#39;interazione nucleotide-dipendente con microtubuli: un ciclo di fatturato ATP accoppiato ad un ciclo di interazione microtubuli. Qui, descriviamo i protocolli di analizzare la cinetica delle singole transizioni nucleotide nel ciclo fatturato ATP di una cinesina utilizzando nucleotidi fluorescente e stopped-flow fluorescenza.

L&#39;uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

use-stopped-flow-fluorescence-labeled-nucleotides-to-analyze-atp

Research

JoVE Journal

Chemistry

15.5K Views.  University of Nottingham.  Kinesine sono caratterizzati dall'interazione nucleotide-dipendente con microtubuli: un ciclo di fatturato ATP accoppiato ad un ciclo di interazione microtubuli. Qui, descriviamo i protocolli di analizzare la cinetica delle singole transizioni nucleotide nel ciclo fatturato ATP di una cinesina utilizzando nucleotidi fluorescente e stopped-flow fluorescenza. 

Video: Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would not occur spontaneously. These proteins are crucial for essentially all aspects of cellular life, including metabolism, cell division, responses to environmental changes and movement. The protocol presented here describes a nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay that has been adapted to semi-high throughput screening of small molecule ATPase inhibitors. The assay has been applied to cardiac and skeletal muscle myosin II's, two actin-based molecular motor ATPases, as a proof of principle. The hydrolysis of ATP is coupled to the oxidation of NADH by enzymatic reactions in the assay. First, the ADP generated by the ATPase is regenerated to ATP by pyruvate kinase (PK). PK catalyzes the transition of phosphoenolpyruvate (PEP) to pyruvate in parallel. Subsequently, pyruvate is reduced to lactate by lactate dehydrogenase (LDH), which catalyzes the oxidation of NADH in parallel. Thus, the decrease in ATP concentration is directly correlated to the decrease in NADH concentration, which is followed by change to the intrinsic fluorescence of NADH. As long as PEP is available in the reaction system, the ADP concentration remains very low, avoiding inhibition of the ATPase enzyme by its own product. Moreover, the ATP concentration remains nearly constant, yielding linear time courses. The fluorescence is monitored continuously, which allows for easy estimation of the quality of data and helps to filter out potential artifacts (e.g., arising from compound precipitation or thermal changes).

A nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)-coupled ATPase assay has been adapted to semihigh throughput screening of small molecule myosin inhibitors. This kinetic assay is run in a 384-well microplate format with total reaction volumes of only 20 &#181;L per well. The platform should be applicable to virtually any ADP producing enzyme.

Adattamento semi-alto/throughput del saggio ATPase accoppiato NADH per lo screening degli inibitori delle piccole molecole

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Ricerca

Biochimica

Assembling Molecular Shuttles Powered by Reversibly Attached Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast to previous protocols, in this system, microtubules recruit kinesin motor proteins from solution and place them on a surface. The kinesins will, in turn, facilitate the gliding of the microtubules along the surface before desorbing back into the bulk solution, thus being available to be recruited again. This continuous assembly and disassembly leads to striking dynamic behavior in the system, such as the formation of temporary kinesin trails by gliding microtubules.
Several experimental methods will be described throughout this experiment: UV-Vis spectrophotometry will be used to determine the concentration of stock solutions of reagents, coverslips will first be ozone and ultraviolet (UV) treated and then silanized before being mounted into flow cells, and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy will be used to simultaneously image kinesin motors and microtubule filaments.

We present a protocol to build molecular shuttles, where surface-adhered kinesin motor proteins propel dye-labelled microtubules. Weak interactions of the kinesins with the surface enables their reversible attachment to it. This creates a nanoscale system which exhibits dynamic assembly and disassembly of its components while retaining its functionality.

Assemblaggio molecolare navette arricchite reversibilmente attaccato Kinesins

This protocol describes how to create kinesin-powered molecular shuttles with a weak and reversible attachment of the kinesins to the surface. In contrast ...

Ingegneria

Myosin-Specific Adaptations of In vitro Fluorescence Microscopy-Based Motility Assays

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic properties are adapted for the particular function they execute in cells. Myosin 5a processively walks on F-actin to transport melanosomes and vesicles in cells. Conversely, nonmuscle myosin 2b operates as a bipolar filament containing approximately 30 molecules. It moves F-actin of opposite polarity toward the center of the filament, where the myosin molecules work asynchronously to bind actin, impart a power stroke, and dissociate before repeating the cycle. Nonmuscle myosin 2b, along with its other nonmuscle myosin 2 isoforms, has roles that include&#160;cell adhesion, cytokinesis, and tension maintenance. The mechanochemistry of myosins can be studied by performing in vitro motility assays using purified proteins. In the gliding actin filament assay, the myosins are bound to a microscope coverslip surface and translocate fluorescently labeled F-actin, which can be tracked. In the single molecule/ensemble motility assay, however, F-actin is bound to a coverslip and the movement of fluorescently labeled myosin molecules on the F-actin is observed. In this report, the purification of recombinant myosin 5a from Sf9 cells using affinity chromatography is outlined. Following this, we outline two fluorescence microscopy-based assays: the gliding actin filament assay and the inverted motility assay. From these assays, parameters such as actin translocation velocities and single molecule run lengths and velocities can be extracted using the image analysis software. These techniques can also be applied to study the movement of single filaments of the nonmuscle myosin 2 isoforms, discussed herein in the context of nonmuscle myosin 2b. This workflow represents a protocol and a set of quantitative tools that can be used to study the single molecule and ensemble dynamics of nonmuscle myosins.

Presented here is a procedure to express and purify myosin 5a followed by a discussion of its characterization, using both ensemble and single molecule in vitro fluorescence microscopy-based assays, and how these methods can be modified for the characterization of nonmuscle myosin 2b.

Adattamenti specifici della miosina dei saggi di motilità basati sulla microscopia a fluorescenza in vitro

Myosin proteins bind and interact with filamentous actin (F-actin) and are found in organisms across the phylogenetic tree. Their structure and enzymatic ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and networks often contain subsets of microtubule arrays that differ in their dynamic properties. For example, in dividing cells, stable bundles of crosslinked microtubules coexist in close proximity to dynamic non-crosslinked microtubules. TIRF-microscopy-based in vitro reconstitution studies enable the simultaneous visualization of the dynamics of these different microtubule arrays. In this assay, an imaging chamber is assembled with surface-immobilized microtubules, which are either present as single filaments or organized into crosslinked&#160;bundles. Introduction of tubulin, nucleotides, and protein regulators allows direct visualization of associated proteins and of dynamic properties of single and crosslinked microtubules. Furthermore, changes that occur as dynamic single microtubules organize into bundles can be monitored in real-time. The method described here allows for a systematic evaluation of the activity and localization of individual proteins, as well as synergistic effects of protein regulators on two different microtubule subsets under identical experimental conditions, thereby providing mechanistic insights that are inaccessible by other methods.

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Here, a TIRF microscopy-based in vitro reconstitution assay is presented to simultaneously quantify and compare the dynamics of two microtubule populations. A method is described to simultaneously view the collective activity of multiple microtubule-associated proteins on crosslinked microtubule bundles and single microtubules.

Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of catalytic motor domains, located at opposite ends of the active complex. This unique architecture enables kinesin-5 motors to crosslink and slide apart antiparallel spindle microtubules (MTs), thus providing the outwardly-directed force that separates the spindle poles apart. Previously, kinesin-5 motors were believed to be exclusively plus-end directed. However, recent studies revealed that several fungal kinesin-5 motors are minus-end directed at the single-molecule level and can switch directionality under various experimental conditions. The Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 is an example of such bi-directional motor protein: in high ionic strength conditions single molecules of Cin8 move in the minus-end direction of the MTs. It was also shown that Cin8 forms motile clusters, predominantly at the minus-end of the MTs, and such clustering allows Cin8 to switch directionality and undergo slow, plus-end directed motility. This article provides a detailed protocol for all steps of working with GFP-tagged kinesin-5 Cin8, from protein overexpression in S. cerevisiae cells and its purification to in vitro single-molecule motility assay. A newly developed method described here helps to differentiate between single molecules and clusters of Cin8, based on their fluorescence intensity. This method enables separate analysis of motility of single molecules and clusters of Cin8, thus providing the characterization of the dependence of Cin8 motility on its cluster size.

Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-Directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells

The bi-directional mitotic kinesin-5 Cin8 accumulates in clusters that split and merge during their motility. Accumulation in clusters also changes the velocity and directionality of Cin8. Here, a protocol for motility assays with purified Cin8-GFP and analysis of motile properties of single molecules and clusters of Cin8 is described.

Motilità di singole molecole e cluster di Kinesin-5 Cin8 bidirezionale purificata da cellule S. cerevisiae

The mitotic bipolar kinesin-5 motors perform essential functions in spindle dynamics. These motors exhibit a homo-tetrameric structure with two pairs of ...

Cargo Loading onto Kinesin Powered Molecular Shuttles

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport of cargo. While kinesins tail domain binds to a variety of cargoes, kinesins head domains utilize the chemical energy stored in ATP molecules to step along the microtubule lattice. The long, stiff microtubules serve as tracks for long-distance intracellular transport.
These motors and filaments can also be employed in microfabricated synthetic environments as components of molecular shuttles 1. In a frequently used design, kinesin motors are anchored to the track surface through their tails, and functionalized microtubules serve as cargo carrying elements, which are propelled by these motors. These shuttles can be loaded with cargo by utilizing the strong and selective binding between biotin and streptavidin. The key components (biotinylated tubulin, streptavidin, and biotinylated cargo) are commercially available.
Building on the classic inverted motility assay 2, the construction of molecular shuttles is detailed here. Kinesin motor proteins are adsorbed to a surface precoated with casein; microtubules are polymerized from biotinylated tubulin, adhered to the kinesin and subsequently coated with rhodamine-labeled streptavidin. The ATP concentration is maintained at subsaturating concentration to achieve a microtubule gliding velocity optimal for loading cargo 3. Finally, biotinylated fluorescein-labeled nanospheres are added as cargo. Nanospheres attach to microtubules as a result of collisions between gliding microtubules and nanospheres adhering to the surface.
The protocol can be readily modified to load a variety of cargoes such as biotinylated DNA4, quantum dots 5 or a wide variety of antigens via biotinylated antibodies 4-6.

Molecular shuttles consisting of functionalized microtubules gliding on surface-adhered kinesin motor proteins can serve as a nanoscale transport system. Here, the assembly of a typical shuttle system is described.

Caricamento di merci su Kinesin Navette Powered molecolare

Cells have evolved sophisticated molecular machinery, such as kinesin motor proteins and microtubule filaments, to support active intracellular transport ...

Biologia

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

Microscopia a fluorescenza a riflessione interna simultanea e riflessione interna totale per l'imaging di microtubuli dinamici e proteine associate

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved single-molecule studies and has gained immense popularity in detecting and understanding the dynamic behavior of fluorescent-tagged molecules. Here, we describe a detailed method for&#160;in vitro single-molecule studies of kinesin-3 family motors using Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy. Kinesin-3 is a large family that plays critical roles in cellular and physiological functions ranging from intracellular cargo transport to cell division to development. We have shown previously that constitutively active dimeric kinesin-3 motors exhibit fast and superprocessive motility with high microtubule affinity at the single-molecule level using cell lysates prepared by expressing motor in mammalian cells. Our lab studies kinesin-3 motors and their regulatory mechanisms using cellular, biochemical and biophysical approaches, and such studies demand purified proteins at a large scale. Expression and purification of these motors using mammalian cells would be expensive and time-consuming, whereas expression in a prokaryotic expression system resulted in significantly aggregated and&#160;inactive protein. To overcome the limitations posed by bacterial purification systems and mammalian cell lysate, we have established a robust Sf9-baculovirus expression system to express and purify these motors. The kinesin-3 motors are C-terminally tagged with 3-tandem fluorescent proteins (3xmCitirine or 3xmCit) that provide enhanced signals and decreased photobleaching. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of Sf9 purified proteins demonstrate that kinesin-3 motors are fast and superprocessive akin to our previous studies using mammalian cell lysates. Other applications using these assays include detailed knowledge of oligomer conditions of motors, specific binding partners paralleling biochemical studies, and their kinetic state.

This study details purification of KIF1A(1-393LZ), a member of kinesin-3 family, using Sf9-baculovirus expression system. In vitro single-molecule and multi-motor gliding analysis of these purified motors exhibited robust motility properties comparable to motors from mammalian cell lysate. Thus, Sf9-baculovirus system is amenable to express and purify motor protein of interest.

Analisi a singola molecola dei motori della famiglia Kinesin-3 superprocessiva purificata Sf9

A complex cellular environment poses challenges for single-molecule motility analysis. However, advancement in imaging techniques have improved ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Saggi biochimici per le attività di analisi ATP-dipendente rimodellamento della cromatina Enzimi

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Here, a protocol is presented to identify Kinesin-1 cargos. A motorless mutant of the Kinesin-1 heavy chain (KIF5B) aggregates in the cytoplasm and induces aggregation of its cargos. Both aggregates are detected under fluorescence microscopy. A similar strategy can be employed to identify cargos of other motor proteins.

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

L'uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video