Questo lavoro è supportato dal Biotecnologie e Scienze Biologiche Research Council (BBSRC), la Royal Society e l&#39;Università di Nottingham.

1 Determinazione della fluorescenza intensità Change su Binding di Mant-marcato Nucleotide. <ol><li> Aggiungere 1 mM mant-nucleotide marcato a 1 mM cinesina (concentrazioni finali) in un tampone di reazione adeguato. In genere un buffer che beneficia della crescita dei microtubuli e la stabilità è utilizzato (vedi la discussione). Un buffer comunemente usato contiene 80mm piperazina-bis-2-ethanesulfonic acido (TUBI) pH6.9, 1mM MgCl2 e 1mM glicole etilenico-bis-2-acido aminoether tetraacetico (EGTA). Nota: La concentrazione di chinesina indicato in tutti i protocolli si riferisce alla concentrazione di siti di legame del nucleotide (cioè, domini motore). Esistono diverse kinesins come monomeri, dimeri o tetrameri e così possono contenere più di un sito nucleotide-binding per molecola. </li><li> Dopo un periodo di incubazione (1-3 min) e utilizzando un fluorimetro standard, di rilevare lo spettro di emissione per il complesso-nucleotide chinesina mant-etichettati. Utilizzare lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 365nm emisura emessa luce 400-500 nm con incrementi di 1 nm. </li><li> Fare una soluzione di 1mM nucleotide Mant-marcato nello stesso tampone di reazione utilizzato nel passaggio 1.1. </li><li> Misurare lo spettro di emissione per il solo campione mant nucleotide, come precedentemente descritto (vedi punto 1.2). </li><li> Normalizza gli spettri di segnale alla lunghezza d&#39;onda di picco dell&#39;intensità di fluorescenza dello spettro di mant nucleotide in soluzione (cioè senza chinesina) dividendo per questo valore. </li><li> Tracciare lo spettro normalizzato (ad esempio, la Figura 2B) per osservare le differenze di intensità di fluorescenza tra il mantATP-bound e / o mantADP-bound cinesina e mant nucleotide in soluzione. </li></ol> 2 Misura delle costanti di associazione e dissociazione Prezzo della mantATP <ol><li> Per una soluzione di fino a 20 mM cinesina (vedi discussione) in qualsiasi appropriata Mg 2 + tampone -free (ad esempio, 80MM TUBI pH6.9, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), aggiungere 1mM (concentrazione finale) etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 1 mM (concentrazione finale) ditiotreitolo (DTT). Nota: L&#39;aggiunta di Tween20 al buffer è raccomandato in quanto riduce / previene la perdita di proteine ​​cinesina sulla colonna utilizzato per lo scambio di buffer (Piazza di 2.3 e 3.3) </li><li> Incubare la soluzione a 25 ° C per 15 min. </li><li> Separata nucleotide libero e EDTA dalla cinesina utilizzando una colonna di filtrazione G-25 gel Sephadex flusso di gravità in base alle istruzioni del produttore (vedere l&#39;elenco dei materiali). <ol><li> Equilibrare la colonna con almeno 3 volumi di colonna di un adeguato buffer di -free Mg 2 + (vedere il punto 2.1). Caricare la soluzione-cinesina contenente nella colonna. Preparare una provetta di raccolta aggiungendo un volume appropriato di soluzione di cloruro di magnesio 100mM al tubo vuoto, tale che la concentrazione finale di cloruro di magnesio è 1 mM dopo il prelievo della soluzione chinesina. Aggiunta immediata di cloruro di magnesio aiuta StabiliSE il kinesin libero-nucleotide. </li><li> Eluire la cinesina utilizzando un apposito tampone -free Mg 2 +. Kinesine sono instabili quando liberi di nucleotide per cui è importante lavorare velocemente. Conservare il kinesin libero-nucleotide su ghiaccio e consumare entro 1-2 ore. </li></ol></li><li> Durante o prima della preparazione di kinesin libero-nucleotide, preparare una serie concentrazione mantATP nello stesso tampone di reazione come la soluzione finale di kinesin libero-nucleotide. Determinare l&#39;intervallo di concentrazioni di mantATP necessarie in funzione della concentrazione di cinesina disponibile con una serie tipica che varia 0,1-50 mM (vedere il punto 2.5 e discussione). </li><li> Preparare una serie concentrazione di kinesin libero-nucleotide. Per ogni concentrazione di mantATP (punto 2.4), una concentrazione di kinesin libero-nucleotide deve essere preparato in modo tale che il nucleotide mant-marcato è da 5 a 10 volte l&#39;eccesso molare rispetto cinesina nucleotidiche siti di legame. </li><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione sul-flo fermatow fluorimetro a 365 nm e raccogliere emessa luce&gt; 400 nm usando un filtro passa-lungo. </li><li> Partendo con la più bassa concentrazione di mantATP, mescolare il mantATP con una concentrazione adeguata di kinesin libero-nucleotide in un rapporto 1: 1 v / v utilizzando un fluorimetro stopped-flow (Figura 3A e 3B Inset). Nota: I reagenti sono diluiti del 50% al momento della miscelazione. Mantenere una nota della concentrazione nucleotide sia pre che post miscelazione (ad esempio, 3,0 / 1,5 micron) per evitare confusione. </li><li> Montare la variazione di intensità di fluorescenza misurata ad ogni concentrazione di mantATP ad una funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (cioè, Fluorescenza = A 0 .exp (k .t obs) + (m. t + c), dove A 0 è l&#39;ampiezza, obs k è la costante di velocità e t è il tempo, vedi Figura 3B e discussione). Da questi attacchi determinare untasso costante (k obs) ad ogni concentrazione di mantATP. Ogni obs k è una convoluzione di una costante di associazione e di dissociazione frequenza (Figura 1, k 1 ek -1). </li><li> Deconvolve le associazione e dissociazione dei tassi costanti tracciando k oss contro la concentrazione mantATP (ad esempio, Figura 3C). Montare questi dati ad una funzione lineare (cioè, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) per ottenere il gradiente e Y intercetta. Il gradiente rappresenta la costante di velocità di associazione mantATP (Figura 1, k 1) con le unità M -1 s -1. L&#39;intercetta rappresenta la costante di velocità di dissociazione (Figura 1, k -1) con unità di s -1 (vedi la discussione). Nota: Questo approccio può essere applicato anche per determinare l&#39;associazione ADP e dissociazionecostanti di velocità (Figura 1, k -4 e 4 k) utilizzando mantADP come il nucleotide. </li></ol> 3 Misura della dissociazione Costante per mantADP <ol><li> Ad una soluzione di 2 mM kinesina in un tampone di reazione idoneo (ad esempio, TUBI 80 mm pH6.9, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, 0,1% Tween20), aggiungere 50 mM mantADP (concentrazione finale). </li><li> Incubare a 25 ° C per 30 min. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso mantADP e altro nucleotide libero da buffer di scambio la cinesina nel buffer di reazione prescelto utilizzando una colonna Sephadex G-25 (vedere elenco dei materiali) secondo le istruzioni del produttore. Il dominio motore cinesina dovrebbe ora essere caricato con mantADP. </li><li> Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione sul fluorimetro stopped-flow a 365 nm e raccogliere emessa luce&gt; 400 nm usando un filtro passa-lungo. </li><li> Mescolare il complesso mantADP.kinesin (~ 1μM) con un 50 volte o più molar eccesso di ATP non marcato in un rapporto 1: 1 v / v utilizzando un fluorimetro stopped-flow (Figura 4A e 4B Inset). </li><li> Montare la diminuzione di intensità di fluorescenza osservata nel tempo per una singola funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (cioè, Fluorescenza = A 0 .exp (k .t obs) + (m.t + c), dove A 0 è l&#39;ampiezza, obs k è la costante di velocità e t è il tempo, vedere la Figura 4B e discussione). Il obs k determinata da questa forma è la costante di velocità di dissociazione di ADP (figura 1, k 4) con unità di s -1 (vedi la discussione). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Qui, vi presentiamo i protocolli per l&#39;osservazione e l&#39;analisi della cinetica delle transizioni tra gli stati nucleotidiche per una cinesina. Questi protocolli utilizzano il metodo rapida miscelazione stopped-flow in combinazione con nucleotidi fluorescente. Metodi di questo tipo sono stati ampiamente utilizzati per studiare nucleotide vincolante e dissociazione per una varietà di kinesins 9-11,13-16. I metodi descritti non consentono l&#39;osservazione di rilascio fosfato (Figura 1, punto 3). Tuttavia, stopped-flow fluorescenza può essere utilizzata per osservare questa transizione utilizzando una proteina di rilevamento fosfato di accoppiare la produzione di fosfato ad una variazione di intensità di fluorescenza 17. I metodi presentati uso nucleotidi marcati con il piccolo methylanthraniloyl fluoroforo (Mant), che in genere mostrano un aumento di intensità di fluorescenza quando si lega alle proteine. Inoltre, il fluoroforo mant, quando coniugato sia al 2 &#39;o 3&#39; la posizione sulla ribose, spesso ha poco o nessun effetto sulla vincolante, dissociazione o idrolisi del nucleotide 9-12. Nucleotidi Mant-marcati sono facilmente reperibili da fonti commerciali (vedere l&#39;elenco dei materiali) e sono forniti come miscele del 2 &#39;e 3&#39; coniugato quanto rapidamente riequilibrare quando purificato di un singolo isomero 8. Nucleotidi Mant-marcato fare ottimi molecole giornalista con cui si possono osservare le cinetiche di legame del nucleotide e di dissociazione. L&#39;uso di nucleotidi fluorescente significa che la lettura dei saggi descritti è un cambiamento in tempo reale di intensità di fluorescenza. Ciò rende questi saggi ideale per stopped-flow fluorescenza, che permette una rapida miscelazione dei reagenti e l&#39;osservazione in tempo reale delle variazioni di fluorescenza associate alla reazione successiva. La combinazione di stopped-flow come la tecnica di miscelazione e fluorescenza come metodo di rilevamento produce un sistema che è ef relativamente campioneficiente. Ad esempio, per acquisire i dati mostrati nella Figura 3C richiede 0,8-1,0 mg di purificato kinesin-13, MCAK, e di acquisire i dati mostrati nella Figura 4B richiede ~ 0,3 mg di purificato kinesin-13, MCAK. Uno svantaggio dell&#39;uso di mant come fluoroforo è che è incline a photobleaching. Ciò può essere osservato in isolamento da chinesina cinetica di reazione miscelando una soluzione di mant nucleotide marcato con tampone di reazione, in assenza di chinesina, nel flusso fermato. Una lenta diminuzione di intensità di fluorescenza si osserva come il gruppo mant diventa sbiancato. Oltre la gamma di tempi utilizzati nei protocolli descritti photobleaching del gruppo Mant è ben descritto da una funzione lineare. Pertanto, un modo semplice per correggere i dati per fotoscolorimento è per adattarsi ad una funzione esponenziale con una linea di base descritto da una funzione lineare (cioè, m + c) anziché la linea di base piatta più comune, descritto da un singolo parametro. vincolante mantATP Quando si misura costanti di velocità di associazione e dissociazione di mantATP (Sezione 2) l&#39;ADP, che rimane associato al sito nucleotide-binding kinesina in assenza di microtubuli, deve essere rimosso. Questo permette associazione mantATP e dissociazione (Figura 1, punto 1), da osservare in isolamento da dissociazione ADP. Per raggiungere questo obiettivo la chinesina è incubato con almeno un eccesso di 50 volte di EDTA su siti di legame del nucleotide (Passo 2.1). L&#39;EDTA sequestra Mg 2 + ioni causando Mg 2 + a dissociarsi dalla tasca nucleotide-binding, che si traduce nel rilascio del nucleotide 11. Pertanto, nello svolgimento passaggi 2,1-2,3, è indispensabile utilizzare un buffer libero di Mg 2 +. La proteina kinesin libero-nucleotide è buffer di scambio per separarlo sia dal nucleotide libero e da EDTA. Per realizzare questa separazione, un usa e getta a caduta gecolonna l filtrazione è sufficiente ed è semplice e rapido da usare (vedere l&#39;elenco dei materiali). L&#39;interazione di mantATP con nucleotide cinesina libera viene effettuata in un intervallo di concentrazioni mantATP (Passo 2.4) per consentire deconvoluzione delle costanti di associazione e dissociazione dei tassi (punto 2.8). La teoria alla base di esperimenti di questo tipo è ben descritto nel riferimento 18 In esecuzione di questi esperimenti si comincia con la più bassa concentrazione di mantATP. Ciò elimina la necessità di fasi di lavaggio tra diverse concentrazioni. Probabilmente sarà necessario regolare la sensibilità del fluorimetro stopped-flow come concentrazione mantATP viene aumentata. La concentrazione mantATP deve essere sempre superiore di almeno 5 volte rispetto alla concentrazione di cinesina nucleotidiche siti di legame per mantenere condizioni di pseudo primo ordine. Tuttavia, poiché la concentrazione di mantATP viene aumentata, la variazione del segnale può diventare inondato come frazione di nucleotide che si lega a chinesina diminuisce. Therefore, la concentrazione della chinesina è anche aumentato per ogni nuova concentrazione di mantATP tale che la concentrazione di mantATP è mai superiore a 10 volte l&#39;eccesso molare rispetto siti di legame del nucleotide (Passo 2.6). mantADP Dissociazione Sebbene associazione e dissociazione dei tassi costanti per mantADP possono essere determinati con lo stesso metodo descritto per mantATP (sezione 2). La dissociazione di ADP da una cinesina può essere osservata direttamente dal precarico del sito nucleotide-binding con mantADP (Passi 3,1-3,3) Il complesso mantADP.kinesin viene poi mescolato con un eccesso di ATP senza etichetta (punto 3.5). L&#39;eccesso senza etichetta ATP impedisce la rilegatura del mantADP alla cinesina e quindi permette la reazione di dissociazione (Figura 1, k 4) da osservare in isolamento da un&#39;associazione di mantADP. In questo test la concentrazione di ATP non marcato deve essere almeno un eccesso molare di 50 volte di NUCleotide siti di legame. La teoria alla base di questo saggio è ben descritta in riferimento 18. Questo metodo diretto fornisce un valore più preciso per il tasso costante di dissociazione rispetto alla estrapolazione per l&#39;asse y descritto al punto 2.8. Inclusione di microtubuli I metodi descritti possono essere utilizzati per determinare la cinetica di legame nucleotidico e dissociazione in presenza di microtubuli. I microtubuli vengono introdotti alla siringa nucleotide contenente prima della miscela nel flusso fermato: la siringa inferiore nella Figura 3B e 4B (Inserti). In questa configurazione, la chinesina incontrerà il nucleotide allo stesso tempo se corrisponde ai microtubuli. Microtubuli stabilizzati sono utilizzati, in cui la durata del polimero tubulina viene esteso mediante l&#39;uso di una sostanza chimica o stabilizzante, come taxolo, o un analogo GTP nonhydrolysable, come guanosina-5 &#39;- [(α, β) -methyleno] trifosfato (GMPCPP, vedere l&#39;elenco dei materiali). E &#39;possibile utilizzare due cicli di polimerizzazione della tubulina con GMPCPP fare microtubuli che possono essere conservati per molti mesi a 9,19 azoto liquido. L&#39;uso di microtubuli pre-preparati riduce in modo significativo le difficoltà pratiche di esecuzione di tali test. Per includere microtubuli nei saggi, è importante utilizzare un tampone di reazione adatta per la stabilità dei microtubuli. Il buffer di scelta è TUBI based, con il buffer più comunemente usato contenente 80 mM pH 6.9 TUBI, 1 MgCl 2 e 1 EGTA mm mm (noto come BRB80) 20,21. I metodi descritti non sono limitati da utilizzare con kinesins, ma possono essere adattati e applicati a qualsiasi proteina di legame nucleotide. Ad esempio, i metodi simili sono stati applicati al ciclo fatturato ATP dei membri della famiglia miosina di motori molecolari 12,22 e l&#39;uso di mant etichettato nucleotidi guanosina estende ulteriormenteMetodi di questo tipo di idrolizzare proteine ​​GTP 23,24.

Le kinesins sono una superfamiglia di proteine ​​caratterizzate da un dominio motore altamente conservata 1. Il dominio motore cinesina interagisce con i microtubuli in modo nucleotide-dipendente. I membri della famiglia cinesina visualizzano una gamma di funzioni da kinesins translocating, che trasportano merci in modo diretto lungo i microtubuli, a kinesins finali vincolante non translocating microtubuli, che regolano la dinamica dei microtubuli 2,3. Kinesine utilizzano il fatturato di adensosine-5&#39;-trifosfato (ATP) per regolare la loro interazione con il citoscheletro dei microtubuli 4-6. La conformazione del dominio motore chinesina e quindi la sua affinità per il microtubulo dipende dal suo stato di nucleotidi: ATP, ADP, ADP.Pi o nessun nucleotide possono essere vincolati (Figura 1). Per comprendere il meccanismo molecolare di una cinesina, è necessaria una comprensione del rapporto tra il fatturato ATP e l&#39;interazione dei microtubuli. Ilto, è un obiettivo importante nel campo kinesin è quello di caratterizzare le proprietà funzionali dei diversi stati nucleotidi e la cinetica delle transizioni tra di loro sia in presenza che in assenza di microtubuli. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" width="200" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig1highres.jpg" /> Figura 1 Il più semplice ciclo fatturato ATP per una cinesina si compone di quattro possibili stati: (Φ) libero-nucleotide, ATP-bound, ADP.P i -bound e ADP-legato Ognuno dei quattro transizioni è caratterizzato da un in avanti e. costante indietro rate (k x e k -x, rispettivamente). Per capire come il ciclo chimica del fatturato ATP è accoppiata al ciclo meccanico dell&#39;interazione microtubuli, si deve determinare la fase del ciclo fatturato ATP è limitante in assenza di microtubmoduli e quindi determinare come il ciclo è alterata dalla presenza di microtubuli. Il più semplice ciclo di fatturato ATP è costituito da quattro singole fasi chimici: (1) ATP legame al sito vuoto (Φ indica il sito vuoto, cioè, kinesin libero-nucleotide); (2) scissione ATP; (3) dissociazione fosfato e (4) ADP dissociazione (Figura 1). Il fattore limitante imposta la costante di velocità per l&#39;intero ciclo di fatturato ATP. Pertanto, per determinare quale passo è fattore limitante ciascuna delle singole transizioni devono essere misurati e confrontati con la costante di velocità per il ciclo completo. Metodi per misurare il volume d&#39;affari complessivo di ATP costante tasso di ciclo qui non descritti, ma si possono trovare in riferimento 7 Qui, descriviamo i metodi con cui costanti di velocità per i singoli passaggi chimici possono essere determinati. Ci sono un certo numero di metodi disponibili per studiare le singole transizioni nel ciclo di fatturato di una proteina nucleotide idrolizzante. I metodi qui presentati assumono advantage delle proprietà di nucleotidi marcati con il fluoroforo methylanthraniloyl, solitamente indicato come mant, che mostrano un cambiamento di intensità di fluorescenza dopo il legame alla proteina 8. Il gruppo mant è usato perché la sua piccola dimensione significa che, quando accoppiato al ribosio (Figura 2A), si ha in genere poco o nessun effetto sulla cinetica di legame del nucleotide o idrolisi 9-12. Qui, vi presentiamo i protocolli che descrivono l&#39;uso di nucleotidi mant-marcato, in combinato disposto con stopped-flow fluorescenza, per consentire l&#39;osservazione del legame nucleotide e dissociazione nel ciclo fatturato ATP di una cinesina.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Name of Material/Equipment</td>
			<td style="width:147px;">Company</td>
			<td style="width:136px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:279px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;triphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-202</td>
			<td style="width:279px;">mantATP</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">2&#8217;/3&#8217;-(N-methylanthraniloyl) adenosine-5&#8217;-diphosphate&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-201</td>
			<td style="width:279px;">mantADP</td>
		</tr>
		<tr height="134">
			<td height="134" style="height:134px;width:220px;">Mg-ATP</td>
			<td style="width:147px;">Roche</td>
			<td style="width:136px;"># 10519979001</td>
			<td style="width:279px;">The disodium salt of ATP is made to a concentration of 100&#160;mM in 100&#160;mM MgCl2. Concentration should be verified by absorption at 260&#160;nm (e = 15400&#160;M-1cm-1). Solution stored in aliquots at -20&#160;oC.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:147px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP120-500</td>
			<td style="width:279px;">0.5&#160;M stock solution in water, pH 8.0. HAZARD: powder harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:220px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:147px;">Melford</td>
			<td style="width:136px;">MB1015</td>
			<td style="width:279px;">1&#160;M stock solution in water made fresh for use on the same day. HAZARD: powder harmful if inhaled or in contact with the skin.</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:220px;">NAP-5 column</td>
			<td style="width:147px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:136px;"># 17-0853</td>
			<td style="width:279px;">G-25 sephadex resin gravity-flow gel filtration column</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:220px;">GMPCPP</td>
			<td style="width:147px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;"># NU-405</td>
			<td style="width:279px;">nonhydrolysable analogue of GTP</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:220px;">Stopped-flow fluorimeter&#160;</td>
			<td style="width:147px;">Applied Photophysics</td>
			<td style="width:136px;">SX20</td>
			<td style="width:279px;">A fluorimeter with some plumbing attached, which allows reagents to be rapidly mixed in the observation cuvette. Thereby allowing the kinetics of reactions on timescales of ~0.1&#160;-&#160;100&#160;s to be monitored.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of stopped-flow fluorescence and labeled nucleotides to analyze the atp turnover cycle of kinesins

La superfamiglia cinesina di microtubuli associati proteine ​​motrici condividono un dominio motore caratteristica che sia idrolizza ATP e lega i microtubuli. Kinesine mostrano differenze tra la superfamiglia sia in fatturato ATP e nell&#39;interazione microtubuli. Queste differenze personalizzare kinesins specifici per varie funzioni, come il trasporto merci, microtubuli scorrevole, depolimerizzazione dei microtubuli e la stabilizzazione dei microtubuli. Per comprendere il meccanismo di azione di un chinesina è importante capire come il ciclo chimica del fatturato ATP è accoppiata al ciclo meccanico di interazione microtubuli. Per sezionare il ciclo di fatturato ATP, un approccio è quello di utilizzare nucleotidi fluorescente di visualizzare singole fasi del ciclo. Determinazione della cinetica di ogni transizione nucleotide nel ciclo di fatturato ATP permette la tappa limitante o passi per il ciclo completo di identificare. Per un chinesina, è importante conoscere la tappa limitante, inl&#39;assenza di microtubuli, in quanto questo passaggio viene generalmente accelerato diverse migliaia di volte quando la cinesina interagisce con i microtubuli. Il ciclo in assenza di microtubuli viene poi confrontata con quella in presenza di microtubuli per comprendere appieno ATP ciclo fatturato di un chinesina. La cinetica di singoli nucleotidi transizioni sono generalmente troppo veloce per osservare mescolando manualmente reagenti, in particolare in presenza di microtubuli. Un dispositivo di miscelazione rapida, ad esempio un fluorimetro stopped-flow, che permette cinetica da osservare su scale temporali di appena qualche millisecondo, può essere utilizzato per monitorare tali transizioni. Qui, descriviamo i protocolli in cui la rapida miscelazione dei reagenti di stopped-flow viene utilizzato in combinazione con nucleotidi fluorescente a sezionare il ciclo fatturato ATP di una cinesina.

Un aumento di intensità di fluorescenza del gruppo Mant è tipicamente osservato dopo legame del nucleotide Mant-marcato ad una cinesina. Tuttavia, l&#39;entità di tale cambiamento del segnale dipende dalla particolare chinesina in questione. Pertanto, è utile effettuare misurazioni di equilibrio per confermare sia la presenza e l&#39;entità di un cambiamento di intensità di fluorescenza prima di passare al test cinetici. Rappresentativa spettri di fluorescenza per mantATP e mantADP, sia in soluzione che in complesso con il chinesina-13, MCAK, sono mostrati in Figura 2B. Questi dati evidenziano l&#39;aumento di intensità di fluorescenza visualizzata da entrambe mantATP e mantADP sul legame MCAK. Il cambiamento di intensità di fluorescenza in seguito al legame di Mant nucleotide ad una cinesina viene utilizzato per riferire sulla associazione e dissociazione sia di ATP e ADP (sezioni 2 e 3). Nel caso di MCAK, una differenza di intensità di fluorescenza è osservata tra mantATP.kinesin e mantADP.kinesin <sup&gt; 9. Figura 3A illustra la reazione che si verifica su di miscelazione mantATP con kinesin libero-nucleotide. Dati rappresentativi che illustrano l&#39;aumento di intensità di fluorescenza che si verifica dopo il legame del mantATP al kinesin-13, MCAK è mostrato in Figura 3B. I dati del tipo mostrato in Figura 3B è raccolto in un intervallo di concentrazioni mantATP. Una trama delle costanti di velocità (k OB) determinato rispetto alla concentrazione mantATP è mostrato in Figura 3C. Montaggio questi dati ad una funzione lineare (cioè, k obs = k 1 [mantATP] + k -1) permette di deconvoluzione delle costanti di velocità che contribuiscono a k OB (punto 2.8). Pertanto, consentendo di determinare sia l&#39;associazione e la costante di dissociazione per mantATP (Figura 1, k 1 ek <em&gt; -1 rispettivamente). Figura 4A illustra la reazione che si verifica al momento miscelazione mantADP.kinesin con un eccesso di ATP non marcato. I dati in figura 4B mostra la diminuzione dell&#39;intensità di fluorescenza osservata per mantADP sulla dissociazione dal kinesin-13, MCAK. Inserendo questi dati a una funzione esponenziale (Passo 3.6) la costante di velocità di dissociazione di mantADP è determinata direttamente. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig2highres.jpg" /> Figura 2. nucleotidi marcati con il methylanthraniloyl fluoroforo (Mant) vengono utilizzati per isolare le singole fasi del ciclo di fatturato ATP. (A) Struttura del mantATP che mostra la posizione del fluoroforo mant coniugato sia al 2 &#39;o 3&#39; posizione sul ribosio. (B) normalizzato spettri di fluorescenza per mantATP e mantADP in soluzione (maxp) e un mantATPd mantADP in complesso con la cinesina MCAK (MATP + MCAK e MADP + MCAK). Gli spettri mantATP sono normalizzati per la fluorescenza al massimo per mantATP in soluzione e spettri mantADP sono normalizzati a fluorescenza a max per mantADP in soluzione. Gli spettri dei nucleotidi mant mescolati con MCAK sono raccolti in 1 min dopo la miscelazione. La concentrazione dei reagenti e delle impostazioni fluorimetro sono come descritto nel protocollo passi 1.1 e 1.2. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52142/52142fig3highres.jpg" /> Figura 3 Misura della costante di velocità associazione di mantATP. (A) Schema raffigurante la reazione che avviene dopo miscelazione da stopped-flow: mantATP (MATP) si lega a-nucleotide libero cinesina. L&#39;intensità di fluorescenza del gruppo Mant aumenti su legame alla proteina. (B) variazione del segnale di fluorescenza (nero) osservato dopo la miscelazione mantATP (25 M) con MCAK (5 M nulibero-cleotide,). Questo dato è in forma (rossa tratteggiata) per una singola funzione esponenziale più una linea di costante pendenza negativa, che rappresenta photobleaching del fluoroforo Mant (vedi discussione) Inserto:. Contenuto delle siringhe prima della miscelazione sul fluorimetro stopped-flow. (C) costanti di velocità (k OB) stabiliti per la reazione di mantATP con MCAK libero-nucleotide rilevate in concentrazioni di mantATP. Questo terreno avrà una regione lineare con il gradiente è la costante di associazione (Figura 1, k 1) con unità di M -1 s -1 e l&#39;intercetta y è la costante di velocità di dissociazione (Figura 1, k -1) con unità di s -1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> . Figura 4 Misura della costante di velocità di dissociazione per mantADP (A) Schema raffigurante la reazione che avviene dopo miscelazione da stopped-flow: cinesina precaricato con mantADP viene diluito in un eccesso di ATP senza etichetta. Dissociare mantADP è sostituito dal senza etichetta ATP, impedendo così la reazione posteriore di associazione mantADP (vedi la discussione). L&#39;intensità di fluorescenza del gruppo Mant scende sulla dissociazione dalla proteina. Diminuzione (B) fluorescenza osservata sulla dissociazione del mantADP dalla cinesina MCAK. Il segnale di fluorescenza (nero) è in forma (rossa tratteggiata) per un singolo esponenziale più una linea di costante pendenza negativa per spiegare photobleaching del gruppo Mant (vedi la discussione). La costante di velocità determinato è la costante di velocità di dissociazione di mantADP (figura 1, k4) Nel riquadro:.. Contenuto delle siringhe prima della miscelazione su un fluorimetro stopped-flow <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52142/52142fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Use of Stopped-Flow Fluorescence and Labeled Nucleotides to Analyze the ATP Turnover Cycle of Kinesins

Kinesine sono caratterizzati dall&#39;interazione nucleotide-dipendente con microtubuli: un ciclo di fatturato ATP accoppiato ad un ciclo di interazione microtubuli. Qui, descriviamo i protocolli di analizzare la cinetica delle singole transizioni nucleotide nel ciclo fatturato ATP di una cinesina utilizzando nucleotidi fluorescente e stopped-flow fluorescenza.

L&#39;uso di stopped-flow fluorescenza ed etichettati nucleotidi di analizzare il ciclo Fatturato ATP di kinesine

The kinesin superfamily of microtubule associated motor proteins share a characteristic motor domain which both hydrolyses ATP and binds microtubules. ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

15.4K Views.  University of Nottingham.  Kinesine sono caratterizzati dall'interazione nucleotide-dipendente con microtubuli: un ciclo di fatturato ATP accoppiato ad un ciclo di interazione microtubuli. Qui, descriviamo i protocolli di analizzare la cinetica delle singole transizioni nucleotide nel ciclo fatturato ATP di una cinesina utilizzando nucleotidi fluorescente e stopped-flow fluorescenza. 

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Preparation and Use of Samarium Diiodide (SmI2) in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and Ni(II) Salts in the Samarium Barbier Reaction

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of molecular iodine to samarium metal in THF.1,2-3 It is a mild and selective single electron reductant and its versatility is a result of its ability to initiate a wide range of reductions including C-C bond-forming and cascade or sequential reactions. SmI2 can reduce a variety of functional groups including sulfoxides and sulfones, phosphine oxides, epoxides, alkyl and aryl halides, carbonyls, and conjugated double bonds.2-12 One of the fascinating features of SmI-2-mediated reactions is the ability to manipulate the outcome of reactions through the selective use of cosolvents or additives. In most instances, additives are essential in controlling the rate of reduction and the chemo- or stereoselectivity of reactions.13-14 Additives commonly utilized to fine tune the reactivity of SmI2 can be classified into three major groups: (1) Lewis bases (HMPA, other electron-donor ligands, chelating ethers, etc.), (2) proton sources (alcohols, water etc.), and (3) inorganic additives (Ni(acac)2, FeCl3, etc).3
Understanding the mechanism of SmI2 reactions and the role of the additives enables utilization of the full potential of the reagent in organic synthesis. The Sm-Barbier reaction is chosen to illustrate the synthetic importance and mechanistic role of two common additives: HMPA and Ni(II) in this reaction. The Sm-Barbier reaction is similar to the traditional Grignard reaction with the only difference being that the alkyl halide, carbonyl, and Sm reductant are mixed simultaneously in one pot.1,15 Examples of Sm-mediated Barbier reactions with a range of coupling partners have been reported,1,3,7,10,12 and have been utilized in key steps of the synthesis of large natural products.16,17 Previous studies on the effect of additives on SmI2 reactions have shown that HMPA enhances the reduction potential of SmI2 by coordinating to the samarium metal center, producing a more powerful,13-14,18 sterically encumbered reductant19-21 and in some cases playing an integral role in post electron-transfer steps facilitating subsequent bond-forming events.22 In the Sm-Barbier reaction, HMPA has been shown to additionally activate the alkyl halide by forming a complex in a pre-equilibrium step.23
Ni(II) salts are a catalytic additive used frequently in Sm-mediated transformations.24-27 Though critical for success, the mechanistic role of Ni(II) was not known in these reactions. Recently it has been shown that SmI2 reduces Ni(II) to Ni(0), and the reaction is then carried out through organometallic Ni(0) chemistry.28
These mechanistic studies highlight that although the same Barbier product is obtained, the use of different additives in the SmI2 reaction drastically alters the mechanistic pathway of the reaction. The protocol for running these SmI2-initiated reactions is described.

Preparation and Use of Samarium Diiodide SmI2 in Organic Synthesis: The Mechanistic Role of HMPA and NiII Salts in the Samarium Barbier Reaction

A straightforward procedure for the preparation of samarium diiodide (SmI2) in THF is described. The role of two main additives namely hexamethylphosphoramide (HMPA) and Ni(acac)2 in Sm mediated reactions is demonstrated in the Sm-Barbier reaction.

Preparazione ed uso di samario diioduro (SMI<sub&gt; 2</sub&gt;) Nella sintesi organica: il ruolo meccanicistico di HMPA e Ni (II) sali nella reazione Samario Barbier

Although initially considered an esoteric reagent, SmI2 has become a common tool for synthetic organic chemists. SmI2 is generated through the addition of ...

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Chimica

Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization ...

Determining the Ice-binding Planes of Antifreeze Proteins by Fluorescence-based Ice Plane Affinity

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice through their ice-binding surfaces. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modified technique used to determine the ice planes to which the AFPs bind. FIPA is based on the original ice-etching method for determining AFP-bound ice-planes. It produces clearer images in a shortened experimental time. In FIPA analysis, AFPs are fluorescently labeled with a chimeric tag or a covalent dye then slowly incorporated into a macroscopic single ice crystal, which has been preformed into a hemisphere and oriented to determine the a- and c-axes. The AFP-bound ice hemisphere is imaged under UV light to visualize AFP-bound planes using filters to block out nonspecific light. Fluorescent labeling of the AFPs allows real-time monitoring of AFP adsorption into ice. The labels have been found not to influence the planes to which AFPs bind. FIPA analysis also introduces the option to bind more than one differently tagged AFP on the same single ice crystal to help differentiate their binding planes. These applications of FIPA are helping to advance our understanding of how AFPs bind to ice to halt its growth and why many AFP-producing organisms express multiple AFP isoforms.

Antifreeze proteins (AFPs) bind to specific planes of ice to prevent or slow ice growth. Fluorescence-based ice plane affinity (FIPA) analysis is a modification of the original ice-etching method for determination of AFP-bound ice planes. AFPs are fluorescently labeled, incorporated into macroscopic single ice crystals, and visualized under UV light.

Determinazione dei piani di legame del ghiaccio delle proteine antigelo mediante affinità del piano di ghiaccio basata sulla fluorescenza

Antifreeze proteins (AFPs) are expressed in a variety of cold-hardy organisms to prevent or slow internal ice growth. AFPs bind to specific planes of ice ...

The Use of Gas Chromatography to Analyze Compositional Changes of Fatty Acids in Rat Liver Tissue during Pregnancy

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, yielding results with high accuracy and high reproducibility. In metabolic and nutrition studies GC allows assessment of changes in fatty acid concentrations following interventions or during changes in physiological state such as pregnancy. Solid phase extraction (SPE) using aminopropyl silica cartridges allows separation of the major lipid classes including triacylglycerols, different phospholipids, and cholesteryl esters (CE). GC combined with SPE was used to analyze the changes in fatty acid composition of the CE fraction in the livers of virgin and pregnant rats that had been fed various high and low fat diets. There are significant diet/pregnancy interaction effects upon the omega-3 and omega-6 fatty acid content of liver CE, indicating that pregnant females have a different response to dietary manipulation than is seen among virgin females.

Pregnancy leads to significant changes to the fatty acid composition of maternal tissues. Lipid profiles can be obtained via gas chromatography to allow identification and quantification of fatty acids in individual lipid classes among rats fed various high and low fat diets during pregnancy.

L&#39;uso di gas cromatografia per analizzare compositivo Variazioni degli acidi grassi nel fegato di ratto tessuto durante la gravidanza

Gas chromatography (GC) is a highly sensitive method used to identify and quantify the fatty acid content of lipids from tissues, cells, and plasma/serum, ...

Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Basato sulla fluorescenza Monitoraggio dei PAD4 attività tramite un substrato Analog Pro-fluorescenza

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Preparazione e utilizzo di carbeni carbonile-decorate in Attivazione di fosforo bianco

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET radiopharmaceuticals. Due to their multi-day biological half-life, antibodies must be labeled with positron-emitting radionuclides with relatively long physical decay half-lives. Traditionally, the positron-emitting isotopes 124I (t1/2 = 4.18 d), 86Y (t1/2 = 14.7 hr), and 64Cu (t1/2 = 12.7 hr) have been used to label antibodies for PET imaging. More recently, however, the field has witnessed a dramatic increase in the use of the positron-emitting radiometal 89Zr in antibody-based PET imaging agents. 89Zr is a nearly ideal radioisotope for PET imaging with immunoconjugates, as it possesses a physical half-life (t1/2 = 78.4 hr) that is compatible with the in vivo pharmacokinetics of antibodies and emits a relatively low energy positron that produces high resolution images. Furthermore, antibodies can be straightforwardly labeled with 89Zr using the siderophore-derived chelator desferrioxamine (DFO). In this protocol, the prostate-specific membrane antigen targeting antibody J591 will be used as a model system to illustrate (1) the bioconjugation of the bifunctional chelator DFO-isothiocyanate to an antibody, (2) the radiosynthesis and purification of a 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate, and (3) in vivo PET imaging with an 89Zr-DFO-mAb radioimmunoconjugate in a murine model of cancer.

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Due to its multi-day radioactive half-life and favorable decay properties, the positron-emitting radiometal 89Zr is extremely well-suited for use in antibody-based radiopharmaceuticals for PET imaging. In this protocol, the bioconjugation, radiosynthesis, and preclinical application of 89Zr-labeled antibodies will be described.

Il bioconjugation e radiosintesi di<sup&gt; 89</sup&gt; Anticorpi Zr-DFO-etichettati

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Visualization of Ambient Mass Spectrometry with the Use of Schlieren Photography

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass spectrometer, it is necessary to characterize and understand the physical principles of the source. Most commercial ambient ionization sources utilize jets of nitrogen, helium, or atmospheric air to facilitate the ionization of the analyte. As a consequence, schlieren photography can be used to visualize the gas streams by exploiting the differences in refractive index between the streams and ambient air for visualization in real time. The basic setup requires a camera, mirror, flashlight, and razor blade. When properly configured, a real time image of the source is observed by watching its reflection. This allows for insight into the mechanism of action in the source, and pathways to its optimization can be elucidated. Light is shed on an otherwise invisible situation.

This paper presents a protocol for the visualization of gaseous streams of an ambient ionization source using schlieren photography and mass spectrometry.

Visualizzazione di ambiente spettrometria di massa con l&#39;uso della fotografia Schlieren

This manuscript outlines how to visualize mass spectrometry ambient ionization sources using schlieren photography. In order to properly optimize the mass ...

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient radiolabeling of DBCO-group-functionalized gold nanoparticles using a copper-free click reaction. Radioiodination of the stannylated precursor (2) was carried out by using [125I]NaI and chloramine T as an oxidant at room temperature for 15 min. After HPLC purification of the crude product, the purified 125I-labeled azide (1) was obtained with high radiochemical yield (75 &plusmn; 10%, n = 8) and excellent radiochemical purity (&gt;99%). For the synthesis of radiolabeled 13-nm-sized gold nanoparticles, the DBCO-functionalized gold nanoparticles (3) were prepared by using a thiolated polyethylene glycol polymer. A copper-free click reaction between 1 and 3 gave the 125I-labeled gold nanoparticles (4) with more than 95% of radiochemical yield as determined by radio-thin-layer chromatography (radio-TLC). These results clearly indicate that the present radiolabeling method using a strain-promoted copper-free click reaction will be useful for the efficient and convenient radiolabeling of DBCO-group-containing nanomaterials.

An Optimized Protocol for the Efficient Radiolabeling of Gold Nanoparticles by Using a 125I-labeled Azide Prosthetic Group

A detailed procedure for the synthesis of a 125I-labeled azide and the radiolabeling of dibenzocyclooctyne (DBCO)-group-conjugated, 13-nm-sized gold nanoparticles using a copper-free click reaction is described.

Un protocollo ottimizzato per la radiomarcatura efficiente di oro nanoparticelle utilizzando un<sup&gt; 125</sup&gt; Azide gruppo I-etichettati protesico

Here, we demonstrate a detailed protocol for the radiosynthesis of a 125I-labeled azide prosthetic group and its application to the efficient ...

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Preparazione e valutazione di<sup&gt; 99m</sup&gt; Tc marcato tridentate chelati di pre-targeting Utilizzando Bioorthogonal Chimica

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the ...