The authors would like to acknowledge the Infectious Disease Department at Brigham and Women&#8217;s Hospital especially Michael S. Calderwood, MD, MPH for helping us construct this protocol. We would also like to thank the Institution&#8217;s endoscopy center and it&#8217;s leadership team for their support.

NOTA: Al momento della pubblicazione del manoscritto di un Investigational New Drug (IND) applicazione non è necessario eseguire un FMT per CDI ricorrente nella pratica clinica. Tuttavia, se FMT vengono eseguite come parte di uno studio o per un&#39;altra indicazione, un IND o un&#39;applicazione equivalente può essere richiesto 18. Agenzie di regolamentazione probabilmente continueranno a valutare la sicurezza e l&#39;efficacia di FMT applicata alle condizioni mediche CDI e altri e così si consiglia di verificare i requisiti normativi del proprio rispettivo luogo prima dell&#39;inizio di un programma FMT ed ogni uno o due mesi dopo eseguendo attivamente FMT. I candidati NOTA devono essere disposti a consentire il trapianto fecale e la colonscopia. 1. Identificazione di candidati idonei per FMT <ol><li> I pazienti che hanno recidivante CDI o pazienti con malattia refrattaria che non risponde agli antibiotici tradizionali sono appropriate candidati FMT. NOTA: recidivante CDI è definita come una storia di tre o più episodi di CDI confermati da test tossina o PCR, o due episodi che hanno richiesto il ricovero in ospedale. </li><li> Assicurarsi che il paziente è in grado di sottoporsi a una colonscopia in modo sicuro. Ciò è a discrezione della endoscopista. </li></ol> 2. Sgabello selezione dei donatori NOTA: selezione donatori feci applica al trattamento di CDI e può non essere applicabile al trattamento di altri disturbi. <ol><li> Assicurarsi che il paziente identifica un donatore. I potenziali donatori devono essere presenti con il destinatario, al momento della prima visita clinica di gastroenterologia. I donatori possono essere coniugi, familiari o amici. I donatori possono vivere nella stessa casa, come il destinatario a condizione che siano soddisfatti gli altri criteri. </li></ol> 3. donatori Ammissibilità <ol><li> Criteri di inclusione: garantire che il donatore è un adulto sano (≥18 anni) e ha un quotidiano formato intestinale movement. </li><li> Criteri di esclusione: <ol><li> Assicurarsi che il donatore non sta prendendo antibiotici o non ha preso antibiotici nei tre precedenti mesi o qualsiasi farmaco per un&#39;infezione. </li><li> Assicurarsi che il donatore non ha una storia di stipsi o di usare lassativi cronicamente. Inoltre, assicurarsi il donatore non ha una storia di malattia infiammatoria intestinale, diarrea cronica, colite microscopica, una storia personale di intestinale / neoplasie del colon, o una storia di bypass gastrico / altra perdita di peso chirurgia. </li><li> Assicurarsi che il donatore non ha recentemente viaggiato (negli ultimi tre mesi) per una zona in cui la diarrea infettiva è una preoccupazione. Se hanno viaggiato e vissuto diarrea devono ESSERE ESCLUSA. </li><li> Assicurarsi che il donatore non sta prendendo agenti immunosoppressivi e non è in chemioterapia sistemica. </li><li> Assicurarsi che il donatore non ha la sindrome metabolica, malattie autoimmuni o malattie atopiche. </li></ol></li><li> Ottenere con scrittainviato dal donatore e ricevente prima dello screening data la natura sensibile dei test di screening. Rassicurare entrambe le parti che i risultati dei test non saranno condivisi con l&#39;altra parte. </li></ol> 4. Screening NOTA: Questo protocollo di screening è stato adattato per i pazienti al Brigham and Women Hospital in Massachusetts, USA consideri consultazione della infettive reparto malattie e il controllo delle infezioni ospedaliere prima di iniziare il protocollo FMT per assicurarsi che tutti i test di screening del caso sono stati considerati. <ol><li> Destinatario: <ol><li> Al momento della visita iniziale clinica, inviare i seguenti test di laboratorio per lo screening del destinatario (per stabilire test di base per queste malattie infettive e per garantire che non vi è alcun problema di trasmissione in futuro). </li><li> Eseguire epatite A (IgG e IgM), epatite B (HBsAg / Ab e HBcAb), epatite C Ab, HIV-1/2 (Ab e carica virale) e sifilide (TP-IgG) laboratorio di sangue tEST. </li><li> Ottenere una storia completa di allergie alimentari in questa valutazione iniziale. </li></ol></li><li> Donatore: <ol><li> Coordinare con il laboratorio di microbiologia, prima di screening per assicurare feci formate non viene scartata. </li><li> Ordinare i test di laboratorio per lo screening dei donatori di seguito se il donatore soddisfi i criteri di ammissibilità di cui al punto 3. </li><li> Eseguire epatite A (IgG e IgM), epatite B (HBsAg / Ab e HBcAb), epatite C Ab, HIV-1/2 (Ab e viral load) e sifilide (TP-IgG) analisi del sangue in laboratorio. </li><li> Eseguire C. difficile (dalla cultura), la cultura feci di routine, l&#39;antigene Giardia, l&#39;antigene Cryptosporidium e ovuli e parassiti prove di feci di laboratorio. </li><li> Schermo il donatore non più di 30 giorni, ma preferibilmente 1 - 2 settimane prima della procedura pianificata. NOTA: Se il donatore si sviluppa diarrea o liquido feci non sono più eleggibili per la donazione. </li></ol></li><li> Counsel il donatore su cibi da evitare basata suallergie alimentari del destinatario. Il donatore non deve ingerire alimenti a cui il destinatario è allergica per i 5 giorni prima della donazione. </li></ol> 5. Pre-procedura di preparazione <ol><li> Destinatario: <ol><li> Alla prima visita clinica, se il destinatario non è già acceso vancomicina orale, iniziare vancomicina 125 mg ogni 6 ore per almeno sette a dieci giorni prima della procedura. </li><li> Fornire il destinatario con le istruzioni del centro di endoscopia per la preparazione intestinale pre-colonscopia per essere fatto il giorno prima della procedura prevista. I destinatari devono anche seguire le istruzioni standard di alimentari del centro di endoscopia per la settimana prima della procedura. </li><li> Istruire al destinatario di prendere la loro ultima dose di vancomicina la notte prima della procedura. </li></ol></li><li> Donatore: <ol><li> Fornire il donatore con parecchie tazze di raccolta delle feci. Inserti igienica (cappelli) e tazze con l&#39;etichetta del destinatario, nonché 3 sp vuotoecimen contenitori. Chiedi il donatore per iniziare non raccolta feci più di 6 ore prima del trattamento (tempo di procedura). NOTA: Se il donatore fornisce più campioni di feci, dovrebbero essere etichettati con date e orari. Utilizzare il campione fresco (una tazza campione riempita sarà sufficiente). </li><li> Assicurarsi che il destinatario di porta campione di feci del donatore con loro per la procedura. </li><li> Conservare i campioni di feci a temperatura ambiente. Escludere qualsiasi feci informe. Scartare qualsiasi feci inutilizzato in un sistema fognario (a meno che il risparmio per scopi di ricerca). </li></ol></li></ol> 6. Sgabello Preparazione NOTA: Assicurarsi che questa procedura viene discusso e approvato dal dipartimento di controllo delle infezioni dell&#39;ospedale. <ol><li> Indossare indumenti protettivi per la preparazione del feci. </li><li> Preparare sgabello in camera endoscopica in una zona di lavoro designato in cui vi è una zona spruzzata diciotto pollici che impedisce la contaminazione OTHmateriali er. </li><li> Prima di sgabello preparazione, pulire l&#39;area designata con un disinfettante ospedaliero approvato. </li><li> Coprire l&#39;area con un tampone monouso per evitare la contaminazione. </li><li> Trasferire il feci formate in un quattordici once singola velocità frullatore e aggiungere 500 cc di soluzione fisiologica. </li><li> Miscela il contenuto per almeno un minuto o fino a raggiungere una consistenza barbottina liquida. Fare attenzione per evitare perdite durante la rimozione del coperchio del frullatore. </li><li> Versare la soluzione attraverso il filtro in un bacino otto quarto di gallone britannico plastica per eliminare eventuali residui solidi. Eliminare il filtro. </li><li> Aspirare la soluzione tesa in 60 cc siringhe luer lock (circa otto-nove per un FMT standard con colonscopia). Redigere un extra di 60 cc di soluzione fisiologica per le vampate. </li></ol> 7. Trapianto fecale tramite colonscopia <ol><li> Indossare dispositivi di protezione individuale secondo le polizze unit endoscopia durante l&#39;esecuzione o l&#39;assistenza con il infusion. </li><li> Considerate leggera sedazione, se possibile, in modo che il paziente può essere in grado di cooperare con mantenendo le feci dopo la procedura. </li><li> Eseguire una colonscopia per l&#39;ileo terminale (o, per quanto tecnicamente possibile). All&#39;inserimento della colonscope, lavaggio e di aspirazione feci qualsiasi liquido residuo. </li><li> Ispezionare le pareti mucose per la prova di infiammazione della mucosa, ma biopsie non sono di routine eseguite durante la procedura FMT. NOTA: Determinare se una colonscopia completa è sicuro a causa del grado di infiammazione. In caso contrario, prendere in considerazione una sigmoidoscopia flessibile più limitata con infusione (utilizzare la metà del liquame feci). </li><li> Infondere 60 cc (una siringa) una volta nel ileo terminale attraverso il canale bioptico del colonscopio con il tappo del canale biopsia con tubi di estensione. </li><li> Tra le applicazioni di siringhe feci, irrigare il canale con soluzione fisiologica per evitare intasamenti. </li><li> Infondere un 60 cc di feci in cieco e ripetere nella destra colon. </li><li> Continuare infondendo 30 cc ogni cinque-dieci cm seguendo distribuire uniformemente lo slurry sui quattro quadranti murali colon fino al colon trasverso metà è raggiunto. Ricordarsi di irrigare con soluzione salina tra siringhe feci. NOTA: Se lo slurry è molto viscoso può essere necessario spingere con forza considerevole sulla siringa. Fare attenzione che il tappo del canale biopsia non separa dal colonscopio e causare la fuoriuscita del contenuto di feci. Lavaggio frequente consentirà per facilitare il passaggio della barbottina. Se vi è continuata difficoltà nello spingere l&#39;impasto, non ri-tendendo sgabello donatore rimanente per la seconda volta o diluendo ulteriormente con soluzione fisiologica. </li><li> Aspirare aria in eccesso al momento della revoca quando si cambia siringhe facendo attenzione a non aspirare qualsiasi feci liquide. NOTA: Se il paziente ha conosciuto l&#39;incontinenza fecale, l&#39;ultima siringa deve essere infusa non inferiore flessura epatica per evitare perdite durante e procedura di post. </li><li> Una volta the colonscopia con FMT è completa, consigliare al paziente di trattenere le feci più a lungo possibile. Essi possono riprendere la loro dieta regolare ed i farmaci due ore dopo la colonscopia è completa. </li></ol> 8. La colonscopia con FMT Clean Up <ol><li> Eseguire attrezzature procedura di post ritrattamento, ambiente pulizia / disinfezione e smaltimento dei rifiuti come da protocollo ospedaliero. </li><li> Smaltire tutto il materiale fecale nel contenitore rischio biologico appropriata. </li><li> Portare il colonscopio per l&#39;area di decontaminazione per l&#39;elaborazione di routine secondo la procedura standard. </li><li> Smaltire il frullatore e filtro con qualsiasi altro rifiuto sporchi. NOTA: Se miscelatori monouso e filtri non sono realizzabili in un supplente singola istituzione metodi di miscelazione possono essere considerati. Un esempio: il passaggio lo sgabello attraverso un Schiacciapatate in acciaio inox che può essere pulito in autoclave. Si consiglia di discutere di tutte le modalità possibili con il controllo delle infezioni dep della vostra strutturaartment. </li><li> Decontaminare tutte le superfici che sono stati utilizzati per la procedura utilizzando i prodotti degli impianti approvati. </li></ol> 9. Follow Up <ol><li> Organizzare un appuntamento di follow-up in clinica di gastroenterologia per il paziente circa 30 giorni dopo la FMT. </li><li> Counsel il paziente circa il rischio di recidiva C. difficile con corsi futuri di antibiotici. </li></ol> 10. segnalazione di eventi avversi <ol><li> Sebbene FMT è considerato una procedura sicura, si consiglia vivamente di tenere traccia di tutti gli eventi avversi sentivano di essere associati con la procedura e di segnalarli alle opportune schede di regolamentazione. </li><li> Per documentare la sicurezza a lungo termine di FMT, tenere un database affidabile che può essere interrogato periodicamente. </li></ol>

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S., Khoruts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidance+on+preparing+an+investigational+new+drug+application+for+fecal+microbiota+transplantation+studies.">Guidance on preparing an investigational new drug application for fecal microbiota transplantation studies.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 283-288 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose relevant to the material presented in this manuscript.

Trapianti fecali hanno dimostrato di essere un trattamento efficace e sicuro per CDI ricorrente. Abbiamo delineato un protocollo standard per FMT via colonscopia e compreso i nostri risultati per 22 pazienti che hanno subito la procedura per CDI ricorrente. I nostri risultati finora sono paragonabili ai dati pubblicati per la malattia recidivante con un solo paziente ricorre un mese dopo FMT. Un passaggio fondamentale della procedura è la visita preselezione per garantire che il donatore sia idoneo e che il pa...

Trapianti fecali per il trattamento della colite pseumembranous sono stati descritti nel 1958 1. Tuttavia, i rapporti di ingestione feci per il trattamento di intossicazione alimentare e di grave diarrea data indietro già nel quarto secolo la Cina 2. Il trapianto microbiota fecale (FMT) è anche definito nella letteratura &quot;bacteriotherapy fecale&quot;, &quot;infuso probiotici umana&quot;, &quot;trapianto sgabello&quot;, &quot;restauro microbioma intestinale&quot;, e &quot;trasferimento fecale&quot;. Si prevede la raccolta sgabello da un sano, donatore pre-screening e la distribuzione di una sospensione preparata nel tratto gastrointestinale del destinatario tramite sondino nasogastrico, esophagogastricduodenoscopy, colonscopia o clistere 3. Molte serie di casi hanno segnalato l&#39;efficacia della somministrazione via NGT e clistere, comunque più recente studi hanno dimostrato che la somministrazione di feci di donatori attraverso una colonscopia è sicuro ed altamente efficace 4.Mentre sono stati segnalati altri metodi quali l&#39;amministrazione sondino nasogastrico, la consegna delle feci dei donatori tramite colonscopia ha effetti collaterali meno immediati (ad esempio, gonfiore addominale e nausea) 4 e abbiamo trovato che i pazienti sono più accettare il concetto di FMT quando viene eseguita da colonscopia. Uno dei vantaggi terapeutici di FMT tramite colonscopia è la riduzione della biomassa colon dovuto al lavaggio intestinale che viene eseguita prima della procedura 4. Diversi studi hanno studiato il ruolo di FMT per il trattamento della colite e diarrea provocata dalla opportunistica patogeno C. difficile (CDI). L&#39;incidenza di CDI continua ad aumentare ed è una delle principali cause di morbilità e mortalità con un grande onere economico di tutto il mondo. Trattamento di prima linea per la CDI consiste di terapia antibiotica, ma i tassi di recidiva sono stati segnalati tra il 15-35% 5. Diverse serie di casi e rapporti hanno farecumented la sicurezza e l&#39;efficacia di FMT per CDI refrattaria al trattamento medico standard con antibiotici 4,6-16. Uno studio guardando lungo follow up termine dei pazienti dopo FMT via colonscopia per CDI ha riportato un tasso di guarigione del 91% primaria in 77 pazienti 17. Presso il nostro Centro (Brigham e divisione femminile Hospital di Gastroenterologia, Epatologia e endoscopia), abbiamo avviato un programma di trapianto fecale per i pazienti con recidiva o refrattaria CDI. Candidati appropriati sono definiti come pazienti che hanno ricorrenti CDI (una storia di 3 o più episodi, o 2 episodi che hanno richiesto ospedalizzazione), o pazienti con malattia refrattaria che non risponde agli antibiotici tradizionali. Crediamo che un approccio sistematico per tutte le fasi di questa procedura massimizza l&#39;efficacia. In questo manoscritto e video che accompagna, abbiamo dettaglio il protocollo che abbiamo impiegato presso il nostro Centro, che comprende il paziente e donatore di screening, la preparazione feci, e la consegna di feci unt il tempo di colonscopia. Questo metodo ha dato risultati positivi comparabili alla letteratura pubblicata. CASE PRESENTAZIONE: Questo paziente rappresenta un tipico paziente di cui per il trapianto fecale. Il paziente è una donna di 69 anni di età con una storia di leucemia linfocitica cronica che aveva recidiva della malattia che richiede un ulteriore trattamento con la chemioterapia. Soffriva di tre episodi di CSI l&#39;anno scorso, ed è stato pertanto sottoposto alla nostra clinica per un corrispettivo di FMT precedente chemioterapia di ri-iniziare. Il suo primo episodio di CSI si è verificato nel mese di ottobre 2012. Non aveva avuto antibiotici precedenti. Lei era molto malato in terapia intensiva dopo aver presentato con shock settico e subito deviare ileostomia ciclo con anterograda vancomicina clisteri per un corso di sei settimane in combinazione con vancomicina orale data la gravità della sua malattia. Ha fatto molto bene con la risoluzione della sua diarrea e lei era in grado di venireantibiotici off. Ha sviluppato un ernia intorno a lei stoma così è stato invertito. Poco dopo l&#39;inversione stomia ha ancora sviluppato diarrea ed è stato ritrovato ad essere C. tossina difficile positivo. Ha completato un corso di 6 settimana di vancomicina per via orale ed è riuscito a diminuire di esso con successo. Tuttavia alcuni mesi dopo, ha ancora una volta sviluppato diarrea, che era C. tossina difficile positivo ed è stato iniziato il suo terzo corso di vancomicina orale. Stava facendo bene antibiotici quando è stato osservato che il suo conteggio bianco aumentato a&gt; 100 e ha trovato ad avere una ricaduta della sua CLL sulla biopsia del midollo osseo. I suoi oncologi erano preoccupati per iniziare la chemioterapia senza una completa risoluzione del suo CDI e così ci hanno chiesto di eseguire FMT.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:121px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:355px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="92">
			<td height="92" style="height:92px;width:247px;">Blender</td>
			<td style="width:121px;">Hamilton Beach</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:355px;">http://www.amazon.com/Hamilton-Beach-51101-Personal-Blender/dp/B00065L6CU/ref=pd_sim_k_2?ie=UTF8&#38;refRID=1Q06MXAE9XKTB4QG0AEN</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:247px;">Strainer</td>
			<td style="width:121px;">Winco MS3A-8S Strainer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:355px;">http://www.amazon.com/Winco-MS3A-8S-Strainer-Single-Wooden/dp/B001VZ5E40/ref=sr_1_3?s=home-garden&#38;ie=UTF8&#38;qid=1395001295&#38;sr=1-3&#38;keywords=kitchen+strainer+wooden+handle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Disposable pads (chux), 17in x 24in.&#160;</td>
			<td>hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>one package&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Pink rectangular hospital standard wash basin, 8 quart&#160;</td>
			<td>hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>1 or 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">500 cc bottle of sterile normal saline</td>
			<td style="width:121px;">hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">60cc leur lock syringes</td>
			<td style="width:121px;">hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>8 or 9</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Biopsy channel cap with extension</td>
			<td style="width:121px;">hospital standard</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal microbiota transplantation via colonoscopy for recurrent c. difficile infection

Fecale Microbiota Trapianti (FMT) è un trattamento sicuro ed altamente efficace per ricorrenti e refrattari C. infezione difficile (CDI). Vari metodi di somministrazione FMT sono stati riportati in letteratura tra cui sondino nasogastrico, endoscopia superiore, clistere e la colonscopia. FMT via produce colonscopia eccellenti tassi di guarigione ed è anche ben tollerato. Abbiamo trovato che i pazienti trovano questa una modalità accettabile e tollerabile di consegna. Presso il nostro Centro, abbiamo avviato un programma di trapianto fecale per i pazienti con recidiva o refrattaria CDI. Abbiamo sviluppato un protocollo utilizzando un processo iterativo di revisione e hanno effettuato 24 trapianti fecali di 22 pazienti con tassi di successo paragonabile alla letteratura pubblicata corrente. Un approccio sistematico per lo screening dei pazienti e dei donatori, la preparazione delle feci, e la consegna delle feci massimizza successo terapeutico. Qui noi dettaglio ogni fase del protocollo FMT che può essere effettuata in qualsiasi endoscopiacentrare con un elevato grado di sicurezza e di successo.

Abbiamo effettuato 24 FMT su 22 pazienti presso il nostro Centro (Tabella 1) utilizzando il protocollo di cui sopra. Nove pazienti avevano IBD concomitante (sei con la malattia di Crohn e tre con colite ulcerosa). Tutti e nove avevano risoluzione del CDI. Uno dei pazienti con malattia di Crohn era stato inviare una colectomia totale per la colite di Crohn. Inizialmente subito FMT tramite colonscopia tuttavia dopo aver sperimentato una recidiva due settimane dopo FMT ha subito un secondo FMT tramite endo...

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Fecal Microbiota Transplantation via Colonoscopy for Recurrent C. difficile Infection

Fecale Microbiota trapianto mediante colonscopia è un trattamento sicuro ed efficace per l&#39;infezione da C. difficile ricorrenti e refrattari. Un approccio sistematico al paziente e lo screening dei donatori, la preparazione delle feci, e la consegna delle feci durante la colonscopia si massimizzare il successo terapeutico.

Fecale Microbiota trapianto via colonscopia per Recurrent<em&gt; C. difficile</em&gt; Infezione

Fecal Microbiota Transplantation (FMT) is a safe and highly effective treatment for recurrent and refractory C. difficile infection (CDI). Various methods ...

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Fecal Microbiota Transplantation via Colonoscopy for Recurrent C. difficile Infection

27.0K Views.  Brigham and Women‘s Hospital.  Fecale Microbiota trapianto mediante colonscopia è un trattamento sicuro ed efficace per l'infezione da C. difficile ricorrenti e refrattari. Un approccio sistematico al paziente e lo screening dei donatori, la preparazione delle feci, e la consegna delle feci durante la colonscopia si massimizzare il successo terapeutico. 

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A Mouse Model of in Utero Transplantation

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus. For example, in utero transplantation (IUT) of hematopoietic stem cells has been used to successfully treat patients with severe combined immunodeficiency.1,2 In several other conditions, however, IUT has been attempted without success.3 Given these mixed results, the availability of an efficient non-human model to study the biological sequelae of stem cell transplantation and gene therapy is critical to advance this field. We and others have used the mouse model of IUT to study factors affecting successful engraftment of in utero transplanted hematopoietic stem cells in both wild-type mice4-7 and those with genetic diseases.8,9 The fetal environment also offers considerable advantages for the success of in utero gene therapy. For example, the delivery of adenoviral10, adeno-associated viral10, retroviral11, and lentiviral vectors12,13 into the fetus has resulted in the transduction of multiple organs distant from the site of injection with long-term gene expression. in utero gene therapy may therefore be considered as a possible treatment strategy for single gene disorders such as muscular dystrophy or cystic fibrosis. Another potential advantage of IUT is the ability to induce immune tolerance to a specific antigen. As seen in mice with hemophilia, the introduction of Factor IX early in development results in tolerance to this protein.14 
In addition to its use in investigating potential human therapies, the mouse model of IUT can be a powerful tool to study basic questions in developmental and stem cell biology. For example, one can deliver various small molecules to induce or inhibit specific gene expression at defined gestational stages and manipulate developmental pathways. The impact of these alterations can be assessed at various timepoints after the initial transplantation. Furthermore, one can transplant pluripotent or lineage specific progenitor cells into the fetal environment to study stem cell differentiation in a non-irradiated and unperturbed host environment.
The mouse model of IUT has already provided numerous insights within the fields of immunology, and developmental and stem cell biology. In this video-based protocol, we describe a step-by-step approach to performing IUT in mouse fetuses and outline the critical steps and potential pitfalls of this technique.

A Mouse Model of in Utero Transplantation

The mouse model of in utero transplantation is a versatile tool that can be used to study the potential clinical applications of stem cell transplantation and gene therapy in the fetus. In this protocol, we present a general approach to performing this technique

Un modello murino di Nell&#39;utero Trapianto

The transplantation of stem cells and viruses in utero has tremendous potential for treating congenital disorders in the human fetus.  For example, in ...

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex infezione Vivo del tessuto Live con virus oncolitici

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Intraspinal Cell Transplantation for Targeting Cervical Ventral Horn in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Traumatic Spinal Cord Injury

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) cases 1 and is the ultimate cause of death in patients with the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS) 2.
ALS is a devastating neurological disorder that is characterized by relatively rapid degeneration of upper and lower motor neurons. Patients ultimately succumb to the disease on average 2-5 years following diagnosis because of respiratory paralysis due to loss of phrenic motor neuron innnervation of the diaphragm 3. The vast majority of cases are sporadic, while 10% are of the familial form. Approximately twenty percent of familial cases are linked to various point mutations in the Cu/Zn superoxide dismutase 1 (SOD1) gene on chromosome 21 4. Transgenic mice 4,5 and rats 6 carrying mutant human SOD1 genes (G93A, G37R, G86R, G85R) have been generated, and, despite the existence of other animal models of motor neuron loss, are currently the most highly used models of the disease.
Spinal cord injury (SCI) is a heterogeneous set of conditions resulting from physical trauma to the spinal cord, with functional outcome varying according to the type, location and severity of the injury 7. Nevertheless, approximately half of human SCI cases affect cervical regions, resulting in debilitating respiratory dysfunction due to phrenic motor neuron loss and injury to descending bulbospinal respiratory axons 1. A number of animal models of SCI have been developed, with the most commonly used and clinically-relevant being the contusion 8.
Transplantation of various classes of neural precursor cells (NPCs) is a promising therapeutic strategy for treatment of traumatic CNS injuries and neurodegeneration, including ALS and SCI, because of the ability to replace lost or dysfunctional CNS cell types, provide neuroprotection, and deliver gene factors of interest 9.
Animal models of both ALS and SCI can model many clinically-relevant aspects of these diseases, including phrenic motor neuron loss and consequent respiratory compromise 10,11. In order to evaluate the efficacy of NPC-based strategies on respiratory function in these animal models of ALS and SCI, cellular interventions must be specifically directed to regions containing therapeutically relevant targets such as phrenic motor neurons. We provide a detailed protocol for multi-segmental, intraspinal transplantation of NPCs into the cervical spinal cord ventral gray matter of neurodegenerative models such as SOD1G93A mice and rats, as well as spinal cord injured rats and mice 11.

Neural precursor transplantation is a promising strategy for protecting and/or replacing lost/dysfunctional cervical phrenic motor neurons in spinal cord injury (SCI) and the motor neuron disorder, amyotrophic laterals sclerosis (ALS). We provide a protocol for cell delivery to cervical spinal cord ventral horn in rodent models of ALS and SCI.

Intraspinale trapianto di cellule cervicali targeting per corno ventrale nella Sclerosi Laterale Amiotrofica e le lesioni traumatiche del midollo spinale

Respiratory compromise due to phrenic motor neuron loss is a debilitating consequence of a large proportion of human traumatic spinal cord injury (SCI) ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Small bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with short gut syndrome and failure of parenteral nutrition (irreversible intestinal failure). In specialized centers improved operative and managing strategies have led to excellent short- and intermediate term patient and graft survival while providing high quality of life 1,3. Unlike in the more common transplantation of other solid organs (i.e. heart, liver) many underlying mechanisms of graft function and immunologic alterations induced by intestinal transplantation are not entirely known6,7. Episodes of acute rejection, sepsis and chronic graft failure are the main obstacles still contributing to less favorable long term outcome and hindering a more widespread employment of the procedure despite a growing number of patients on home parenteral nutrition who would potentially benefit from such a transplant. The small intestine contains a large number of passenger leucocytes commonly referred to as part of the gut associated lymphoid system (GALT) this being part of the reason for the high immunogenity of the intestinal graft. The presence and close proximity of many commensals and pathogens in the gut explains the severity of sepsis episodes once graft mucosal integrity is compromised (for example by rejection). To advance the field of intestinal- and multiorgan transplantation more data generated from reliable and feasible animal models is needed. The model provided herein combines both reliability and feasibility once established in a standardized manner and can provide valuable insight in the underlying complex molecular, cellular and functional mechanisms that are triggered by intestinal transplantation. We have successfully used and refined the described procedure over more than 5 years in our laboratory 8-11. The JoVE video-based format is especially useful to demonstrate the complex procedure and avoid initial pitfalls for groups planning to establish an orthotopic rodent model investigating intestinal transplantation.

Small bowel transplantation has become an accepted treatment option for patients with irreversible intestinal failure. Our experimental model of orthotopic small bowel transplantation in rats serves as a reliable tool to address underlying immunologic and inflammatory processes that complicate intestinal transplantation.

Ortotopico di intestino tenue di ratti

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

Bronchoalveolar Lavage (BAL) for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove nonadherent cells and lung lining fluid from the mucosal surface. In research environments, BAL allows sampling of innate (lung macrophage), cellular (B- and T- cells), and humoral (immunoglobulin) responses within the lung.
BAL is internationally accepted for research purposes and since 1999 the technique has been performed in &#62; 1,000 subjects in the UK and Malawi by our group.
Our technique uses gentle hand-held suction of instilled fluid; this is designed to maximize BAL volume returned and apply minimum shear force on ciliated epithelia in order to preserve the structure and function of cells within the BAL fluid and to preserve viability to facilitate the growth of cells in ex vivo culture. The research technique therefore uses a larger volume instillate (typically in the order of 200 ml) and employs manual suction to reduce cell damage.
Patients are given local anesthetic, offered conscious sedation (midazolam), and tolerate the procedure well with minimal side effects. Verbal and written subject information improves tolerance and written informed consent is mandatory. Safety of the subject is paramount. Subjects are carefully selected using clear inclusion and exclusion criteria.
This protocol includes a description of the potential risks, and the steps taken to mitigate them, a list of contraindications, pre- and post-procedure checks, as well as precise bronchoscopy and laboratory techniques.

Bronchoalveolar Lavage BAL for Research; Obtaining Adequate Sample Yield

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy and bronchoalveolar lavage using low pressure suction. The technique is used to harvest immune cells from the lung bronchoalveolar surfaces. Local anesthetic and mild conscious sedation (midazolam) is used. Subjects tolerate the procedure well and experience minimal side effects.

Lavaggio broncoalveolare (BAL) di ricerca; ottenere un&#39;adeguata Yield Esempio

We describe a research technique for fiberoptic bronchoscopy with bronchoalveolar lavage (BAL) using manual hand held suction in order to remove ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

Tumore Trattamento Terapia del campo in combinazione con bevacizumab per il trattamento del glioblastoma ricorrente

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous perfusion of organs provides the opportunity to improve organ quality and allows ex situ viability assessment of donor livers prior to transplantation. This video article provides a step by step protocol for ex situ normothermic machine perfusion (37 &#176;C) of human donor livers using a device that provides a pressure and temperature controlled pulsatile perfusion of the hepatic artery and continuous perfusion of the portal vein. The perfusion fluid is oxygenated by two hollow fiber membrane oxygenators and the temperature can be regulated between 10 &#176;C and 37 &#176;C. During perfusion, the metabolic activity of the liver as well as the degree of injury can be assessed by biochemical analysis of samples taken from the perfusion fluid. Machine perfusion is a very promising tool to increase the number of livers that are suitable for transplantation.

Ex Situ Normothermic Machine Perfusion of Donor Livers

Here we present a protocol describing oxygenated ex situ machine perfusion of donor liver grafts. This article contains a step by step protocol to procure and prepare the liver graft for machine perfusion, prepare the perfusion fluid, prime the perfusion machine and perform oxygenated normothermic machine perfusion of the liver graft.

Ex Situ normotermica macchina di perfusione di Vivi donatori

In contrast to conventional static cold preservation (0-4 &#176;C), ex situ machine perfusion may provide better preservation of donor livers. Continuous ...

Veno-Venous Extracorporeal Membrane Oxygenation in a Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for acute as well as end-stage lung diseases. With the increase in clinical demand and prolonged use of ECMO, procedural optimization and prevention of multi-organ damage are of critical importance. The aim of this protocol is to present a detailed technique of veno-venous ECMO in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This protocol demonstrates the technical design of the ECMO and surgical steps. This murine ECMO model will facilitate the study of pathophysiology related to ECMO (e.g., inflammation,bleeding and thromboembolic events). Due to the abundance of genetically modified mice, the molecular mechanisms involved in ECMO-related complications can also be dissected.

Here we present a protocol describing the technique of veno-venous extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) in a non-intubated, spontaneously breathing mouse. This murine model of ECMO can be effectively implemented in experimental studies of acute and end-stage lung diseases.

Ossigenazione extracorporea veno-venoso in un Mouse

The use of extracorporeal membrane oxygenation (ECMO) has increased substantially in recent years. ECMO has become a reliable and effective therapy for ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescenza Etichettatura delle trappole extracellulari di neutrofilo umano e murino nel tessuto incorporato di paraffina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

Modello di trapianto di Murine (ISWAT) del tessuto adiposo sottocutaneo inguinale (ISWAT)

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

Fecale Microbiota trapianto via colonscopia per Recurrent

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