Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Generazione elastomerici Francobolli <ol style="margin-left: 40px;"><li> Per generare padroni di silicio del timbro PDMS, di design dispongono di modelli del fotomaschere utilizzando il software computer-aided design. <ol><li> Progettare il primo modello come 20 x 20 serie di corone circolari con 300 micron di diametro interno (ID) e 600 micron OD con 1.200 micron da centro a centro spaziatura. </li><li> Progettare il secondo pattern come 20 x 20 serie di corone circolari con ID 600 micron e 900 micron OD con 1.200 micron da centro a centro di spaziatura. </li><li> Inoltre, mettere 1 x 1 mm 2 tacche di riferimento quadrati a tutti i quattro angoli di ogni disegno di matrice distanziati 1.200 micron da centro a centro del modello di angolo in un angolo di 45 °. </li><li> Realizzare i maestri di silicio per l&#39;uso in questo esperimento con 1: 1 proporzioni, correlando ad una profondità di 300 micron funzione utilizzando tecniche di litografia norme definite altrove 15 o in collaborazione con una fonderia microfluidica. NOTA: Caratteristica Profondità inferiore a 100 micron possono portare a deformazioni anormali di francobolli prima del contatto con le superfici del substrato. NOTA: Questo protocollo inizia con avere maestri di silicio già ottenuti con i modelli descritti di fotoresist, che richiede attrezzature specializzate e camere pulite per creare. E &#39;meglio consultare un costruttore o nucleo possibilità di creare questi maestri fantasia. </li></ol></li><li> Maestri di silicio silanizzare O / N mediante incubazione con (tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) vapore triclorosilano. NOTA: silano vapore è altamente tossico e deve essere maneggiato solo in una cappa. </li><li> Creare repliche inversa dei maestri silicio curando un rapporto 10: 1 di PDMS pre-polimero e PDMS induritore in cima maestri silicio silanizzato in una capsula di Petri O / N a 60 ° C. </li><li> Rimuovere le PDMS francobolli dai maestri di silicio, e legare i timbri acrilonitrile-butadiene-stirene (ABS) supporti o qualsiasi altro materiale rigidos utilizzo di colla. NOTA: il materiale di scelta non deve essere trasparente o biocompatibile. Tuttavia, si deve fornire una superficie piana per l&#39;interfaccia con l&#39;attrezzatura robotizzata e maggiore rigidità rispetto PDMS. </li></ol> 2. Coprioggetto Preparazione <ol style="margin-left: 40px;"><li> Coprioggetto microscopio risciacquo (24 x 50 mm # 1) in toluene, metanolo e ultrasuoni in acetone per 1 min prima del risciacquo con etanolo ed essiccamento sotto lieve corrente di azoto. NOTA: Maneggiare toluene e acetone solo in una cappa. </li><li> Coprioggetto cappotto con ~ 3.5 nm titanio (Ti), seguita da 18,0 nm oro (Au) con un mirato evaporatore a fascio elettronico. NOTA: Questa procedura è compatibile con una varietà di substrati oro rivestite compreso silicio e polistirene. Mentre è possibile generare questi in loco, substrati oro rivestite sono disponibili tramite fornitori commerciali anche. NOTA: i livelli di Ti deve essere di almeno 3 nm di spessore, mentre Au strati su supporti dovrebbe essere unt almeno 5 nm di spessore e può variare fino a 1 mm di spessore a seconda delle proprietà ottiche ideali del substrato finale 16,17. Substrati non sono tenuti ad essere otticamente trasparente per la fabbricazione; tuttavia, facilita l&#39;analisi microscopica di substrati fabbricati. </li><li> Risciacquare Coprioggetto oro rivestite con etanolo e secco sotto azoto delicato immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol> 3. R-μCP di anello esterno <ol style="margin-left: 40px;"><li> Prima di R-μCP con il sistema selettivo conforme braccio del robot articolato (SCARA), calibrare gli effettori degli strumenti robotici e sistemi dual telecamere di accompagnamento utilizzando il software del sistema. NOTA: Questi strumenti sono raffigurati nella figura 1. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Figura 1. R- μCP sistema e Braccio robotico Tooling. </sTrong&gt; (A) vista su larga scala del sistema di R-μCP con tutte le attrezzature e arredi, (a) mandrino a vuoto, (b) bagno reagente, (c) fotocamera rivolta verso il basso, (d) apparecchio timbro nidificazione, (e) robotica utensile. (B) Attrezzature per robotica braccio raffigurante (f), strumento di incisione a punta di diamante e (g) strumento pneumatiche aspiranti in possesso di un (h) ABS-backed PDMS bollo. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Inserire manualmente un timbro PDMS con 600 ID micron e 900 micron OD sporgente annuli a faccia in giù nel dispositivo timbro di nidificazione. Inserire manualmente un coverslide oro rivestite appena pulita sopra il mandrino a depressione, mostrata in Figura 1A, e immobilizzarlo con il laboratorio vuoto collegata. </li><li> Utilizzando i controlli robot, allineare la fotocamera rivolta verso il basso sopra il punto centrale della coverslide rivestita d&#39;oro, come in Figura 2A. NOTA: Questo punto può essere inizialmente definita mediante ispezione visiva e non richiede grande precisione, come il timbro PDMS è molto larger quanto la slitta rivestita d&#39;oro. </li><li> Istruire il braccio robotico per incidere quattro riferimento &quot;X&quot; marchi di cui i vertici di un quadrato di dimensioni 3,8 millimetri di 3,8 millimetri centrati sul coverslide oro rivestite utilizzando lo strumento di incisione a punta di diamante attaccato al braccio robotico. (Illustrato nella figura 2B; processo automatizzato) NOTA: In questo modo tutti e quattro i punti di riferimento sono all&#39;interno di un quadro visivo della telecamera rivolta verso il basso. </li><li> Utilizzando i robot attrezzature pneumatiche aspiranti, pick-up e tenere premuto il PDMS Timbro 1 mm sopra il dispositivo timbro nidificazione come in Figura 2C. (Processo automatizzato) </li><li> Utilizzando la fotocamera rivolta verso l&#39;alto e l&#39;anello illuminazione a LED nella Figura 2D ed E, visualizza indici di riferimento quadrata del timbro e identificarli con il software della fotocamera 10 volte per determinare X medio del timbro, Y e offset angolare dal centro della asse robot utensili. (Processo automatizzato) </li><li> Come in <strong&gt; Figura 2A, utilizzare la fotocamera rivolta verso il basso per visualizzare e rilevare segni di riferimento incise del coverslide 10 volte per determinare X del coverslide media, Y sedi centrali e offset angolare dal centro dell&#39;asse del robot utensili. (Processo automatico). NOTA: un calcolo interno è svolto dal software del sistema robotico per allineare con precisione la X del coprioggetto, Y località del centro e offset angolari nelle future fasi R-μCP di timbro e. </li><li> 3.8) Posizionare il timbro in un bagno di alkanethiol iniziatore ATRP, ω-mercaptoundecyl bromoisobutirrato (2 mM in etanolo), come illustrato nella Figura 2F. (Processo automatizzato) </li><li> Rimuovere il timbro dalla soluzione alkanethiol e porlo sul flusso di azoto pressurizzato a 0,48 bar (5 psi) per far evaporare l&#39;etanolo come in Figura 2G. Dopo 1 min aumentare la pressione del flusso di azoto è di 1,03 bar (15 psi) per garantire la secchezza uniforme. (Processo automatizzato) NOTA: asciugatura incompleta comporterà la perdita totale o parziale del modello di fedeltà. </li><li> Dopo l&#39;essiccazione, spostare il timbro sulla posizione centro calcolato della slitta rivestita d&#39;oro e abbassarlo a 100 micron incrementi monitorando forza motore asse Z come illustrato nella Figura 2H. NOTA: Questo viene comunicato come torsione subita dal motore asse Z e visualizzato nel software guida robot. (Processo automatizzato) </li><li> Arrestare abbassando il timbro una volta raggiunta la pressione prestabilita di 79,2 kPa, e mantenere il contatto con la slitta rivestita d&#39;oro per 15 sec. (Processo automatizzato) NOTA: I valori di pressione qui sono ottimizzati per la progettazione timbro e funzionalità altezza corrente. Se il disegno di bollo viene modificato, in particolare per alto rapporto di aspetto francobolli, sintonizzare questi di conseguenza un processo di tentativi ed errori. </li><li> Rimuovere lentamente il timbro dalla diapositiva oro rivestite e mettere il timbro di nuovo nel dispositivo timbro di nidificazione. (Processo automatizzato) </li></ol&gt; 4. SI-ATRP di PEGMEMA su micropatterned Coprioggetto <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rilasciare la pressione di vuoto tenendo il coverslide micropatterned, e trasferirla in un pallone da 50 ml Schlenk. Seal e Degas la Schlenk pallone di utilizzare una pompa a vuoto. </li><li> Aggiungere 5,5 ml di miscela di reazione contenente la ATRP macromonomero PEGMEMA (208.75 mmoli), acqua (34,4 ml), metanolo (43,8 ml), rame (II) bromuro (1 mmol), e 2 &#39;, 2-bipiridina (3 mmol) di la beuta Schlenk. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di ascorbato di sodio L-(454,3 mM) in acqua per iniziare l&#39;attacco, e lasciarlo proseguire per 16 ore a temperatura ambiente sotto gas inerte. NOTA: Dopo l&#39;aggiunta di L-ascorbato di sodio, colore reazione si sposterà dal verde chiaro al marrone scuro, come mostrato nella Figura 3A-B. NOTA: La reazione può continuare oltre 16 ore, ma non aumenta significativamente la lunghezza delle spazzole PEG. </li></ol><imgalt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Apertura di SI-ATRP. (A) Avvio di reazione e (B) dopo il cambiamento di colore in seguito all&#39;aggiunta di ascorbato di sodio L-. (C) Microscopio immagine di micropatterned superficie coverslide seguente procedura SI-ATRP. Bar Scala 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere il coverslide micropatterned dal pallone Schenk e risciacquare con etanolo, acqua e etanolo e secco sotto flusso di azoto dolce. NOTA: A seguito di SI-ATRP, modificazioni della superficie dovrebbe essere visibile a occhio e può essere ripreso e analizzato al microscopio come in figura 3C. NOTA: Questo è il metodo più semplice per testare la precisione del processo in quanto evita la necessità di immunostain substrati. </li></ol> 5. Funzionalizzazione azide delle Catene micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Posizionare il coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di N, N -dimethylformamide (DMF) contenente 100 mM sodio azide nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 37 ° C per 24 ore. NOTA: Maneggiare DMF solo in una cappa. Fare attenzione durante la pesatura fuori sodio azide. </li><li> Al termine, rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto. </li></ol> 6. passivazione delle Catene bromo funzionalizzati PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mettere coverslide micropatterned in 20 ml fiale di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di dimetilsolfossido (DMSO) contenenti etanolamina 100 mM e 300 mM trietilamina nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a 40 ° C per 24 ore. NOTA: Maneggiare DMSO, etanolammina, e trietilammina solo in una cappa. </li><li> Al termine rimuovere il coversl micropatternedide dal flaconcino di reazione, lavare con etanolo poi acqua e asciugare in corrente di azoto. </li></ol> 7. R-μCP di Annulus interne e SI-ATRP di PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Eseguire i punti R-μCP come precedentemente descritto nei passaggi 3,2 e 3,6-3,12, sostituendo un timbro PDMS con 300 micron e 600 micron ID annuli OD sporgenti, in modo che il annuli con le caratteristiche più piccole sono collocati all&#39;interno delle corone circolari in precedenza micropatterned. NOTA: La soglia di pressione per questo francobollo è 132,0 kPa. Come accennato in precedenza, queste impostazioni di pressione sono ottimizzate per le caratteristiche provvisorie utilizzati in questo esperimento. </li><li> Eseguire i punti SI-ATRP come precedentemente descritto nei punti 4,1-4,4. </li></ol> 8. L&#39;acetilene Funzionalizzazione di Catene micropatterned PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di DMSO contenente 100 mMpropargylamine nel flaconcino di reazione. Mantenere questa reazione a temperatura ambiente per 24 ore. NOTA: Maneggiare DMSO e propargylamine solo in una cappa. </li><li> Al termine rimuovere il coverslide micropatterned dalla fiala di reazione e lavare con etanolo quindi acqua e asciugare in corrente di azoto. </li></ol> 9. rame-catalizzata &quot;Click&quot; biotinilazione di acetilene terminato Catene PEGMEMA <ol style="margin-left: 40px;"><li> Mettere coverslide micropatterned in 20 ml di reazione flaconcino di vetro. </li><li> Aggiungere 6 ml di solfato di rame (15 mM) / Tris [(1-benzil-1H -1,2,3-triazol-4-il) metil] ammina (TBTA, 30 mM) (1: 1 v / v di acqua / DMF) contenente 562 mM azide-PEG 4 -Biotin coniugato nel flaconcino di reazione. Aggiungere 1,2 ml di acido L-ascorbico (0,15 mM) in acqua alla miscela per inizializzare la reazione. </li><li> Bubble azoto attraverso la soluzione di reazione per 10 sec, sigillare la fiala con Parafilm e reagire per 24 ore a temperatura ambiente. </li><li> Su completion rimuovere coverslide micropatterned dal flaconcino di reazione, sciacquare con acqua e metterla in un piatto di polistirolo 12-bene. </li></ol> 10. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated acetilene Gruppi <ol style="margin-left: 40px;"><li> Bloccare coverslide micropatterned in DPBS (3% Donkey Siero) per 1 ora a temperatura ambiente. Colorazione per gruppi acetilene biotinilati con streptavidina-546 coniugato (2 mg / ml) in DBPs (3% asino siero in PBS) per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela. NOTA: Figura 4B illustra una immagine della diapositiva dopo questo passaggio è completato. </li></ol> 11. Rame esente &quot;Click&quot; biotinilazione di azoturo terminato Catene PEGMEMA NOTA: Se lo si desidera, questa operazione modifica substrato può essere eseguita in situ durante la coltura cellulare. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lascia coverslide micropatterned in 12 pozzetti ppiatto olystyrene seguente DBPs risciacqua. </li><li> Aggiungere 2 ml di DBPs (o cella di coltura) contenenti 20 mM DBCO-PEG 4 -Biotin, e lasciare questa reazione di continuare per 24 ore a temperatura ambiente (o a 37 ° C in un incubatore). </li><li> Al termine, lavare coverslide micropatterned 5 volte con DPBS (o semplicemente eseguire un cambiamento media). </li></ol> 12. immunofluorescenza Rilevamento di Biotinylated azide Gruppi <ol style="margin-left: 40px;"><li> Colorazione per gruppi azide biotinilati con streptavidina-488 coniugato (2 mg / ml) in 2 ml DPBS (3% asino siero) per 2 ore a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare coverslide micropatterned 5 volte in DPBS per 10 minuti e scuotendo con cautela. </li><li> Immagine micropatterned coverslide con microscopio confocale a fluorescenza. Figura 4A-C raffigura immagini della diapositiva dopo questo passaggio è completato. NOTA: Quando si utilizzano supporti per tessuti saggi di cultura, ignorare le sezioni 10 e 12 del presente protocollo. Dopo il degre desideratoe di funzionalizzazione, sterilizzare il coverslide ingegnerizzato risciacquando entrambi i lati con 100% di etanolo ed essiccamento in corrente di azoto. Trasferire i vetrini in una cappa di sicurezza biologica sterile e sciacquare il vetrino con PBS cinque volte prima di procedere con la semina e coltura cellulare. </li></ol>

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J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Substrati ideali per l&#39;ingegneria tissutale sarebbero bioispirati e quindi ricapitolano la distribuzione spaziale dei leganti critici bioattivi presenti all&#39;interno dei tessuti nativi. Avrebbero anche possedere proprietà dinamiche che consentono regolazioni temporali dei leganti e dei modelli spaziali in cui sono presentati per consentire la morfogenesi dei tessuti diretto e spazialmente limitate induzione del destino cellulare. Fabbricazione di tali substrati richiede l&#39;immobilizzazione di molteplici segna...

La capacità delle superfici PEG-innestate per visualizzare leganti biochimici un legame covalente al tempo stesso mantenendo intrinseche proprietà non-fouling li rendono la scelta ideale per gli ambienti di microscala ingegneria personalizzate su substrati di coltura 1,2,3 fare. Le interazioni biospecifici mediate da ligando coniugata spazzole PEG consente l&#39;analisi riduzionistica degli effetti di segnali biochimici si trovano all&#39;interno del complesso in microambienti tessuto vivo su fenotipi di cellule singole. Inoltre, chimiche &quot;click&quot; bio-ortogonale possono essere utilizzati per facilitare l&#39;immobilizzazione direzionale di ligandi in modo che siano presentati in conformazioni native 4-6. Così, microscala patterning spaziale di PEG spazzole è uno strumento versatile per creare design in nicchie in vitro per studiare la segnalazione cellulare indotta da stimoli biochimici immobilizzati 6,7. Un metodo comune per la generazione di modelli spaziali di cu biochimicaes comporta stampa microcontact (μCP) substrati d&#39;oro rivestite con modelli di PEG alkanethiols coniugati. Poi, i monostrati auto-assemblati micropatterned (SAM) di alkanethiols PEG-ylated limita adsorbimento fisico di molecole biochimiche, ad esempio, le proteine, solo per le regioni non fantasia del substrato 8,9. Tuttavia, i SAM generati da questa tecnica sono sensibili all&#39;ossidazione a lungo termine mezzi di coltura cellulare. Così, μCP&#39;d alkanethiol SAM sono spesso ulteriormente innestate con PEG spazzole polimero con trasferimento atomo-superficie avviato polimerizzazione radicalica (SI-ATRP) per aumentare non sporcare la stabilità della regione 10. In particolare, μCP della iniziatore di polimerizzazione alkanethiol, ω-meraptoundecyl bromoisobutirrato, su superfici d&#39;oro rivestite seguite da SI-ATRP di poli (etilene glicole) metacrilato metil etere (PEGMEMA) monomeri genera superfici con micropatterned a lungo termine, stabile, e non fouling PEG spazzole. Inoltre, questi<html> sono in grado di essere ulteriormente modificato per presentare frazioni chimiche diverse 11. Approfittando di questa proprietà, Sha et. al. messo a punto un metodo per progettare substrati di coltura con spazzole PEGMEMA più componenti presentano ortogonali chimiche &quot;clic&quot;. In questo metodo, si avvalgono di una serie di passaggi μCP / SI-ATRP intervallati da sodio azide sequenziale, etanolammina, e propargylamine sostituzioni nucleofile per creare substrati di coltura che presentano modelli di microscala di più ligandi immobilizzati 6. Mentre la prospettiva di utilizzare tali sostanze chimiche in collegamento con μCP manuale per progettare nuovi substrati di coltura è immenso, è limitata dalla precisione e accuratezza con cui più passaggi μCP possono essere allineate su un unico substrato. Un alto livello di precisione e accuratezza sarebbe necessario per la fabbricazione riproducibile complesso in nicchie vitro utilizzando queste tecniche versatili. e_content &quot;&gt; Per affrontare questa limitazione, sono stati generati diversi sistemi μCP automatici e semi-automatici. Chakra et. al., messo a punto un sistema di μCP in cui timbri personalizzati sono posti su un sistema ferroviario e messi in contatto conforme con scivoli d&#39;oro rivestite con un attuatore pneumatico controllato da computer. Tuttavia, questo metodo richiede la realizzazione precisa dei disegni provvisorie personalizzati e riporta una precisione di 10 micron con nessuna relazione della precisione ottenuta durante l&#39;esecuzione multipla μCP passaggi 12. Più recentemente, un metodo che utilizza un sistema di accoppiamento cinematico integrato precisione sotto riportato 1 micron utilizzando un singolo modello, ma non erano in grado di allineare con precisione più pattern a causa della mancanza di un controllo preciso delle caratteristiche provvisorie da stampo per stampo 13. Inoltre, entrambi i metodi precedenti richiedono il substrato a rimanere fisso tra passi patterning , con ciò limitando sensibilmente la diversità dei chimici la modifica della superficie che possono essereutilizzata. Qui, descriviamo un sistema R-μCP automatizzato in grado di allineamento accurato e preciso di molteplici passaggi μCP pur consentendo la massima flessibilità nella progettazione e fabbricazione di bollo. Inoltre, i substrati modellati possono essere ripetutamente rimossi dal sistema tra frantumi, permettendo così l&#39;uso di diverse sostanze chimiche modifica substrato, incluse sostituzioni nucleofile sequenziali. Substrati ingegnerizzati l&#39;utilizzo di tali sostanze chimiche sono state utilizzate per colture cellulari in precedenza sia da noi 6,14 e altri 7. Così, abbiamo unito R-μCP e reazioni di sostituzione nucleofila sequenziali per sviluppare un metodo per la produzione scalabile di substrati di coltura con segnali biochimici complessi e micropatterned.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:185px;">Company</td>
			<td style="width:185px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">SCARA&#160;</td>
			<td style="width:185px;">Epson</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;">Higher end models with increased precision are available if desired.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:185px;">(TRIDECAFLUORO-1,1,2,2-TETRAHYDROOCTYL)TRICHLOROSILANE</td>
			<td style="width:185px;">Gelest</td>
			<td style="width:185px;">SIT8174.0</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:185px;">Ellsworth Adhesive Co</td>
			<td style="width:185px;">NC9020938</td>
			<td style="width:185px;">Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">24mm X 50 mm #1 Cover Glass Slides</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">48393106</td>
			<td style="width:185px;">These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td>
			<td style="width:185px;">Telemark</td>
			<td style="width:185px;">SEC-600-RAP</td>
			<td style="width:185px;">Requries specialized training.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">EPSON LS3 SCARA</td>
			<td style="width:185px;">EPSON</td>
			<td style="width:185px;">LS3-401ST</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:185px;">&#969;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td>
			<td style="width:185px;">Prochimia</td>
			<td style="width:185px;">FT 015-m11-0.2</td>
			<td style="width:185px;">Store at -20&#176;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&#956;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Schlenk Tube Flask 50 mL</td>
			<td style="width:185px;">Synthware</td>
			<td style="width:185px;">60003-078</td>
			<td style="width:185px;">Requires rubber stoppers with diaphram.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">447943</td>
			<td style="width:185px;">Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Methanol (Certified ACS)</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">A412-4</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Bromide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">437867</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">2&#39;,2-Bipyridine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D216305</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Sodium L-Ascorbate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A4034</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">20mL Borosilicate Glass Scintillation Vials</td>
			<td style="width:185px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:185px;">03-340-4E</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">S2002</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">N,N-dimethyformamide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">227056</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">398136</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Triethylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">T0886</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">276855</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Propargylamine</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">P50900</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">200 Proof Ethanol</td>
			<td style="width:185px;">University of Wisconsin Material Distribution Services</td>
			<td style="width:185px;">2292</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Azide-PEG3-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">ClickChemistryTools</td>
			<td style="width:185px;">AZ104-100</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Copper(II) Sulfate</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">C1297</td>
			<td style="width:185px;">CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">678937</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">L-Ascorbic Acid</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">A7506</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">Phosphate Buffer Saline</td>
			<td style="width:185px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:185px;">14190144</td>
			<td style="width:185px;"></td>
		</tr>
		<tr height="168">
			<td height="168" style="height:168px;width:185px;">Donkey Serum</td>
			<td style="width:185px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:185px;">D9663</td>
			<td style="width:185px;">Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (e.g. BSA) are available and serve this purpose.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:185px;">12-Well Polystyrene Plate</td>
			<td style="width:185px;">Thermo Scientifit - NUNC</td>
			<td style="width:185px;">07-200-81</td>
			<td style="width:185px;">Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:185px;">DBCO-PEG4-Biotin</td>
			<td style="width:185px;">Clickchemistytools</td>
			<td style="width:185px;">A105P4-10</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in DMF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11223</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:185px;">Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td>
			<td style="width:185px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:185px;">S-11225</td>
			<td style="width:185px;">Solubilized in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:185px;">Nikon A1-R Confocal Microscope</td>
			<td style="width:185px;">Nikon</td>
			<td style="width:185px;">Nikon Eclipse Ti, A1R</td>
			<td style="width:185px;">An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

L&#39;uso di tecniche di allineamento μCP manuali per ingegnere substrati di coltura con array di spazzole PEG-innestate funzionalizzati con ortogonali &quot;click&quot; chimiche è stata dimostrata in precedenti lavori 6. Tuttavia, questo consente un controllo minimo dell&#39;orientamento del modello e si traduce spesso in sovrapposizione delle aree funzionalizzati. Qui, un nuovo sistema R-μCP viene utilizzato per superare questa limitazione, e la sua capacità di precisione modello una serie di PEG pennel...

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Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &amp;#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Realizzazione substrati di coltura complessi utilizzando robotica microcontact stampa (R-μCP) e sequenziale Sostituzione nucleofila

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K Views.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Video: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Ricerca

Bioingegneria

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge, arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle cells. Despite optimum drug therapy, heart failure represents a leading cause of mortality and morbidity in the developed world. A major challenge in drug development is the identification of cellular assays that accurately recapitulate normal and diseased human myocardial physiology in vitro. Likewise, the major challenges in regenerative cardiac biology revolve around the identification and isolation of patient-specific cardiac progenitors in clinically relevant quantities. These cells have to then be assembled into functional tissue that resembles the native heart tissue architecture. Microcontact printing allows for the creation of precise micropatterned protein shapes that resemble structural organization of the heart, thus providing geometric cues to control cell adhesion spatially. Herein we describe our approach for the isolation of highly purified myocardial cells from pluripotent stem cells differentiating in vitro, the generation of cell growth surfaces micropatterned with extracellular matrix proteins, and the assembly of the stem cell-derived cardiac muscle cells into anisotropic myocardial tissue.

The generation of aligned myocardial tissue is a key requirement for adapting the recent advances in stem cell biology to clinically useful purposes. Herein we describe a microcontact printing approach for the precise control of cell shape and function. Using highly purified populations of embryonic stem cell derived cardiac progenitors, we then generate anisotropic functional myocardial tissue.

Generazione di Allineati tessuto funzionale del miocardio attraverso la stampa microcontatto

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial applications. Here we describe how electrospinning or electrospraying a polymer mixture containing a biodegradable, biocompatible aliphatic polyester (e.g., polycaprolactone and poly(lactide-co-glycolide)), as the major component, doped with a hydrophobic copolymer composed of the polyester and a stearate-modified poly(glycerol carbonate) affords a superhydrophobic biomaterial. The fabrication techniques of electrospinning or electrospraying provide the enhanced surface roughness and porosity on and within the fibers or the particles, respectively. The use of a low surface energy copolymer dopant that blends with the polyester and can be stably electrospun or electrosprayed affords these superhydrophobic materials. Important parameters such as fiber size, copolymer dopant composition and/or concentration, and their effects on wettability are discussed. This combination of polymer chemistry and process engineering affords a versatile approach to develop application-specific materials using scalable techniques, which are likely generalizable to a wider class of polymers for a variety of applications.

Two- and three-dimensional superhydrophobic polymeric materials are prepared by electrospinning or electrospraying biodegradable polymers blended with a lower surface energy polymer of similar composition.

Realizzazione superidrofobiche Materiali Polimerici per applicazioni biomediche

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

Fabbricazione di dispositivi analitici cotone

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Expanding Nanopatterned Substrates Using Stitch Technique for Nanotopographical Modulation of Cell Behavior

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a large area of nanopatterned substrate is desirable so that enough cells can be cultured on the nanotopography for subsequent biochemical and molecular biology analyses. However, current nanofabrication techniques have limitations to generate highly defined nanopatterns over a large area. Herein, we present a method to expand nanopatterned substrates from a small, highly defined nanopattern to a large area using stitch technique. The method combines multiple techniques, involving soft lithography to replicate poly(dimethylsiloxane) (PDMS) molds from a well-defined mold, stitch technique to assemble multiple PDMS molds to a single large mold, and nanoimprinting to generate a master mold on polystyrene (PS) substrates. With the PS master mold, we produce PDMS working substrates and demonstrate nanotopographical modulation of cell spreading. This method provides a simple, affordable yet versatile avenue to generate well-defined nanopatterns over large areas, and is potentially extended to create micro-/nanoscale devices with hybrid components.

A protocol for producing a large area of nanopatterned substrate from small nanopatterned molds for study of nanotopographical modulation of cell behavior is presented.

Espansione nanostrutturati Substrati utilizzando la tecnica del punto per Nanotopographical Modulazione di Cell Comportamento

Substrate nanotopography has been shown to be a potent modulator of cell phenotype and function. To dissect nanotopography modulation of cell behavior, a ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Four-Dimensional CT Analysis Using Sequential 3D-3D Registration

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data remains difficult because segmentation in all volumetric frames is time-consuming. We aimed to analyze joint kinematics using a sequential 3D-3D registration technique to provide the kinematics of the moving bone with respect to the fixed bone semiautomatically using 4DCT DICOM data and existing software. Surface data of the source bones are reconstructed from 3DCT. The trimmed surface data are respectively matched with surface data from the first frame in 4DCT. These trimmed surfaces are sequentially matched until the last frame. These processes provide positional information for target bones in all frames of the 4DCT. Once the coordinate systems of the target bones are decided, translation and rotation angles between any two bones can be calculated. This 4DCT analysis offers advantages in kinematic analyses of complex structures such as carpal or tarsal bones. However, fast or large-scale motions cannot be traced because of motion artifacts.

We analyzed joint kinematics from four-dimensional computed tomography data. The sequential 3D-3D registration method semiautomatically provides the kinematics of the moving bone with respect to the subject bone from four-dimensional computed tomography data.

Analisi CT quadridimensionale mediante registrazione sequenziale 3D-3D

Four-dimensional computed tomography (4DCT) provides a series of volume data and visualizes joint motions. However, numerical analysis of 4DCT data ...

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous lipid tubules found in eukaryotic cells. However, in vivo LNTs are highly non-equilibrium structures that require chemical energy and molecular motors to be assembled, maintained, and reorganized. Furthermore, the composition of in vivo LNTs is complex, comprising of multiple different lipid species. Typical methods to extrude LNTs are both time- and labor-intensive, and they require optical tweezers, microbeads, and micropipettes to forcibly pull nanotubes from giant lipid vesicles. Presented here is a protocol for the gliding motility assay (GMA), in which large scale LNT networks are rapidly generated from giant unilamellar vesicles (GUVs) using kinesin-powered microtubule motility. Using this method, LNT networks are formed from a wide array of lipid formulations that mimic the complexity of biological LNTs, making them increasingly useful for in vitro studies of lipid biophysics and membrane-associated transport. Additionally, this method is capable of reliably producing LNT networks in a short time (&#60;30 min) using commonly used laboratory equipment. LNT network characteristics such as length, width, and lipid partitioning are also tunable by altering the lipid composition of the GUVs used for fabricating the networks.

This protocol describes a process for fabricating lipid nanotube networks using gliding kinesin motility in conjunction with giant unilamellar lipid vesicles.

Fabbricazione di reti di nanotubi lipidici multicomponenti utilizzando il test di motilità di Kinesin gliding

Lipid nanotube (LNT) networks represent an in vitro model system for studying molecular transport and lipid biophysics with relevance to the ubiquitous ...

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

Manipolazione di singole cellule staminali neurali e neuroni nelle fette cerebrali utilizzando la microiniezione robotica

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...