Questo protocollo mostra la produzione di Fall Armyworm transgenico utilizzando il sistema di trasformazione basato su piggyBac. Speriamo che questi metodi possano beneficiare del miglioramento della trasformazione, non solo nel Fall Armyworm, ma anche negli insetti lepidotteri. Il metodo qui descritto rende efficiente la trasformazione germinale degli insetti parassiti lepidotteri.
A dimostrare la procedura sarà il Dr.Xien Chen, un borsista post-dottorato nel mio laboratorio. Inizia mettendo 12 pupe maschili e 12 pupe femmine in una scatola. Mettere una soluzione di saccarosio al 10% nella scatola per l'alimentazione degli adulti.
Coprire la scatola con un tovagliolo di carta. Il secondo giorno dopo l'eclosione, esporre gli adulti a una luce intensa durante la notte. Il terzo giorno dopo l'eclosion, trasferisci gli adulti in un luogo buio.
Raccogli gli embrioni entro due ore dalla sovraposizione. Aggiungere gocce d'acqua al pezzo del tovagliolo di carta con uova fresche conservate in una capsula di Petri su ghiaccio. Trasferire delicatamente le uova su un vetrino con un pennello sottile e allinearle una ad una su una diapositiva di vetro.
Tenere i vetrini con le uova allineate sul ghiaccio prima della microiniezione. Iniettare una miscela di 200 nanogrammi per microlitro piggyBac che esprimono plasmide, 200 nanogrammi per microlitro iperattivo piggyBac traspososi mRNA e acqua distillata sterile nelle uova utilizzando la pressione di compensazione del microiniettore automatizzato. Mantenere le uova iniettate a 27 più o meno un grado Celsius, 60 più o meno 10% di umidità relativa fino alla schiusa.
Nutri le larve tratteggiate con una dieta artificiale e trasferisci ogni larva in una piccola tazza nella fase iniziale di cagliata e stella. Raccogli le pupe e metti circa 150 pupe femmine e 150 maschi in una gabbia. Appendere diversi pezzi di asciugamani di carta 30 centimetri per 15 centimetri di dimensione nella gabbia per raccogliere le uova.
Raccogliere gli asciugamani di carta con le uova ogni giorno e mantenere le uova in condizioni appropriate fino alla schiusa. Tenere le larve neonate a quattro gradi Celsius per cinque minuti per immobilizzarle, quindi trasferirle su una piastra ghiacciata. Schermare le larve neonate immobilizzate sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.
Seleziona i neonati EGFP-positivi, sollevali allo stadio pupale, in circa due settimane a 27 più o meno un grado Celsius. L'mRNA iperattivo della trasposasi piggyBac sintetizzato in vitro è stato rilevato utilizzando un gel di agarosio all'1%. Gli embrioni iniettati con PDS non hanno mostrato il segnale EGFP, mentre gli embrioni iniettati con plasmide e piggyBac iperattivo che esprimono EGFP e gli embrioni iniettati con mRNA di trasposasi piggyBac hanno mostrato fluorescenza EGP, indicando che la costruzione di piggyBac ha avuto successo.
Le larve G1 ottenute da uova risultanti da un auto-incrocio di adulti G0 hanno mostrato un forte segnale EGFP. Un frammento contenente il promotore e il frammento EGFP è stato amplificato con successo utilizzando il DNA genomico isolato dalle larve EGFP-positive come modello. Tuttavia, lo stesso frammento non è stato rilevato quando il DNA genomico è stato isolato dalle larve selvatiche come modello.
Le uova per la microiniezione devono essere il più fresche possibile e devono essere sempre tenute sul ghiaccio prima della microiniezione per rallentarne lo sviluppo. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori per rispondere alle domande sulla genomica funzionale degli insetti nocivi e sviluppare metodi di controllo genetico per questo parassita globale.
