1. Crescita di lino in condizioni che inducono. <ol><li> 5 &quot;vasi sono pieni di terreno e rassodata. </li><li> Tre semi per vaso sono piantati ¼ di pollice profondo e il terreno confermato sopra i semi. </li><li> I vasi vengono poi innaffiato con 100 ml di soluzioni appropriate nutrienti <ol><li> La mancata induzione di controllo (C) le condizioni di utilizzare una forza 1 / 10 di Miracle-Gro ogni settimana. La condizione di alta nutrienti (NPK trattamento) aveva Miracle Grow piena forza applicata settimanale. Povero di nutrienti - piante solo acqua del rubinetto fosse applicata in tutta la loro crescita. (Durrant 1971, Cullis 1980). </li></ol></li><li> Le piante sono coltivate in presenza di luce naturale durante l&#39;estate. Durante l&#39;inverno sono cresciuti sotto le luci di sodio con un 16 / 8 ore ciclo luce / buio. </li><li> Ad intervalli settimanali foglie e meristemi sono raccolti. </li><li> Il materiale vegetale è veloce congelati in azoto liquido. </li></ol> Risultati I tre genotipi crescere a tassi differenti rispetto a seconda delle condizioni (Figura 1). Pertanto in condizioni di controllare la linea Pl cresce meglio con L essendo più vigoroso di S (Figura 1a). Sotto nutrienti bassa (acqua), S cresce meglio L o Pl (Figura 1b). Sotto nutrienti alta (NPK) L cresce meglio di Pl che cresce solo di poco migliore di S (Figura 1c). Un confronto tra ciascuna delle linee cresciuti sotto i tre trattamenti diversi è illustrato nella figura 1 d - f. Pl cresce meglio in condizioni di controllo (Figura 1d), L migliori sotto nutrienti alta (figura 1e) e S in modo simile in entrambe le sostanze nutritive elevate e condizioni di controllo (Figura 1f). Questi dati dimostrano che le tre linee possono essere differenziate in base alla loro crescita sotto i tre ambienti. Di nota è che Pl cresce meglio nelle condizioni di controllo, mentre L cresce meglio nelle condizioni di NPK (alle quali è stata indotta). S cresce di circa lo stesso in tutte e tre le condizioni, cioè, non è in grado di approfittare delle migliori condizioni di nutrienti, ma è meglio in grado di crescere in condizioni di nutrienti molto bassi. I parametri di crescita che sono rilevanti per la differenziazione delle piante includono l&#39;altezza della pianta (e associati a questo la lunghezza internodo, cioè la distanza tra ogni foglia), le dimensioni delle foglie e il grado di ramificazione. Per Pl in condizioni di controllare l&#39;impianto è alto con rami e le foglie sono verdi grandi e scuri. Sotto nutrienti bassa l&#39;impianto è molto breve, la distanza tra ogni foglia è anche molto breve e le foglie sono verdi piccoli e leggeri. Le foglie in punta sono più scuri di quelli verdi più in basso lo stelo. Sotto nutrienti alta la pianta sembra molto simile a quella in condizioni di controllo, tranne che sia il fusto principale e germogli laterali sono più corti negli impianti di controllo. Per la genotroph grandi le piante sembrano molto simili a quelle di Pl, tranne che la crescita più vigorosa in meno di sostanze nutritive elevate. Ancora una volta sotto i nutrienti a basso la pianta è molto breve e ha foglie verde chiaro. Il genotroph S cresce in modo simile in tutti e tre gli ambienti, anche se le foglie sono verde più chiaro sotto i nutrienti contenuti. Tuttavia, in condizioni di scarsa nutrienti la genotroph S è molto più vigorosa rispetto ad entrambi i Pl o linee L. 2. Estrazioni di RNA e DNA da meristemi di lino e le foglie sono fatte separatamente. La Roche RNA totale di preparazione kit è stato utilizzato per le estrazioni di RNA e DNA Qiagen DNeasy impianto di preparazione kit è stato utilizzato per l&#39;estrazione del DNA. Estrazione di RNA <ol><li> 3 meristemi, più alcune foglie circostanti sono spostati da provetta Microbank ™ stoccaggio nel tubo eppendorf e messo in azoto liquido fino al momento di essere a terra. </li><li> Sabbia sterile viene aggiunto al tubo e il tessuto è a terra con una multa fino a micropestle. </li><li> 400 lisi ul / buffer vincolante da Roche RNA totale di preparazione kit è aggiunto e il tessuto è ulteriore terreno fino a quando non sono visibili grumi. </li><li> Campione è in agitazione per 15 secondi per aiutare lisi e poi filata per 1 minuto a 13.000 giri per raccogliere sabbia e detriti. </li><li> Surnatante si aggiunge a girare colonna e il resto della preparazione RNA istruzioni del kit sono seguite le istruzioni. </li></ol> DNAsi trattamento <ol><li> 1 / 10 del volume campione di RNA di 10X tampone DNAsi è aggiunto. </li><li> 30 unità di DNAsi si aggiunge e la reazione viene incubata a 37 ° C per 30 min e 70 ° C per 5 min. </li></ol> Trascrizione inversa <ol><li> Applied Biosystems RNA a cDNA kit è utilizzato secondo le istruzioni, la reazione di incubazione a 37 ° C per 1 ora e 95 ° C per 5 minuti. </li></ol> Il cDNA viene poi utilizzato in PCR o per qPCR qPCR qPCR è stata effettuata utilizzando un passaggio ABI Un unico sistema. Tutti i test sono stati eseguiti in triplicato a ogni esecuzione. Il gene actina è stata usata come controllo, come numero di copiela migliore gene housekeeping disponibili. <ol><li> La coppia di primer appropriato è stato aggiunto ad ogni provetta in 1ml. </li><li> Il cDNA è stato diluito alla concentrazione appropriata e 9μl aggiunto ad ogni provetta </li><li> 10μl del Potere 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) e &#39;stato aggiunto ad ogni provetta </li><li> Il programma di amplificazione programma è stato: <ul><li> 10 minuti a 95 ° C </li><li> 40 cicli di 15 sec a 95 ° C, 1 min a 60 ° C </li></ul> Denaturazione termica passo per verificare la specificità di amplificazione </li><li> I livelli di espressione relativi sono stati determinati dal valore di 2 (CTunknown - CTactin). </li></ol> Estrazione del DNA <ol><li> Buffer AP1 da impianto Qiagen DNeasy DNA preparazione kit è aggiunto 6 foglie con sabbia sterile in una provetta per microcentrifuga. Il tessuto è a terra con micropestle grumi fino a quando non sono visibili. </li><li> Le istruzioni del kit sono seguite le istruzioni. </li></ol> Risultati Amplificazione PCR dal DNA isolato dalle foglie in diverse posizioni lungo il fusto dimostra che la comparsa di LIS-1 si verifica durante le piante crescono in condizioni che inducono (4). I risultati qPCR mostrano che la presenza di LIS-1 (o altre variazioni genomiche associate alla induzione) influenza l&#39;espressione dei geni nelle immediate vicinanze della LIS-1 (Figura 2). I sei geni mostrato nella Figura 2 sono differenzialmente espressi in Pl e S quattro di essi avevano l&#39;espressione più alta in PL (senza LIS-1) e due che hanno maggiore espressione in S (che ha LIS-1). Pannello 1 e 2 sono i due geni più vicino al punto di inserimento di LIS-1. L&#39;espressione di questi geni s in genotroph di grandi dimensioni (che ha avuto cambiamenti indotti, ma non ha LIS-1) e l&#39;espressione in condizioni di crescita diversi saranno necessari per determinare una relazione causale tra LIS-1 e le variazioni di espressione. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pl, L e S cresciuto sotto tre diversi regimi di nutrienti. Pannelli a - controllo, b - nutrienti bassa e c - NPK. d - Pl, e - S, f - L. Pannelli d - f da sinistra a destra: nutrienti basso, controllo e NPK. D - Pl, e - L, F - S. <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig2tmb.jpg" alt="Figura 2 pollice" /> Figura 2. Espressione genica attorno al punto di inserimento di LIS-1. Gene 1 (inibitore di crescita) è immediatamente 5 &#39;di LIS1 e il gene 2 (Kip legate ciclina-dipendente id inibitore della chinasi 3 &quot;della LIS-1. I geni altre sono tutte lungo la stessa impalcatura (~ 500kb) costruito dal sequenza completa del genoma di lino. Si prega di <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/2332/2332fig2.jpg">cliccare qui per vedere una figura più grande</a> . <img src="/files/ftp_upload/2332/2332fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Amplificazioni PCR di DNA estratto dalle foglie di piante singole di Stormont Cirrus coltivate in condizioni di scarsa nutrienti. I prodotti di PCR sono stati separati su un 2% di agarosio TBE-gel. Il sito uninserted è mostrato in un pannello, le due estremità del sito inseriti sono mostrati in pannelli B e C. I campioni di foglie 1-6 sono stati isolati a intervalli settimanali con il campione 1 è il primo dopo la semina.

<ol>
	<li>Durrant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+environmental+induction+of+heritablel+change+in+Linum.">The environmental induction of heritablel change in Linum.</a> Heredity. 17, 27-61 (1962).</li><li>Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+aspects+of+the+environmental+induction+of+heritable+changes+in+flax.">Molecular aspects of the environmental induction of heritable changes in flax.</a> Heredity. 38, 129-154 (1977).</li><li>Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+site-specific+insertion+sequence+in+flax+genotrophs+induced+by+the+environment.+New+Phytol.">A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by the environment. New Phytol.</a> , 167-171 (2005).</li><li>Chen, Y., Lowenfeld, R., Cullis, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+environmentally+induced+adaptive+(?)+insertion+event+in+flax.">An environmentally induced adaptive (?) insertion event in flax.</a> Int. J. Genet. Mol. Biol. 1, 38-47 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Lino sembra avere un genoma intrinsecamente instabile. Un certo numero di varietà commerciali lino tessile rapidamente diventato non uniforme quando destinata alla produzione di poche generazioni. Le stesse osservazioni non sembrano valere per varietà di lino l&#39;olio. Quindi sembra esserci un&#39;associazione tra la selezione per la qualità delle fibre e l&#39;instabilità del genoma. Il indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella lino sono stati inizialmente identificati attraverso l&#39;indagine delle osservazioni agronomiche della crescita del raccolto fibra. Queste osservazioni ripetibili di specifiche varianti fenotipiche e genomica solleva la questione di come lo stress ambientale può influenzare la suite di riarrangiamenti genomici che possono verificarsi. La comparsa ripetuta di LIS-1 in risposta a particolari ambienti è coerente con questa mutazione sia direttamente o indirettamente selezionato. La crescita delle linee indotta da trattamenti vari indica anche un miglioramento delle prestazioni in condizioni che inducono rilevanti. Le variazioni di espressione anche associata con la presenza di LIS-1 indica ancora una volta che questo inserimento influire sulle prestazioni degli impianti. Il video di presentazione fornisce un forum per osservare i cambiamenti fenotipici impianto in maniera impossibile da trasmettere attraverso i tradizionali materiale stampato.

<ul><li> Semi di lino dell&#39;originale varietà Stormont Cirrus denotato Pl e la genotrophs L e S. </li><li> 5 &quot;pentole </li><li> terriccio </li><li> Miracle-Gro </li><li> serra </li><li> Sodio ad alta pressione luci </li><li> Azoto liquido </li><li> Mortaio e pestelli </li><li> Micropestles e tubi microcentrifuga </li><li> Termociclatore </li><li> Gel elettroforesi attrezzature </li><li> Imaging digitale di setup </li><li> StepOne qPCR modulo </li><li> Qiagen DNeasy impianto di preparazione del DNA kit </li><li> Applied Biosystems RNA a cDNA kit </li><li> Roche RNA totale di preparazione kit </li></ul>

environmentally induced heritable changes in flax

Alcune varietà di lino rispondere alle sollecitazioni dei nutrienti, modificando il loro genoma e queste modifiche possono essere ereditate attraverso molte generazioni. Anche associata a questi cambiamenti genomici sono ereditarie fenotipica 1,2 variazioni. La varietà di lino Stormont Cirrus (Pl), se coltivate in tre diverse condizioni di nutrienti possono restare inducibile (nelle condizioni di controllo), o diventare stabilmente modificate sia al genotroph grande o piccolo da una crescita in condizioni di nutrienti alto o basso, rispettivamente. Le linee derivanti dalla crescita iniziale in ciascuno di tali condizioni sembrano crescere meglio se coltivate nelle stesse condizioni nelle generazioni successive, in particolare la linea Pl cresce meglio sotto il trattamento di controllo che indica che le piante che crescono in entrambi i nutrienti di alta e bassa sono in fase di stress. Uno dei cambiamenti genomiche che sono associati con l&#39;induzione di cambiamenti ereditabili è la comparsa di un elemento di inserimento (LIS-1) 3, 4, mentre le piante crescono sotto lo stress dei nutrienti. In relazione a questo evento di inserimento, la varietà di lino Stormont Cirrus (Pl), se coltivate in tre diverse condizioni di nutrienti possono restare invariati (alle condizioni di controllo), hanno l&#39;inserimento appare in tutte le piante (sotto nutrienti basso) e hanno trasmesso questo alla prossima generazione, o hanno l&#39;inserimento (o parti di essa), ma non sembrano essere trasmessi attraverso le generazioni (sotto i nutrienti alto) 4. La frequenza della comparsa di questa inserzione indica che è in fase di selezione positiva, che è anche coerente con la risposta di crescita nelle generazioni successive. Foglie o meristemi raccolte nelle varie fasi di crescita sono utilizzate per l&#39;isolamento del DNA e RNA. L&#39;RNA viene utilizzato per identificare variazioni nell&#39;espressione associate con gli ambienti di crescita diversi e / o t ha presenza / assenza di LIS-1. Il DNA isolato viene utilizzato per identificare quelle piante in cui l&#39;inserimento è avvenuto.

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Environmentally Induced Heritable Changes in Flax

Crescente alcune varietà di lino sotto i risultati dello stress nutrienti in variazione genomica all&#39;interno di un sottoinsieme del genoma e della variazione fenotipica. Un complesso di inserimento in un sito specifico viene associata a una crescita sotto vari regimi di nutrienti e con i cambiamenti nell&#39;espressione genica intorno a questo sito.

Indotta da fattori ambientali modifiche ereditabili nella Lino

Some flax varieties respond to nutrient stress by modifying their genome and these modifications can be inherited through many generations. Also ...

environmentally-induced-heritable-changes-in-flax

Research

JoVE Journal

Biology

10.2K Views.  Case Western Reserve University. Crescente alcune varietà di lino sotto i risultati dello stress nutrienti in variazione genomica all'interno di un sottoinsieme del genoma e della variazione fenotipica. Un complesso di inserimento in un sito specifico viene associata a una crescita sotto vari regimi di nutrienti e con i cambiamenti nell'espressione genica intorno a questo sito.

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A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities 

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the visual scene. However, the OKR requires that an animal detect moving stripes and it is possible that fish that fail to exhibit an OKR may not be completely blind. One zebrafish mutant, the no optokinetic response c (nrc) has no OKR under any light conditions tested and was reported to be completely blind. Previously, we have shown that OFF-ganglion cell activity can be recorded in these mutants. To determine whether mutant fish with no OKR such as the nrc mutant can detect simple light increments and decrements we developed the visual motor behavioral assay (VMR). In this assay, single zebrafish larvae are placed in each well of a 96-well plate allowing the simultaneous monitoring of larvae using an automated video-tracking system. The locomotor responses of each larva to 30 minutes light ON and 30 minutes light OFF were recorded and quantified. WT fish have a brief spike of motor activity upon lights ON, known as the startle response, followed by return to lower-than baseline activity, called a freeze. WT fish also sharply increase their locomotor activity immediately following lights OFF and only gradually (over several minutes) return to baseline locomotor activity. The nrc mutants respond similarly to light OFF as WT fish, but exhibit a slight reduction in their average activity as compared to WT fish. Motor activity in response to light ON in nrc mutants is delayed and sluggish. There is a slow rise time of the nrc mutant response to light ON as compared to WT light ON response. The results indicate that nrc fish are not completely blind. Because teleosts can detect light through non-retinal tissues, we confirmed that the immediate behavioral responses to light-intensity changes require intact eyes by using the chokh (chk) mutants, which completely lack eyes from the earliest stages of development. In our VMR assay, the chk mutants exhibit no startle response to either light ON or OFF, showing that the lateral eyes mediate this behavior. The VMR assay described here complements the well-established OKR assay, which does not test the ability of zebrafish larvae to respond to changes in light intensities. Additionally, the automation of the VMR assay lends itself to high-throughput screening for defects in light-intensity driven visual responses.

A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities

We developed the Visual-Motor Response to quantitate the motor output of larval zebrafish in response to light increments and decrements. We also examined zebrafish vision mutants, including the no optokinetic response (nrc) mutants, which were thought to be completely blind when tested by another vision assay, the optokinetic reflex.

Un test per misurare capacità di risposta comportamentale di Zebrafish a variazioni di intensità di luce

The optokinetic reflex (OKR) is a basic visual reflex exhibited by most vertebrates and plays an important role in stabilizing the eye relative to the ...

Ricerca

Biologia

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

Metodi di singola molecola per monitorare l&#39;evoluzione a doppio strato: Proprietà meccaniche

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland undergoes extensive modeling and re-modeling, alter susceptibility to carcinogen-induced mammary tumors. Similar findings have been described in humans: for example, high birthweight increases later risk of developing breast cancer, and dietary intake of soy during childhood decreases breast cancer risk. It is thought that these prenatal and postnatal dietary modifications induce persistent morphological changes in the mammary gland that in turn modify breast cancer risk later in life. These morphological changes likely reflect epigenetic modifications, such as changes in DNA methylation, histones and miRNA expression that then affect gene transcription . In this article we describe how changes in mammary gland morphology can predict mammary cancer risk in rats. Our protocol specifically describes how to dissect and remove the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology according to three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use the data to predict risk of developing mammary cancer.

Our protocol describes how to dissect the rat abdominal mammary gland and how to prepare mammary gland whole mounts. It also describes how to analyze mammary gland morphology using three end-points (number of terminal end buds, epithelial elongation and differentiation) and to use these results to predict mammary cancer risk in rats which were exposed to dietary modifications in utero or during prepuberty.

Cambiamenti nella morfologia della ghiandola mammaria e rischio di cancro al seno in topi

Studies in rodent models of breast cancer show that exposures to dietary/hormonal factors during the in utero and pubertal periods, when the mammary gland ...

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by 'Peroxidative' and 'Oxidative' Hydroxyl Radical Footprinting

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling a specific biologic role as regulator, binder or catalyst. Information about tertiary contact formation is essential to understand the function of RNA molecules. Hydroxyl radicals (&bull;OH) are unique probes of the structure of nucleic acids due to their high reactivity and small size.1 When used as a footprinting probe, hydroxyl radicals map the solvent accessible surface of the phosphodiester backbone of DNA1 and RNA2 with as fine as single nucleotide resolution. Hydroxyl radical footprinting can be used to identify the nucleotides within an intermolecular contact surface, e.g. in DNA-protein1 and RNA-protein complexes. Equilibrium3 and kinetic4 transitions can be determined by conducting hydroxyl radical footprinting as a function of a solution variable or time, respectively. A key feature of footprinting is that limited exposure to the probe (e.g., 'single-hit kinetics') results in the uniform sampling of each nucleotide of the polymer.5
In this video article, we use the P4-P6 domain of the Tetrahymena ribozyme to illustrate RNA sample preparation and the determination of a Mg(II)-mediated folding isotherms. We describe the use of the well known hydroxyl radical footprinting protocol that requires H2O2 (we call this the 'peroxidative' protocol) and a valuable, but not widely known, alternative that uses naturally dissolved O2 (we call this the 'oxidative' protocol). An overview of the data reduction, transformation and analysis procedures is presented.

Monitoring Equilibrium Changes in RNA Structure by &#039;Peroxidative&#039; and &#039;Oxidative&#039; Hydroxyl Radical Footprinting

This protocol describes how to quantify the Mg(II)-dependent formation of RNA tertiary structure by two methods of hydroxyl radical footprinting.

Cambiamenti di equilibrio nella struttura di monitoraggio RNA da &#39;perossidativi&#39; e &#39;ossidativo&#39; Footprinting radicale ossidrile

RNA molecules play an essential role in biology. In addition to transmitting genetic information, RNA can fold into unique tertiary structures fulfilling ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Riprogrammare cellule somatiche umane in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) Utilizzo vettore retrovirale con GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Efficiente generazione indotta umane pluripotenti cellule staminali da cellule somatiche umane con Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Measuring Glutathione-induced Feeding Response in Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. The movement of prey organisms causes mechanosensory discharge of the stinging cells called nematocysts from hydra, which are inserted into the prey. The feeding response in hydra, which includes curling of the tentacles to bring the prey towards the mouth, opening of the mouth and consequent engulfing of the prey, is triggered by GSH present in the fluid released from the injured prey. To be able to identify the molecular mechanism of the feeding response in hydra which is unknown to date, it is necessary to establish an assay to measure the feeding response. Here, we describe a simple method for the quantitation of the feeding response in which the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra is measured and the ratio of such distance before and after the addition of GSH is determined. The ratio, called the relative tentacle spread, was found to give a measure of the feeding response. This assay was validated using a starvation model in which starved hydra show an enhanced feeding response in comparison with daily fed hydra.

Here we describe a simple assay for the quantification of the feeding response in hydra induced by the reduced form of glutathione. This assay relies on measuring the distance between the apical end of the tentacle and mouth of hydra.

Misurazione glutatione indotta risposta alimentazione a Hydra

Hydra is among the most primitive organisms possessing a nervous system and chemosensation for detecting reduced glutathione (GSH) for capturing the prey. ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

Trasformazione Floral-Dip di lino (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...