Ringraziamo Jiří Macas (Centro di biologia CAS, České Budějovice, Repubblica Ceca) per aver fornito il ceppo agrobatterico. Il Core Facility Plants Sciences di CEITEC MU è riconosciuto per il suo supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Gioventù e dello Sport della Repubblica Ceca con il Fondo Europeo di Sviluppo Regionale-Progetto "SINGING PLANT" (n. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446) e il progetto INTER-COST LTC20004.

Induzione e rigenerazione delle radici pelose mediate da agrobatteri nelle piante

<ol>
	<li>Lee, L. Y., Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-DNA+binary+vectors+and+systems.">T-DNA binary vectors and systems.</a> Plant Physiology. 146 (2), 325-332 (2008).</li><li>Christey, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ri-mediated+transformation+for+production+of+transgenic+plants.">Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants.</a> In Vitro Cellular &amp; Developmental Biology - Plant. 37 (6), 687-700 (2001).</li><li>Gelvin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium-Mediated+Plant+Transformation:+the+Biology+behind+the+&#8220;Gene-Jockeying&#8221;+Tool.">Agrobacterium-Mediated Plant Transformation: the Biology behind the &#8220;Gene-Jockeying&#8221; Tool.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (1), 16-37 (2003).</li><li>Georgiev, M. I., Agostini, E., Ludwig-M&#252;ller, J., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+transformed+roots:+from+plant+disease+to+biotechnological+resource.">Genetically transformed roots: from plant disease to biotechnological resource.</a> Trends in Biotechnology. 30 (10), 528-537 (2012).</li><li>Gutierrez-Valdes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+cultures&#8212;a+versatile+tool+with+multiple+applications.">Hairy root cultures&#8212;a versatile tool with multiple applications.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 33 (2020).</li><li>Niazian, M., Belzile, F., Torkamaneh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+planta+hairy+root+transformation:+a+powerful+platform+for+functional+analysis+of+root+traits+in+Soybean.">CRISPR/Cas9 in planta hairy root transformation: a powerful platform for functional analysis of root traits in Soybean.</a> Plants. 11 (8), 1044 (2022).</li><li>Petit, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Further+extension+of+the+opine+concept:+plasmids+in+Agrobacterium+rhizogenes+cooperate+for+opine+degradation.">Further extension of the opine concept: plasmids in Agrobacterium rhizogenes cooperate for opine degradation.</a> Molecular and General Genetics MGG. 190 (2), 204-214 (1983).</li><li>Ozyigit, I. I., Dogan, I., Tarhan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agrobacterium+rhizogenes-mediated+transformation+and+its+biotechnological+applications+in+crops.">Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation and its biotechnological applications in crops.</a> Crop improvement. , (2013).</li><li>Jedli&#269;kov&#225;, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hairy+root+transformation+system+as+a+tool+for+CRISPR/Cas9-directed+genome+editing+in+oilseed+rape+(Brassica+napus).">Hairy root transformation system as a tool for CRISPR/Cas9-directed genome editing in oilseed rape (Brassica napus).</a> Frontiers in Plant Science. 13, 919290 (2022).</li><li>Steinbauerov&#225;, V., Neumann, P., Macas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evidence+for+splicing+of+intron-containing+transcripts+of+plant+LTR+retrotransposon+Ogre.">Experimental evidence for splicing of intron-containing transcripts of plant LTR retrotransposon Ogre.</a> Molecular Genetics and Genomics. 280 (5), 427-436 (2008).</li><li>Neumann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromeres+off+the+hook:+massive+changes+in+centromere+size+and+structure+following+duplication+of+CenH3+gene+in+Fabeae+species.">Centromeres off the hook: massive changes in centromere size and structure following duplication of CenH3 gene in Fabeae species.</a> Molecular Biology and Evolution. 32 (7), 1862-1879 (2015).</li><li>Montazeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparative+analysis+of+the+hairy+root+induction+methods+in+Hypericum+perforatum.">A Comparative analysis of the hairy root induction methods in Hypericum perforatum.</a> Journal of Plant Molecular Breeding. 7 (1), 67-76 (2019).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peat-based+hairy+root+transformation+using+Rhizobium+rhizogenes+as+a+rapid+and+efficient+tool+for+easily+exploring+potential+genes+related+to+root-knot+nematode+parasitism+and+host+response.">Peat-based hairy root transformation using Rhizobium rhizogenes as a rapid and efficient tool for easily exploring potential genes related to root-knot nematode parasitism and host response.</a> Plant Methods. 19 (1), 22 (2023).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+kale+(Brassica+oleracea+var.+acephala),+rape+(B.+napus)+and+turnip+(B.+campestris+var.+rapifera)+plants+via+Agrobacterium+rhizogenes+mediated+transformation.">Regeneration of transgenic kale (Brassica oleracea var. acephala), rape (B. napus) and turnip (B. campestris var. rapifera) plants via Agrobacterium rhizogenes mediated transformation.</a> Plant Science. 87 (2), 161-169 (1992).</li><li>Christey, M. C., Sinclair, B. K., Braun, R. H., Wyke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+transgenic+vegetable+brassicas+(Brassica+oleracea+and+B.+campestris)+via+Ri-mediated+transformation.">Regeneration of transgenic vegetable brassicas (Brassica oleracea and B. campestris) via Ri-mediated transformation.</a> Plant Cell Reports. 16 (9), 587-593 (1997).</li></ol>

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta senza alcuna relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Abbiamo sviluppato un semplice protocollo per la trasformazione delle radici pelose e la successiva rigenerazione in B. napus e A. thaliana. Questo processo include l'induzione della radice pelosa basata su iniezione nell'ipocotile (B. napus) o nel fusto dell'infiorescenza primaria (A. thaliana). Il metodo di iniettare l'ipocotile con il ceppo agrobatterico C58C1 che trasporta un plasmide Ri è stato efficace anche nella famiglia delle Fabaceae10,11, oltre ai membri delle Brassicaceae presentati in questo studio.
Un'alternativa al metodo basato sull'iniezione è la trasformazione per immersione che consiste nell'immersione dell'espianto in una sospensione batterica, seguita dalla co-coltivazione dell'espianto con agrobatteri. Il vantaggio del metodo a iniezione rispetto al metodo a immersione è il tempo risparmiato dall'assenza di alcune fasi del protocollo: preparazione dell'espianto, test del tempo di co-coltivazione e coltura su un terreno contenente ormone per l'induzione delle radici pelose. Sebbene entrambi gli approcci siano efficaci per l'induzione delle radici pelose, in alcune specie è stata osservata una maggiore efficienza di trasformazione con il metodo basato sull'iniezione rispetto a quello basato sull'espianto12,13. Inoltre, la trasformazione per iniezione è utile anche per generare piante composite (radici pelose transgeniche e germogli wild-type). Dopo aver tagliato le radici originali della pianta trasformata, le radici pelose supportano la crescita della pianta e il transgene può essere studiato nel contesto dell'intera pianta.
La fase critica dell'induzione della radice pelosa è l'iniezione dell'inoculo nell'ipocotile, o stelo dell'infiorescenza primaria. Gli ipocotili di B. napus sono fragili e il taglio dell'intero ipocotile può avvenire facilmente. Lo stesso può essere osservato con A. thaliana a causa della sottigliezza del fusto dell'infiorescenza. Se è necessario un confronto dell'efficienza di trasformazione di diverse specie/cultivar, si consiglia che una persona esegua tutti gli esperimenti per evitare l'errore causato dalla manipolazione e dall'abilità nell'iniezione delle piante.
Abbiamo sviluppato un protocollo efficace per la rigenerazione delle radici pelose in B. napus DH12075 e A. thaliana Col-0. Poiché la rigenerazione è un processo altamente variabile, alcune modifiche del protocollo possono essere applicate a una specie o a una cultivar di scelta. Ad esempio, i germogli pelosi derivati dalle radici possono essere elicitati da un diverso rapporto auxina/citochinina (1:1) in B. oleracea14. In alternativa, la citochinina thidiazuron può essere utilizzata al posto del BAP, come nel caso delle radici pelose di B. campestris 15.
Inserzioni multiple del T-DNA del plasmide Ri nel genoma della pianta rappresentano una potenziale limitazione del sistema di trasformazione e rigenerazione delle radici pelose. In questi casi, nessuna pianta priva di TL/TR dal plasmide Ri viene scoperta dopo un'analisi di segregazione delle piantine T1. Pertanto, si consiglia di generare diverse linee di radici pelose indipendenti per ogni transgene.
Le colture di radici pelose sono uno strumento estremamente potente per gli studi funzionali dei geni, principalmente a causa del loro rapido insediamento e della manutenzione economica (non sono necessari ormoni nei terreni di coltivazione). Questo protocollo copre i metodi per l'induzione e la rigenerazione delle radici pelose in B. napus e A. thaliana, che possono essere utilizzati per studiare il transgene di interesse direttamente nelle colture di radici pelose, nel contesto dell'intera pianta utilizzando piante composite, o dopo la rigenerazione delle piante transgeniche.

La trasformazione delle piante è il collo di bottiglia di qualsiasi studio genetico in biologia vegetale. Un batterio del suolo, l'Agrobacterium tumefaciens, è ampiamente utilizzato come mezzo per la somministrazione genica mediante immersione floreale o coltura tissutale per generare trasformanti. A. tumefaciens infetta le piante in un sito di ferita e provoca tumori a causa del trasferimento e dell'integrazione del T-DNA da un plasmide che induce il tumore (Ti) nel genoma della pianta ospite. I ceppi ingegnerizzati di A. tumefaciens con plasmide di Ti modificato senza il T-DNA wild-type e un vettore binario con T-DNA artificiale e siti di clonaggio per l'inserimento di un gene di interesse sono comunemente usati come un efficiente sistema di trasformazione delle piante1. Tuttavia, molte specie e colture modello sono recalcitranti all'immersione floreale o alla rigenerazione delle piante in vitro o hanno lunghi cicli di crescita, con un impatto sull'efficienza di questo sistema di trasformazione.
L'Agrobacterium rhizogenes induce la formazione di radici avventizie, o radici pelose, nel sito di ferita dopo aver infettato una pianta ospite. Simile ad A. tumefaciens, A. rhizogenes trasferisce un T-DNA da un plasmide che induce le radici (Ri) al genoma della pianta ospite, causando lo sviluppo di radici pelose transgeniche. Questo processo è controllato principalmente dai geni 2,3 dei loci oncogenici della radice (rol). Utilizzando ceppi agrobatterici che trasportano sia il plasmide Ri che un vettore binario artificiale che codifica per un gene di interesse, sono state utilizzate colture radicali pelose per produrre proteine ricombinanti, analizzare la funzione di promotori o geni o modificare i genomi utilizzando Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Il nostro protocollo utilizza il ceppo transconiugante Ti-less A. tumefaciens C58C1 che trasporta il plasmide Ri pRiA4b7. Il T-DNA del plasmide Ri è costituito da due regioni, T-DNA destro e sinistro (TR-DNA e TL-DNA, rispettivamente), che possono integrarsi indipendentemente nel genoma della pianta8. Sfruttando questo sistema, è stato ottimizzato il lungo processo di trasformazione dell'espianto nella cultivar Brassica napus DH120759. Il protocollo descritto di seguito consente la rigenerazione di linee radicali pelose selezionate e l'ottenimento di piante T1 portatrici del transgene di interesse e prive di geni rol in circa 1 anno. La trasformazione della radice pelosa basata sull'iniezione può essere utilizzata in altre specie di Brassicaceae, come dimostrato dalla trasformazione di Arabidopsis thaliana Col-0. Mentre l'ipocotile viene utilizzato per trasformare B. napus, A. thaliana viene iniettato nello stelo dell'infiorescenza primaria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.50 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>125.215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% solution of commercial bleach&#160;</td>
			<td>SAVO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-naphthaleneacetic acid (NAA)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>N0903</td>
			<td>Callus regeneration medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>108.132/108.078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3M micropore tape</td>
			<td>Micropore</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Benzylaminopurine (BAP)&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>B0904</td>
			<td>Callus regeneration medium, Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bacteriological agar</td>
			<td>HiMedia</td>
			<td>RM201</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological peptone</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>LP0037</td>
			<td>LB and YEB media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beef extract</td>
			<td>Roth</td>
			<td>X975.1</td>
			<td>YEB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottles</td>
			<td>DURAN</td>
			<td>L300025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefotaxime sodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>C0111</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3955301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB Hexadecyltrimethylammonium bromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>52365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R0193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA - Titriplex III, (Ethylenendinitrilo)tetraacetic Acid, Disodium Salt, Dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ES134-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>elctroporation cuvette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophesis agar, peqGOLD universal</td>
			<td>VWR</td>
			<td>732-2789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis chamber</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis gel reader</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electroporator GenePulser Xcell</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethidium bromide</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Pulser/MicroPulser electroporation cuvettes, 0.2 cm gap</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>1652082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Ruler DNA ladder mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SM0331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibberellic acid (GA3)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>G0907</td>
			<td>Shoot elongation medium&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-pirerazinyl)-ethansulfonique</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1101100250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole-3-butyric acid (IBA)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>I0902</td>
			<td>Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin monosulfate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>K0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magenta GA-7 Plant Culture Box w/ Lid</td>
			<td>Plant Media</td>
			<td>V8505-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES monohydrate</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M1503</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS)</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0237</td>
			<td>Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog medium (MS) + B5 vitamins&#160;</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>M0231</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle Agani 26G x 1/2 - 0.45 x 13mm</td>
			<td>Terumo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td>Callus regeneration medium, Root induction medium, Medium for germination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVP 40 (polyvinylpyrolidone Mr 40000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Redtaq DNA Polymerase,Taq for routine PCR with inert dye, 10X buffer included</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4309-250UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retsh mill</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride</td>
			<td>Lachner</td>
			<td>30093-APO</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>square Petri Dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>GOSSBP124-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sucrose</td>
			<td>Penta</td>
			<td>24970-31000</td>
			<td>Hairy root growing medium, Callus regeneration medium, Shoot elongation medium, Root induction medium, Medium for germination, Plant growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P666.1</td>
			<td>Rotylabo syringe filters 0.22 &#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ticarcillin disodium</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>T0180</td>
			<td>Hairy root growing medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td>
			<td>Serva</td>
			<td>3719003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrapure water</td>
			<td>Millipore Milli-Q purified water&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Duchefa</td>
			<td>Y1333</td>
			<td>LB medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hairy root transformation and regeneration in arabidopsis thaliana and brassica napus

La trasformazione delle radici pelose rappresenta uno strumento versatile per le biotecnologie vegetali in varie specie. L'infezione da parte di un ceppo di Agrobacterium che trasporta un plasmide che induce le radici (Ri) induce la formazione di radici pelose nel sito di ferita dopo il trasferimento del T-DNA dal plasmide Ri nel genoma della pianta. Il protocollo descrive in dettaglio la procedura di induzione della radice pelosa basata su iniezione in Brassica napus DH12075 e Arabidopsis thaliana Col-0. Le radici pelose possono essere utilizzate per analizzare un transgene di interesse o elaborate per la generazione di piante transgeniche. Il terreno di rigenerazione contenente citochinina 6-benzilaminopurina (5 mg/L) e acido auxina-1-naftaleneacetico (8 mg/L) provoca con successo la formazione di germogli in entrambe le specie. Il protocollo riguarda la genotipizzazione e la selezione di rigeneranti e piante T1 per ottenere piante portatrici di un transgene di interesse e prive di T-DNA dal plasmide Ri . Viene anche illustrato un processo alternativo che porta alla formazione di una pianta composita. In questo caso, le radici pelose vengono mantenute sul germoglio (invece delle radici naturali), il che consente lo studio di un transgene nelle colture radicali pelose nel contesto dell'intera pianta.

Plant transformation is the bottleneck of any genetic study in plant biology. A soil-borne bacterium, Agrobacterium tumefaciens, is widely used as a means for gene delivery by floral dip or tissue culture to generate transformants. A. tumefaciens infects plants at a wounding site and causes tumors due to the transfer and integration of T-DNA from a Tumor-inducing (Ti) plasmid into the host plant genome. Engineered A. tumefaciens strains with modified Ti plasmid without the wild-type T-DNA and a binary vector with artificial T-DNA and cloning sites for inserting a gene of interest are commonly used as an efficient plant transformation system1. However, many model species and crops are recalcitrant to floral dip or in vitro plant regeneration or have long growth cycles, impacting the efficiency of this transformation system.
Agrobacterium rhizogenes induces the formation of adventitious roots, or hairy roots, at the wounding site after infecting a host plant. Similar to A. tumefaciens, A. rhizogenes transfers a T-DNA from a Root-inducing (Ri) plasmid to the host plant genome, causing the development of transgenic hairy roots. This process is controlled mainly by the root oncogenic loci (rol) genes2,3. Using agrobacterial strains carrying both the Ri plasmid and an artificial binary vector encoding a gene of interest, hairy root cultures have been used to produce recombinant proteins, analyze the function of promoters or genes, or edit genomes using Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9)4,5,6.
Our protocol uses the transconjugant strain Ti-less A. tumefaciens C58C1 carrying the Ri plasmid pRiA4b7. The T-DNA of the Ri plasmid consists of two regions, right and left T-DNA (TR-DNA and TL-DNA, respectively), that can independently integrate into the plant genome8. Exploiting this system, the lengthy explant transformation process in Brassica napus DH12075 cultivar was optimized9. The protocol detailed below allows for the regeneration of selected hairy root lines and obtaining T1 plants carrying the transgene of interest and free of rol genes in roughly 1 year. The injection-based hairy root transformation can be used in other Brassicaceae species, as shown by transforming Arabidopsis thaliana Col-0. While hypocotyl is used to transform B. napus, A. thaliana is injected into the primary inflorescence stem.

Autore in primo piano: Ottimizzazione dei protocolli di trasformazione basati sulle radici pelose per una maggiore efficienza nelle Brassicaceae

Trasformazione e rigenerazione delle radici pelose in Arabidopsis thaliana e Brassica napus

Our research aimed at developing a protocol for an efficient transformation in Brassicaceae. Using a hair root-based transformation, we improved dramatically transformation efficiency in Brassica napus, which is crucial for our research. We also tested the protocol in model species Arabidopsis thaliana.We have optimized the protocol for spring cultivars DH12075 in Brassica napus. The next challenge is to optimize the protocol of transformation and regeneration of winter cultivars in Brassica napus, as well as for Brassica rapa and Brassica oleracea. Hairy roots can be readily propagated, and their rapid growth enables the prompt analysis of the gene of interest shortly after the transformation.Consequently, it becomes feasible to selectively regenerate specific hairy root lines that exhibit the desired trait. For example, a gene mutation introduced by CRISPR-Cas.

In precedenza abbiamo ottimizzato un protocollo per l'induzione di radici pelose basate su iniezione in tre cultivar di Brassica napus, vale a dire DH12075, Topas DH4079 e Westar9. Per applicare questo protocollo di trasformazione alla specie modello A. thaliana, gli steli primari dell'infiorescenza di piantine di 1 mese sono stati iniettati con un inoculo agrobatterico. Le radici pelose sono emerse nel sito di iniezione dopo 2-4 settimane. Le radici pelose sono state asportate e coltivate sul terreno solido. Il confronto del metodo in queste due specie è illustrato nella Figura 1.
Le linee radicali pelose selezionate sono state trasferite al mezzo di rigenerazione per indurre la formazione dei germogli. In A. thaliana, i calli gialli sono stati indotti entro 14 giorni in tutte e 10 le linee radicali pelose testate. I primi primi germogli sono emersi come macchie verde scuro entro 3 settimane dal trasferimento nel mezzo di rigenerazione (Figura 2). Dopo 4 settimane di coltura, i germogli coprivano le radici pelose in 9 delle 10 linee di radici pelose (efficienza di rigenerazione del 90%). In alcuni casi, le radici avventizie sono state ricavate dal callo (Figura 2H). Una linea non si è rigenerata nemmeno dopo 3 mesi sul terreno di rigenerazione (ogni 4 settimane, le radici pelose sono state trasferite in un terreno fresco). Pertanto, l'efficienza di rigenerazione delle radici pelose di A. thaliana assomiglia all'efficienza di B. napus DH120759.
I rigeneranti radicali pelosi di B. napus e A. thaliana mostrano un fenotipo nano (Figura 3), una caratteristica tipica delle piante pelose derivate da radici2. Abbiamo anche osservato un apparato radicale denso, foglie rugose e cambiamenti nel tempo di fioritura. Questo cosiddetto fenotipo della radice pelosa (o Ri) è causato dai geni rol del plasmide Ri inseriti nel genoma della pianta. L'inserzione del Ri T-DNA e del transgene codificato su un vettore binario può essere indipendente o collegata. Pertanto, un'analisi di segregazione della progenie T1 creata dall'autoimpollinazione aiuta a identificare le piante prive di rol che esprimono il transgene di interesse. La genotipizzazione delle piante T1 viene eseguita mediante primer PCR specifici per le ORF di TL e TR e per il transgene di interesse. L'assenza di contaminazione agrobatterica è verificata dall'assenza di prodotti PCR di primer virC (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig01.jpg"> Figura 1: Riassunto della procedura in A. thaliana e B. napus. L'iniezione dell'Agrobacterium inoculum nel fusto dell'infiorescenza ipocotile o primaria induce lo sviluppo di radici pelose. Le radici pelose possono sostituire le radici autoctone per generare una pianta composita che verrà genotipizzata e analizzata (frecce blu). Le radici pelose coltivate possono essere rigenerate in piante T0, propagate in piante T1 e genotipizzate (frecce verdi). Le radici pelose possono anche essere sottocoltivate per l'analisi funzionale (freccia nera). Vengono presentati esempi di risultati di genotipizzazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig02.jpg"> Figura 2: Rigenerazione delle radici pelose in A. thaliana. (A) Coltura radicale pelosa 1 giorno dopo il suo trasferimento in piastre. (B, C) Calli si è sviluppato entro 2 settimane dalla coltura su terreno di rigenerazione. (D, E) I primi germogli sono emersi dopo 3 settimane di coltura. (G, H) I germogli si formano dopo 4 settimane. (H) Le radici avventizie si sono sviluppate dal callo. (C, F, I) Linea radicale pelosa non rigenerante. Le barre della scala rappresentano 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66223/66223fig03.jpg"> Figura 3: Foto rappresentative di piante wild-type di B. napus e A. thaliana e rigeneranti derivati da radici pelose (piante T0). Si noti il fenotipo Ri dei rigeneranti. Le barre della scala rappresentano 2 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66223/66223fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Il protocollo descrive l'induzione della radice pelosa utilizzando steli di infiorescenza primaria di Arabidopsis e ipocotili di Brassica napus . Le radici pelose possono essere coltivate e utilizzate come espianti per rigenerare piante transgeniche.

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a ...

La nostra ricerca ha avuto come obiettivo lo sviluppo di un protocollo per una trasformazione efficiente delle Brassicaceae. Utilizzando una trasformazione basata sulla radice dei capelli, abbiamo migliorato notevolmente l'efficienza di trasformazione in Brassica napus, che è fondamentale per la nostra ricerca. Abbiamo anche testato il protocollo nella specie modello Arabidopsis thaliana.Abbiamo ottimizzato il protocollo per le cultivar primaverili DH12075 in Brassica napus. La prossima sfida è quella di ottimizzare il protocollo di trasformazione e rigenerazione delle cultivar invernali in Brassica napus, così come per Brassica rapa e Brassica oleracea. Le radici pelose possono essere facilmente propagate e la loro rapida crescita consente l'analisi tempestiva del gene di interesse poco dopo la trasformazione.Di conseguenza, diventa possibile rigenerare selettivamente specifiche linee di radici pelose che presentano il tratto desiderato. Ad esempio, una mutazione genetica introdotta da CRISPR-Cas.

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Research

JoVE Journal

Biology

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana and Brassica napus

2.0K Views.  Masaryk University. La nostra ricerca ha avuto come obiettivo lo sviluppo di un protocollo per una trasformazione efficiente delle Brassicaceae. Utilizzando una trasformazione basata sulla radice dei capelli, abbiamo migliorato notevolmente l'efficienza di trasformazione in Brassica napus, che è fondamentale per la nostra ricerca. Abbiamo anche testato il protocollo nella specie modello Arabidopsis thaliana.Abbiamo ottimizzato il protocollo per le cultivar primaverili DH12075 in Brassica napus. La prossi...

Video: Autore in primo piano: Ottimizzazione dei protocolli di trasformazione basati sulle radici pelose per una maggiore efficienza nelle Brassicaceae

Hairy root transformation represents a versatile tool for plant biotechnology in various species. Infection by an Agrobacterium strain carrying a Root-inducing (Ri) plasmid induces the formation of hairy roots at the wounding site after the transfer of T-DNA from the Ri plasmid into the plant genome. The protocol describes in detail the procedure of the injection-based hairy root induction in Brassica napus DH12075 and Arabidopsis thaliana Col-0. The hairy roots may be used to analyze a transgene of interest or processed for the generation of transgenic plants. Regeneration medium containing cytokinin 6-benzylaminopurine (5 mg/L) and auxin 1-naphthaleneacetic acid (8 mg/L) successfully elicits shoot formation in both species. The protocol covers the genotyping and selection of regenerants and T1 plants to obtain plants carrying a transgene of interest and free of T-DNA from the Ri plasmid. An alternative process leading to the formation of a composite plant is also depicted. In this case, hairy roots are kept on the shoot (instead of the natural roots), which enables the study of a transgene in hairy root cultures in the context of the whole plant.

The protocol describes hairy root induction using Arabidopsis primary inflorescence stems and Brassica napus hypocotyls. The hairy roots can be cultured and used as explants to regenerate transgenic plants.

Ricerca

Biologia

Agrobacterium-Mediated Hairy Root Transformation in Brassica napus DH12075

To begin, place the seeds of Brassica napus DH12075 in micro-tubes. To degrease the seeds, add water and 0.1%detergent to the micro-tube, and shake for 60 seconds. Now rinse the seeds with water followed by 70%ethanol, each for 60 seconds.Next, place the seeds in 10%sodium hypochlorite solution and shake for 20 minutes. After removing the bleach, wash the seeds four times with sterile water for 60 seconds each. Place the seeds on a Petri dish containing the seed germination medium.Cold stratify the seeds at four degrees celsius overnight before moving the dish to a cultivation room. After five days, transfer the seedlings to a plant culture box containing a plant growth medium. Inoculate Ti less agrobacterium tumefaciens C58C1 carrying a hairy root-inducing plasmid PRIA 4B in five milliliters of LB medium.Grow the culture overnight at 28 degrees Celsius until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to one. Transfer the bacterial inoculum into the syringe. Using a 26-gauge needle mounted on the syringe, puncture the hypocotyl of an 18-day-old seedling at about one centimeter above the growth medium.Inject approximately 50 microliters of inoculum into the wound and scratch the tissue on the surface of the hypocotyl. Return the plant to the cultivation room at 21 degrees Celsius for two to four weeks. Next, cut off the callus with emerged hairy roots from the hypocotyl.Place the callus with hairy roots on a Petri dish containing hairy-root growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth. Seal the dish with gas-permeable tape before incubating it at 24 degrees Celsius. After incubation, isolate the hairy roots from the callus, and transfer the individual roots to a hairy-root growth medium.Alternatively, to generate a composite plant consisting of wild-type shoots and transgenic hairy roots, remove the native roots of the plant. Then transfer the plant with emerging hairy roots to a culture box containing plant-growth medium and antibiotics to suppress agrobacterial growth.

Trasformazione della radice pelosa mediata da agrobatteri in Brassica napus DH12075

Regeneration and Selection Methods for Brassica napus DH12075 Regenerants and T1 Plants

Under sterile conditions, using tweezers, transfer five to 10 hairy root lines of Brassica napus on a dish containing regeneration medium. Seal the dish with gas permeable tape and culture at 21 degrees Celsius in a long-day photoperiod. Every three to four weeks, transfer the hairy roots to a Petri dish with fresh regeneration medium.Observe the callous formation after approximately two weeks and shoot from the callous after two more weeks of callous formation. Individualize the shoots and transfer them to the plant culture box containing the shoot elongation medium. After two to three weeks, cut off the remnants of the callous from the shoot and transfer the elongated shoots to the plant culture box containing root induction medium.Now transfer the rooted plant to the soil and acclimatize it first in the phytotrons Then transfer the plant to a greenhouse for flowering. To speed up the production of T1 plants, collect siliques containing mature green seeds from the T0 regenerants. While working in a sterile flow box, surface sterilize the siliques with 70%ethanol.Place the siliques on a plate lid or a slide. Using a 24 gauge needle mounted on a one milliliter syringe, slit the siliques along the valve margins. Open the carpals and put them aside.Collect the immature seeds and transfer them to a plate containing seed germination medium. Seal the plate and place it in a cultivation room until germination. Compared to the wild-type, hairy root regenerative of B.napus displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.

Metodi di rigenerazione e selezione per Brassica napus DH12075 rigeneranti e piante T1

Hairy Root Transformation and Regeneration in Arabidopsis thaliana Col-0

To begin, place the surface-sterilized Arabidopsis thaliana Col-0 seeds onto a plate containing seed germination medium. After two days of cold stratification, move the plate to a cultivation room set at 21 degrees Celsius with a long day photoperiod and 50%humidity. Transfer one-week old seedlings to a plant culture box with a plant growth medium.Grow the Agrobacterium tumefaciens culture in LB medium until it reaches an optical density at 600 nanometers of 0.9 to 1. Using a needle mounted on an insulin syringe, inject approximately 50 microliters of bacterial culture at the base of the primary inflorescent stem of a one-month old Arabidopsis plantlet. Scratch the tissue on the surface of the primary stem with the syringe.After two to four weeks, excise the emerging hairy roots and cultivate them on a Petri dish with the hairy root growth medium supplemented with antibiotics to suppress agrobacterial growth. Culture the hairy root at 24 degrees Celsius in the dark. After one to two weeks, individualize the hairy roots on the plate with hairy root growth medium and transfer selected hairy root lines to a fresh medium every four to five weeks.Transfer the hairy roots to a plate with a regeneration medium to induce callus formation, and culture at 21 degrees Celsius in a long day photoperiod. Once the shoots emerge from the callus, cut the shoots and transfer them to a shoot elongation medium for two to three weeks to promote growth and elongation. Then transfer the elongated shoots to the root induction medium.Finally, transfer the rooted plant to the soil to perform transgenic selection. In A.thaliana, yellow calli were induced within 14 days in all tested hairy root lines. First shoot primordia, visible as dark green spots, emerged within three weeks after transfer to the regeneration medium.After four weeks, shoots covered the hairy roots in 90%of the lines, with some cases showing adventitious root formation. However, one line did not regenerate even after three months. Compared to the wild type, hairy root regenerants of A.thaliana displayed a dwarf phenotype with dense root systems, wrinkled leaves, and altered flowering time.