This work was supported by the Ogelbay fund.

1. Crescere Piante <ol><li> 6 settimane prima immersione, riempimento 5 pentole pollici con terreno e seminare semi di lino ¼ pollice profondo nel terreno (4 semi per piatto). Assicurati di rassodare il terreno sopra i semi. Innaffiare le piante regolarmente e mantenere in lungo luce diurna (luce 14 ore e 10 ore scuro). </li><li> Controllare le piante regolarmente infiorescenze primari (cluster di organi fiori &quot;). Le piante sono pronte per la trasformazione quando le gemme sono visibili e hanno appena formata nella infiorescenza (figura 1 e 2). Per vedere i germogli, tagliare le foglie intorno ad esso, se necessario. NOTA: Usando il miglior palcoscenico fiore è critica ed è dettagliato nella discussione. <ol><li> Utilizzare il ramo principale dell&#39;impianto per il trattamento sperimentale in quanto produce più fiori che i rami laterali. Utilizzare i rami laterali sia come controlli (non essere immersi) o per altri trattamenti sperimentali. </li><li> In alternativa, utilizzare i principali e laterali ramistesso impianto per il trattamento sperimentale e utilizzare un&#39;altra pianta come controllo o per altri trattamenti sperimentali. Utilizzare le etichette per contrassegnare i singoli rami e fiori singoli con la data e il tipo di trattamento. </li></ol></li></ol> 2. Clonazione e trasformazione per Escherichia coli (E. coli) Cells <ol><li> Clone il frammento / gene di interesse nel sito di clonaggio multiplo di una pianta vettore binario ospitare il T-DNA. <ol><li> Eseguire la clonazione in un passo o due gradini. <ol><li> Direttamente clonare piccoli inserti in questo protocollo (~ 500 bp) nell&#39;impianto binario vettoriale. In questo protocollo, utilizzare lo stabilimento vettore binario (PRI909). In caso contrario, utilizzare altri vettori binari di piante in una strategia simile. </li><li> In alternativa, clonare inserti di grandi dimensioni (≥6.5 kb) in due fasi: la prima con un kit generale clonazione commerciale (non piantare specifico), poi sottoclone nella pianta vettore binario. </li></ol></li></ol></li><li> Impostare una reazione PCRzione per amplificare il gene di interesse. Progettare i primer con siti di restrizione alla fine del 5 &#39;(secondo il sito di clonazione multiplo pianta del vettore binario in uso). <ol><li> Eseguire PCR standard utilizzando DNA genomico di lino con le seguenti condizioni di ciclo: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 30 cicli di 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec, e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. </li><li> I prodotti di PCR separate sul 1% Tris / borato / EDTA (TBE) gel, corrono il gel a 100 V per 1 ora. Purificare i prodotti dal gel e quantificare via Nanodrop. </li></ol></li><li> Impostare il mix legatura per clonare il prodotto di PCR nel vettore di clonaggio commerciale. Seguire il protocollo del produttore. </li><li> Trasforma il mix legatura in chimicamente competente E. coli come segue. <ol><li> Aggiungere 2 ml di mix legatura in un flaconcino di chemically competente E. coli. Incubare in ghiaccio per 30 min. </li><li> Heat Shock le cellule per 30 sec a 42 ° C (Heat tempo shock e temperatura dipende dal tipo di cellule utilizzate). </li><li> Incubare in ghiaccio e aggiungere 250 ml di brodo RT eccellente ottimale con repressione da cataboliti (SOC) di media. </li><li> Chiudere la provetta e incubare in un agitatore orbitale a 200 rpm a 37 ° C per un ora. </li><li> Distribuire 10 - 50 microlitri da ogni trasformazione su una piastra preriscaldata LB (preriscaldata a 37 ° C) + antibiotico appropriato selettiva (determinare l&#39;antibiotico selettivo in base al tipo di clonazione commerciale vettore utilizzato). Incubare le piastre a 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Scegli ~ 10 colonie per mini depurazione preparazione plasmide, utilizzando un kit commerciale. Mini purificazione preparazione plasmide viene generalmente eseguita come segue. NOTA: i nomi di buffer sono specifici per il kit commerciale utilizzato, ma le loro funzioni generali sono simili. <ol><li> Inoculare le singole colonie in 2- 5 ml terreno LB contenente l&#39;antibiotico selettiva appropriata (determinato in base al tipo di vettore commerciale utilizzato). </li><li> Incubare per circa 8 ore a 37 ° C con scuotimento vigoroso (~ 300 rpm). </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione a 6.000 xg per 10 min. </li><li> Risospendere il pellet nel tampone di risospensione 250 microlitri. Mescolare e vortex per disperdere completamente il pellet. </li><li> Lyse le cellule batteriche aggiungendo 250 ml di tampone di lisi, mescolare accuratamente invertendo i tubi 4 - 6 volte. </li><li> Neutralizzare il lisato nel buffer neutralizzazione e invertire 4 - 6 volte per mescolare. Centrifugare per 10 minuti a ~ 17.900 xg in una microcentrifuga tavolo. </li><li> Trasferire il surnatante dal passaggio precedente per una colonna di spin. Centrifugare nuovamente ~ 17.900 xg per 30 - 60 a sec. </li><li> Lavare la colonna di spin aggiungendo 0,75 ml tampone di lavaggio e centrifuga per 30-60 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Centrifuga per un ulteriore 1 min Remove tampone di lavaggio residuo. Porre la colonna di spin in un ambiente pulito 1,5 ml provetta. Per eluire DNA, aggiungere acqua 50 microlitri al centro di ogni colonna. Lasciate riposare per 1 minuto, e centrifugare per 1 min. </li></ol></li></ol> 3. Analizzare il purificato Plasmidi per la presenza di Insert <ol><li> Limitazione Digest: <ol><li> Impostare una restrizione digest per determinare la presenza dell&#39;inserto per digestione del plasmide con gli enzimi di restrizione usati per clonare l&#39;inserto. Un tipico doppio restrizione digerire reazione come segue: 1 mg di plasmide purificato, 1 ml di ogni enzimi di restrizione, 2 ml 10x restrizione digerire tampone + 2 pl BSA (se applicabile), X ml di acqua (per un totale di 20 microlitri) </li><li> Miscelare delicatamente e incubare a temperatura consigliata (varia da un enzima all&#39;altro). </li><li> Analizzare la restrizione digerire reazione 1% TBE gel, correre a 100 V per 1 ora e cercare drop-out di dimensioni adeguate. </li></ol></li><li> Analisi PCR: <ol><li> Impostare una PCR con il plasmide purificato, utilizzando primer dalla regione vector commerciale per amplificare all&#39;interno dell&#39;inserto o la giunzione tra il vettore e l&#39;inserto. Primer comuni sono M13 avanti e indietro e primer T3 / T7. </li><li> In questo protocollo, utilizzare le seguenti condizioni di ciclo di PCR: una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 minuti a 94 ° C, seguita da 18 cicli a 98 ° C per 5 sec, 60 ° C per 15 sec e 72 ° C per 2 min. Eseguire una fase di estensione finale a 72 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. </li><li> Prodotti Load PCR su un TBE gel 1% e correre per 100 - 120 V per 1 ora. </li></ol></li><li> Sequencing: <ol><li> Invia il plasmide purificato in un impianto commerciale sequenziamento per analizzare e confermare la presenza dell&#39;inserto. </li><li> Una volta ottenuto il costrutto corretta, utilizzare per la seconda fase di clonazione (nella pianta vettore binario). NOTA: i passaggi 2,3-3,3può essere eliminato se la clonazione è completata in un solo passo. </li></ol></li></ol> 4. Clonazione nell&#39;impianto Binary Vector (PRI909) e E. coli Transformation <ol><li> Impostare una doppia restrizione digerire reazioni linearizzare la pianta vettore binario e isolare l&#39;inserto precedentemente clonato utilizzando gli stessi siti di restrizione enzimi che sono stati aggiunti i primer (punto 2.2). </li><li> Analizzare i digest restrizione con elettroforesi su gel, correre a 100 V per 1 - 2 ore. Tagliare l&#39;inserto e la pianta linearizzato vettore binario dal gel. </li><li> Utilizzare un kit commerciale per purificare i prodotti in gel. Consultare il manuale del costruttore. </li><li> Impostare una reazione legatura per legare l&#39;inserto nella pianta vettore binario. L&#39;inserto rapporto vettore dipende dalla dimensione dell&#39;inserto e la pianta vettore binario. In questo protocollo l&#39;inserto LIS1 era 6,5 ​​kb e la pianta vettore binario è stato di 9 kb. Quindi, utilizzare un 1: 2 inserto rapporto vettoriale. </li><li&gt; Ripetere i passaggi 2,4-3 per la trasformazione batterica, la purificazione plasmide e analisi. Una volta ottenuto il costrutto corretta (insert + pianta vettore binario), procedere al elettroporazione al punto 5. </li></ol> 5. elettroporazione in Agrobacterium tumefaciens Cells elettricamente competenti <ol><li> Scongelare una fiala di Agrobacterium tumefaciens cellule elettricamente competenti sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere 1 ng di binario DNA vettore plasmidico a 20 ml di cellule competenti, sul ghiaccio, e mescolare delicatamente. </li><li> Raffreddare un 0,1 centimetri cuvetta elettroporazione sul ghiaccio. </li><li> Trasferire la miscela cellule / DNA competente per le cuvette di elettroporazione, e toccare per raccogliere la miscela a fondo. Inserire la cuvetta nella macchina elettroporatore e impulsi (condizioni di tensione e di tempo dipendono dalle dimensioni della cuvetta e elettroporatore utilizzato). </li><li> Aggiungere 1 ml di media SOC e cellule di trasferimento in una provetta da 15 ml. </li><li> Incubare per 1 ora a 28 - 30° C, agitando a 100 rpm. Tavola 50 - 100 microlitri di cellule su agar LB + antibiotico appropriato selettiva (dipende dalla pianta plasmide binario e il ceppo di Agrobacterium utilizzata In questo uso protocollo 50 ug / ml di kanamicina e 100 mg / ml di streptomicina.). </li><li> Incubare le piastre fino a 48 ore a 28 - 30 ° C. </li><li> Ripetere il punto 2.5 per la selezione delle colonie e purificazione plasmide. </li><li> Ripetere passaggio 3 per analizzare il plasmide e per verificare l&#39;integrità dell&#39;inserto e T-DNA prima di utilizzare il costrutto floreale-dipping. Ripetere il passaggio 3.2, l&#39;utilizzo di più primer PCR in tutta la regione inserita e in tutte le regioni T-DNA e sequenziamento come al punto 3.3. NOTA: In questo protocollo 4 primer diversi sono stati progettati in tutto il T-DNA e 10 primer attraverso l&#39;inserto. </li><li> Una volta che la presenza della pianta plasmide binario nella colonia Agrobacterium selezionata viene confermata, luogo celle in 50% glicerolo e conservare a -80 ° C. Conservare rimanendo colonie sulla piastra a 4 ° C se devono essere utilizzati entro una settimana 7. </li></ol> 6. Floral-immersione NOTA: 2 giorni prima Floreale-immersione: <ol><li> Crescere cellule tumefaciens alla fase stazionaria (OD 600 tra 0,5-1 è accettabile) in LB + antibiotici appropriati in mezzi liquidi. NOTA: Questi sono gli stessi antibiotici come al punto 5.6, in base vegetale vettore binario e il tipo di ceppo Agrobacterium utilizzato. </li><li> Avviare la coltura di 1: 100 di diluizioni saturo (5 ml) O / N cultura e crescere per 24 - 48 ore a 28-30 ° C agitando a 150 rpm. La cultura dovrebbe aver raggiunto la fase midlogarithmic e più probabile sarà avvicinamento o in fase stazionaria 1. OD di circa 0,8 (OD nuovamente tra 0,5 e 1 è tutto accettabile) 8. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 5.000 xg a RT. </li><li> Risospendere le cellule in terreno infiltrazione (5,0% di saccarosio + ,05-0,003% Silwet L-77). Per il primo turno di immersione, utilizzare 0,05% Silwet-77. Per il secondo e terzo ciclo, ridurre la concentrazione di 0,03% (descritto Discussione). </li><li> Procedere con il passo floreale-dip. Posare la pianta su un fianco e immergere solo i germogli visibili nel mezzo di infiltrazione per 1-2 min. Lasciare la pianta su un lato e coprire con pellicola trasparente per mantenere alta umidità nella cupola (Figura 3). </li><li> Il giorno successivo, posizionare l&#39;impianto in posizione verticale e mantenere normalmente. </li><li> Quando la gemma cresce più grande (di solito dopo circa 10 - 14 giorni), ripetere i passaggi 6,1-6,4. Ridurre il tempo di immersione per 30-60 sec e Silwet-77 concentrazione 0,003%. </li><li> Mantenere le piante normalmente fino loro semi sono maturi e pronti per essere raccolti (figura 4). </li></ol> 7. La selezione di Tra Positivensformants con PCR diretta <ol><li> Seminare i semi T1 sul suolo come al punto 1.1. <ol><li> In alternativa, fare Murashige e Skoog sale basale (MS media) con l&#39;aggiunta di 2,2 g di MS media + 4 g di agar-agar in 500 ml di acqua. Autoclave e versare in piccoli vasi per piante. Conservare nel 4 ° C fino all&#39;uso. </li><li> Seminare il seme mettendoli sul supporto MS solidificato. Tenere sotto lunga diurna (luce 14 ore e 10 ore di buio). I semi germinano in circa 4-6 giorni (Figura 5). </li><li> Utilizzare un seme di ogni fiore come un punto di partenza. Se si ottiene alcun trasformante positivo, ripetere questo passaggio con la scelta di un altro seme dal fiore. NOTA: test semi diversi dagli stessi fiori, perché in alcuni casi non tutti i semi da un fiore saranno trasformati. Selezione di semi supplementari da fiori sperimentali volte è necessario. </li></ol></li><li> Controllare sulle piantine regolarmente. In circa 10 - 14 giorni dopo la germinazione, quando la veralascia sviluppare, testare le piante con PCR diretta. </li><li> Preparare l&#39;estratto di foglie di DNA tagliando 2 - 3 foglie (5-10 mg in peso) da ciascuna piantina e metterli in una provetta. </li><li> Aggiungere 180 ml di NaOH 50 mm per ogni tubo, e incubare per 10 minuti a 95 ° C. </li><li> Neutralizzare l&#39;estratto aggiungendo 20 ml di 1 M Tris-HCl (pH 8,0). </li><li> Usare 1 ml di estratto nella reazione diretta PCR, utilizzando primer disegnati tutti i T-DNA o l&#39;inserto (Figura 7), per selezionare trasformanti positivi. <ol><li> In questo protocollo, utilizzare PCR diretta con una presa iniziale di 24 ° C, quindi 2 min a 98 ° C, seguiti da 40 cicli di (98 ° C per 10 sec, fase di ricottura per 15 secondi, ed una fase di allungamento a 68 ° C). Eseguire una fase di estensione finale a 68 ° C per 5 minuti, seguito da una presa indefinita a 4 ° C. (Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli su primer, temperature di ricottura e tempi di estensione per i cicli). </li></ol></li><li> Identificare trasformanti positivi e farle crescere alla maturità. Se i semi sono stati germinati in mezzo MS, trapianto suolo in un vaso più grande (Figura 5). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

In alcune specie vegetali, come lino (Linum usitatissimum), trasformazione pianta successo è stato limitato. In precedenza, la trasformazione in lino ha richiesto una infezione da Agrobacterium ferendo e co-coltivazione, applicando particelle Biolistic o mediante ultrasuoni sonicazione, seguita da rigenerazione; un processo che è sia lungo e soggetto ad essere accompagnato da molti eventi mutazionali. Inoltre, il processo di selezione di queste tecniche richiede l&#39;uso di marcatori selezionabili antibiotici come kanamicina. Tuttavia, è stato osservato in letteratura che questo metodo di selezione produce molti falsi positivi, come il lino tende a sfuggire alte concentrazioni di antibiotici 6,9,14. Un altro svantaggio delle tecniche precedenti trasformazione di lino è la velocità di trasformazione bassi 2,6. Nel protocollo qui descritto, Agrobacterium trasformazione dell&#39;impianto mediata tramite floreale-immersione è stato mostratocomportare un tasso di trasformazione alta per il lino (50 - 60%). Trasformanti sono stati ottenuti da fiori anabbaglianti e raccolti dalle principali e laterali rami. Selezione di trasformanti positivi è stato semplicemente fatto la coltivazione di piante T1 sul suolo e screening loro foglie subito dopo che germogliavano, by-passando l&#39;uso di antibiotici di selezione, un passo in precedenza utilizzato come norma in floreale-dip per altre specie vegetali. Per eseguire l&#39;analisi diretta PCR di foglie, e utilizzando gli appositi primer T-DNA, trasformanti positivi possono essere rapidamente selezionati. Questa tecnica è semplice, economico e di facile esecuzione, ma comporta una frequenza di trasformazione molto superiori a quelli precedentemente riportati per Arabidopsis e altre specie vegetali utilizzando questo metodo 1,10,12. E &#39;anche il più alto tasso di trasformazione segnalato per il lino. Tuttavia, vi sono fasi critiche nelle procedure compresa la selezione dei migliori fase del fiore e la migliore concentrazione di tensioattivo, in modo chel&#39;Agrobacterium può penetrare nelle cellule vegetali senza uccidere gli organi di fiori. Se uno stadio precoce del germoglio viene utilizzato (Figura 2A) con alta concentrazione Silwet-77 di più di 0,05%, il fiore non svilupperà né prevedere semi. Se tardivamente germoglio viene utilizzato (Figura 2C), anche se la trasformazione potrebbe funzionare, si verificherà ad un tasso molto più basso. Risultati simili sono stati ottenuti con Arabidopsis dip floreale trasformazione 1,4. Per questo protocollo, tutte le fasi floreali sono stati testati con differenti Silwet-77 concentrazioni e il miglior palcoscenico era determinato a essere il palcoscenico del germoglio centrale (Figura 2C) con Silwet-77 a 0,05% per la prima immersione, seguita da una seconda immersione a la fase tardiva del germoglio (figura 2C) con un po &#39;ridotta concentrazione Silwet-77 del 0,03%. La trasformazione ha funzionato bene anche con la fase germogliamento precoce (Figura 2A) con una bassa concentrazione Silwet-77 di 0,003%, seguito dauna seconda fase di immersione con germoglio centrale (Figura 2B) a maggiore concentrazione Silwet-77 allo 0,05%. In questo protocollo, altri parametri sono stati tentato di ottimizzare la velocità di trasformazione, ma ha trovato ad avere effetti sul risultato finale. Esempi includono l&#39;estensione del tempo di immersione, dopo che le piante laici al loro fianco e rivestiti in plastica da un giorno a due giorni; utilizzando un OD superiore a 1 per la cultura Agrobacterium, invece di 0,5 - 1; aumentando il tempo di immersione 5 - 15 min invece di 1 - 2 min. Ancora una volta non abbiamo notato alcun effetto sul tasso di trasformazione utilizzando queste strategie. I fattori più efficaci, tuttavia, sono stati trovati a utilizzare piante sane nelle fasi di fiori corretti, e con la migliore concentrazione Silwet-77. Abbiamo notato che due intervalli di immersione, in qualche modo funziona meglio di una volta, anche se una immersione volta funziona anche. Modifiche a questo protocollo può essere raggiunto reducing concentrazione Silwet-77 per il meno 0,003% nel secondo o terzo dipping. Dal Silwet-77 è tossico, troppo alto risultati concentrazione nei fiori sviluppando male, con conseguente non resa in semi. La frequenza immersione può essere ridotta a uno, con il secondo o terzo eventi eliminati se le piante non stanno cercando sano e le gemme non stanno sviluppando bene. Una limitazione importante di questa tecnica è il basso numero di fiori prodotti dal lino, il numero limitato di semi ottenuti da ogni fiore, e la lunga durata di lino. Ci vogliono 6-8 settimane dalla semina di sementi di avere le gemme primarie pronto per la prima immersione e un ulteriore 8 - 10 settimane dopo l&#39;immersione per arrivare alla generazione T1. In totale, una gamma di 5 - è necessaria sei mesi per ottenere la generazione T1. A differenza di altre specie di piante, che fioriscono in qualsiasi momento dell&#39;anno, alcune varietà di lino fiore meglio in momenti specifici dell&#39;anno. Pianificazione così premuroso di questa tecnica è importante. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In sintesi, i risultati del dip floreale con due diverse varietà di lino: il lino fibra, Stormont Cirrus (plastica reattivo e), e del lino olio, Bethune (stabili e non reattivi), mostrano che Agrobacterium - trasformazione vegetale mediata tramite floreale-dip è un metodo applicabile ed efficiente per la trasformazione di lino e può essere utilizzato per sostituire le tecniche utilizzate in precedenza per la trasformazione di lino. Le modifiche del metodo floreale-dip in questo protocollo saranno applicabili per l&#39;uso con altre specie vegetali e non limitato a lino.

Lino (Linum usitatissimum) è una coltura importante coltivato ampiamente per le sue fibre e oli. Trasformazione del genoma di lino è possibile con tecniche come ferite, infezioni Agrobacterium, e co-coltivazione in coltura tissutale, applicando particelle Biolistic o ultrasuoni ultrasuoni seguita da rigenerazione. Tuttavia, queste tecniche hanno molti svantaggi, tra cui propensione a molti eventi mutazionali e un tempo prolungato per ottenere le linee transgeniche. Alcuni di questi metodi possono anche essere costosi e richiedono la manipolazione abile ed efficiente degli strumenti, con conseguente recupero piantine basse. Ancora più importante, queste tecniche spesso sfociano in un basso tasso di trasformazione 2,6. Agrobacterium trasformazione impianto mediata tramite floreale-dip è un approccio semplice ed efficace per generare piante transgeniche. È stato regolarmente ed usato con successo per molte specie vegetali come Arabidopsis Thalianun 1,4, Medicago truncatula 11, pomodoro 12, 13 grano e mais 10. Tuttavia, non è stato pensato come una tecnica praticabile per la trasformazione di lino a causa di diversi fattori, quali il basso numero di fiori prodotti da lino, il numero limitato di semi ottenuti da ogni fiore, la dimensione del seme grande, e il cappotto spesso, che potrebbe anche essere problematico per tale processo di trasformazione genetica. Inoltre, il segmento selezione della tecnica floreale-dip richiede germinare semi trasformati su un supporto di pianta che contiene un antibiotico, con progenie trasformate distinguono in base alla loro capacità di germogliare e rimanere verde, mentre progenie non trasformati o non germinare o germinare, ma candeggina rapidamente e morire. Nella letteratura, è stato notato che wild-type di lino tende a sfuggire alta concentrazione di selezioni antibiotici, producendo risultati falsi positivi, e rendendo la selezione di progenie T1 basatosulla resistenza agli antibiotici più difficile 6,14. Inoltre, quando una elevata concentrazione di antibiotico è stato aggiunto al mezzo di selezione, il tasso di trasformazione osservato sceso drasticamente 9. In questo protocollo, abbiamo utilizzato Agrobacterium e il metodo floreale-dip per trasformare una linea di lino tessile, Stormont Cirrus (reattivo e plastica), che ha dimostrato di rispondere alle sollecitazioni del contesto alterando suo genoma 3,5. Per superare il problema di fuga antibiotico, abbiamo scelto di fare il test del DNA PCR diretta da foglie T1, invece di selezione aggiungendo l&#39;antibiotico ai media dell&#39;impianto. Abbiamo approfittato della semplice anatomia del lino per tenere traccia dei fiori specifici al momento del trattamento. Questo sistema di monitoraggio ha consentito la selezione di semi di fiori specifici e germinazione sul suolo, senza l&#39;aggiunta di antibiotico. Trasformanti positivi sono stati semplicemente identificati con il test del DNA ottenuto dalle foglie utilizzando il veloce ed efficiente metodo of PCR diretta. I nostri risultati dimostrano che il metodo floreale-dip ha lavorato molto bene in questa linea di lino e sorprendentemente portato ad un tasso di trasformazione molto elevata (50 - 60%), superiori a quelli precedentemente osservati per Arabidopsis thaliana, che è stato segnalato per essere 0,1-1 1%, e anche più elevato rispetto ad altre specie vegetali 10,12. Abbiamo anche provato un&#39;altra varietà di semi di lino (lino olio), Bethune (stabili e non reattivi), e nostri dati preliminari indicano che floreale-dip funziona anche per questa varietà di lino. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare che Agrobacterium e floreale-dip possono essere utilizzati per generare il lino transgenico. Abbiamo dimostrato che questa tecnica è semplice, poco costoso, e più veloce di altri metodi di trasformazione di lino. Ancora più importante risulta in una velocità di trasformazione molto più alto rispetto agli altri metodi di lino trasformazione 2,6. L&#39;anatomia di Arabidopsis thaliana, che ha molti rami e fiori, maKES difficile distinguere immerso e fiori non tuffato sulla stessa pianta. Pertanto, un gran numero di semi, circa 20.000 semi per piante, devono essere sottoposti a screening per identificare trasformanti positivi 8. Lino, d&#39;altro canto, ha meno filiali (un ramo principale e alcuni rami laterali) e un minor numero di fiori, che producono circa 100 semi per piante, che permette di monitorare i singoli fiori e per selezionare i semi specifici durante il processo di screening. Proponiamo che floreale-dip è un metodo applicabile per trasformare qualsiasi specie affini di lino, un genere di circa 200 specie. Questo metodo fornisce velocità di trasformazione molto più elevato rispetto ad altri metodi di trasformazione di lino. Proponiamo inoltre che la proiezione diretta PCR di T1 foglia DNA è un modo efficace per superare il problema della fuga resistenza agli antibiotici che spesso produce molti falsi positivi. Proiezione diretta PCR può essere applicato ad altre specie vegetali e non è limitata to di lino. La semplice tecnica di inseguimento sementi impiegata in questo protocollo può essere applicato ad altre specie vegetali con ramificazione anatomia simile al lino.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="762">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5&#34; pots</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">potting soil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">greenhouse with appropriate light setting</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermocycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose gel electropheresis equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">digital imaging setup</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silwet-77&#160;</td>
			<td>LEHLE SEEDS</td>
			<td>VIS-01</td>
			<td>Toxic, wear gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GoTaq Green Master Mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>Part# 9PIM712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Terra PCR Direct Polymerase Mix</td>
			<td>Clontech</td>
			<td align="right">639270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binary vector PRI 909</td>
			<td>Takara</td>
			<td align="right">3260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E</td>
			<td>Takara&#160;</td>
			<td align="right">9115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TOPO TA cloning kit</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>K4595-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose&#160;</td>
			<td>fischer scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">electroporator and cuvettes</td>
			<td>bio-Rad</td>
			<td>165-2092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaker&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">spinner&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">platic wrap and aluminum foil wrap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">speedSTAR DNA polymerase</td>
			<td>Takara</td>
			<td>RR070A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QlAquick gel extraction kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAGEN plasmid mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3138S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SacI-HF enzyme</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R3156S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligation kit</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Murashige Skoog</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M5524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar</td>
			<td>fisher scintific</td>
			<td>A360-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

floral-dip transformation of flax (linum usitatissimum) to generate transgenic progenies with a high transformation rate

Agrobacterium trasformazione vegetale mediata tramite floreale-dip è una tecnica ampiamente usato nel campo della trasformazione delle piante e &#39;stato segnalato successo per molte specie vegetali. Tuttavia, non è stato riportato il lino (Linum usitatissimum) trasformazione da floreale-dip. L&#39;obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire che Agrobacterium e il metodo floreale-dip può essere utilizzato per generare il lino transgenico. Abbiamo dimostrato che questa tecnica è semplice, economico, efficiente e, soprattutto, fornisce una velocità di trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per trasformazione di lino. In sintesi, infiorescenze di lino sono stati immersi in una soluzione di Agrobacterium trasportano un plasmide vettore binario (frammento di T-DNA più la sequenza di inserimento Linum, LIS-1) per 1 - 2 min. Le piante sono state poste su di un lato per 24 ore. Poi, le piante sono stati mantenuti in condizioni normali di crescita fino al trattamento successivo. Le process di immersione è stata ripetuta 2 - 3 volte, con circa 10-14 giorni d&#39;intervallo tra immersione. I semi sono stati raccolti e T1 germinati sul suolo. Dopo circa due settimane, progenie trattati sono stati testati con PCR diretta; 2 - 3 foglie sono stati utilizzati per pianta più appropriati primer T-DNA. Trasformanti positivi sono stati selezionati e coltivati ​​a scadenza. La velocità di trasformazione è stato inaspettatamente elevata, con 50 - 60% dei semi di piante trattate essendo trasformanti positivi. Si tratta di un tasso di trasformazione superiori a quelli riportati per Arabidopsis thaliana e di altre specie di piante, utilizzando floreale-dip trasformazione. È anche la più alta, che è stato segnalato finora, per la trasformazione di lino utilizzando altri metodi per la trasformazione.

Figura 1 - 4 illustrano alcuni dei passaggi all&#39;interno del protocollo. Nelle figure 1 e 2, le foglie intorno ai germogli vengono tagliati infiorescenza esporle alle cellule tumefaciens e le diverse fasi germoglio che sono stati utilizzati per sviluppare il protocollo. La Figura 3 mostra il processo di lino floreale-dip. Figura 4, mostra un esempio di come le principali e laterali rami possono essere etichettati e come fiori individuo può essere rintracciato e identificato. Figura 5 mostra come le progenie T1 possono germinare sul supporto dell&#39;impianto MS e poi trapiantato a terra per la maturità. Figura 6 illustra come Wild- Tipo di lino può sfuggire alte concentrazioni di kanamicina, confermando i risultati precedenti in letteratura 6,9,14. La figura 7 mostra un esempio di amplificazione diretta PCR da trasformanti positivi T1. I fiori T1 sono stati raccolti dal main e germogli laterali di una singola pianta T0. Come si può vedere dalla PCR diretta, 8/12 piante T1 risultati positivi mediante PCR e hanno amplificato le diverse regioni del T-DNA. I nostri primer sono stati progettati anche tra i LIS-1 inserto ei siti di clonaggio multipli (Figura 7b e C). Abbiamo usato primer aggiuntivi dalla pianta vettore binario per amplificare diversi segmenti del T-DNA, come il bordo sinistro e il terminatore NOS (dati non mostrati) o il bordo destro e il sito di clonaggio multiplo (Figura 7D). Primers specifici all&#39;inserto LIS-1 sono stati usati anche in questo protocollo (dati non mostrati). Un elenco di primer è fornita in Tabella 1. Tuttavia, le sequenze di questi primer dipende dalla sequenza della pianta T-DNA vettore binario e l&#39;inserto usato per il floreale-dip. Abbiamo anche notato che non vi era alcuna differenza significativa nel tasso di trasformazione tra i fiori raccolti dalle principali e laterali rami. Figura 1. Tagliare le foglie intorno alle gemme infiorescenza principali per esporli alle cellule Agrobacterim. (A) I boccioli sono coperti da foglie. (B) Foglie sono stati tagliati intorno alle gemme per esporre loro. (C) ingrandita dell&#39;immagine da pianta in (A) dopo il taglio per esporre gemme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig2highres.jpg" /> Figura 2. Le diverse fasi del germoglio che sono stati utilizzati in questo protocollo per determinare il miglior palcoscenico da utilizzare per il tuffo floreale. (A) La fase germogliamento precoce è approssi<html> tamente 2 mm. (B) La fase di bocciolo centrale è di circa 5 mm. (C) La fase di germoglio tardivo è di circa 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig3highres.jpg" /> Figura 3. Il processo di lino floreale-dipping. (A) Le infiorescenze primarie sono immersi nei media infiltrazione contenenti le cellule tumefaciens. (B) ingrandita da (A). (C) Le piante anabbaglianti sono posati fino al giorno successivo, e le filiali anabbaglianti sono coperti di plastica per mantenere alto tasso di umidità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig1highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" /> . Figura 4. Il processo di monitoraggio fiori e sementi collezioni, dalle piante T0 trattato (A) Un esempio di tutto l&#39;impianto con il ramo principale (il ramo più alto al centro) e il lato rami (B - D). An . esempio dei fiori delle diverse branche (E) Un esempio dei semi raccolti da singoli fiori (etichettato come - k). dal ramo principale <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig5highres.jpg" /> Figura 5. Le piantine T1 sono coltivati ​​senza selezione antibiotica. (A) semi T1 sonogerminato sul supporto dell&#39;impianto MS. (B) trasformanti positivi, come determinato mediante PCR diretta, vengono trapiantate nel terreno e cresciuto fino a scadenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig6highres.jpg" /> Figura 6. fuga antibiotici, un problema per la selezione T1, è superata dalla proiezione diretta PCR. (A) Wild-tipo semi di lino germinati su supporti pianta MS senza antibiotico. (B) Wild-tipo semi di lino germinati su supporti vegetali ms + concentrazioni crescenti di kanamicina (200 mcg / ml, 600 pg / ml, 1 mg / ml). (C) wild-type semi di lino germinati MS supporti pianta con 2 mg / ml kanamicina. (D) PCR da wild-type lino e T1 piantina utilizzando primer kanamicina, tutto AMPLcato i geni kanamicina (leggende: EZ1: marcatori del DNA, FlaxS, wild-type flaxS, C: controllare non-tuffato ramo, Ma: T1 progenie di fiore &quot;a&quot; raccolti dal ramo principale, Sc, Sd, Se, Sf: T1 progenie di fiori diversi &quot;c, d, e, f&quot; raccolti dal ramo laterale, W:. no-DNA) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52189/52189fig7highres.jpg" /> Figura 7. Un esempio di successo amplificazioni di progenie T1 utilizzando il metodo diretto PCR. (A) Schema della pianta vettore binario + il clonato LIS-1 inserto. Le frecce blu indicano la posizione di primer PCR utilizzati nello screening PCR diretta (modificato da Takara). (B) PCR con primer M13F + 3 &#39;(C) PCR con primers M13R + 18a <strong&gt; (D) PCR con primer bordo destro (RB) e multiple sito clonazione (MCS) ** Ogni corsia rappresenta T1 da singoli fiori raccolti da C: ramo di controllo (non immersi), M: principale ramo di fiori ag, S: lato ramo di fiori bc &#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52189/52189fig7large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Primer Forward fonte sequenza </td><td> sequenza 5&#39;-3 &#39; </td><td> Reverse fonte sequenza di fondo </td><td> Sequenza 5&#39;-3 &#39; </td><td> Ricottura Temprature (° C) </td><td> Tempo Extension (Sec) </td><td> Dimensioni previste (bp) </td></tr><tr><td> M13F (T-DNA) </td><td> CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG </td><td> 3 &#39;(LIS-1 inserto) </td><td> GAGGATGGAA GATGAAGAAGG </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 450 </td></tr><tr><td> 18a (LIS-1 inserto) </td><td> TATTTTAACCC <td> M13R (T-DNA) </td><td> ATTAGGCACC CCAGGCTTTA </td><td> 57 </td><td> 40 </td><td> 520 </td></tr><tr><td> MCS (T-DNA) </td><td> TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG </td><td> RB (T-DNA) </td><td> TTTAAACTGA AGGCGGGAAA </td><td> 60 </td><td> 20 </td><td> 200 </td></tr><tr><td> LB (T-DNA) </td><td> TTTGATGGTG GTTCCGAAAT </td><td> NOS (T-DNA) </td><td> GAATCCTGTT GCCGGTCTT </td><td> 60 </td><td> 30 </td><td> 380 </td></tr><tr><td> NPTII (T-DNA) </td><td> GCGATACCGT AAAGCACGAG </td><td> NTPII (T-DNA) </td><td> GCTCGACGTT GTCACTGAAG </td><td> 65 </td><td> 45 </td><td> 502 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Alcuni dei primer utilizzati per la sperimentazione diretta PCR.

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Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Qui, vi presentiamo un protocollo per trasformare il lino con Agrobacterium trasformazione dell&#39;impianto mediata tramite floreale-dip. Questo protocollo è semplice da eseguire e poco costoso, ma produce un tasso trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per la trasformazione di lino.

Trasformazione Floral-Dip di lino (<em&gt; Linum usitatissimum</em&gt;) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

floral-dip-transformation-flax-linum-usitatissimum-to-generate

Research

JoVE Journal

Biology

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

28.8K Views.  Case Western Reserve University.  Qui, vi presentiamo un protocollo per trasformare il lino con Agrobacterium trasformazione dell'impianto mediata tramite floreale-dip. Questo protocollo è semplice da eseguire e poco costoso, ma produce un tasso trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per la trasformazione di lino. 

Video: Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&amp;#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floreale-dip Trasformazione Arabidopsis thaliana Per esaminare PTSO2:: β-glucuronidasi Reporter espressione genica

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

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Biologia

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Generazione di transgenici C. elegans Di Trasformazione Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic redundancy affecting simple genetics in higher plants. The novel model organism Ostreococcus tauri is the smallest free-living eukaryote known to date, and possesses a greatly reduced genome size and cellular complexity1,2, manifested by the presence of just one of most organelles (mitochondrion, chloroplast, golgi stack) per cell, and a genome containing only ~8000 genes. Furthermore, the combination of unicellularity and easy culture provides a platform amenable to chemical biology approaches. Recently, Ostreococcus has been successfully employed to study basic mechanisms underlying circadian timekeeping3-6. Results from this model organism have impacted not only plant science, but also mammalian biology7. This example highlights how rapid experimentation in a simple eukaryote from the green lineage can accelerate research in more complex organisms by generating testable hypotheses using methods technically feasible only in this background of reduced complexity. Knowledge of a genome and the possibility to modify genes are essential tools in any model species. Genomic1, Transcriptomic8, and Proteomic9 information for this species is freely available, whereas the previously reported methods6,10 to genetically transform Ostreococcus are known to few laboratories worldwide.
In this article, the experimental methods to genetically transform this novel model organism with an overexpression construct by means of electroporation are outlined in detail, as well as the method of inclusion of transformed cells in low percentage agarose to allow selection of transformed lines originating from a single transformed cell. Following the successful application of Ostreococcus to circadian research, growing interest in Ostreococcus can be expected from diverse research areas within and outside plant sciences, including biotechnological areas. Researchers from a broad range of biological and medical sciences that work on conserved biochemical pathways may consider pursuing research in Ostreococcus, free from the genomic and organismal complexity of larger model species.

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

This article describes genetic transformation of the unicellular marine alga Ostreococcus tauri by electroporation. This eukaryotic organism is an effective model platform for higher plants, possesing greatly reduced genomic and cellular complexity and being readily amenable to both cell culture and chemical biology.

Trasformazione genomica del Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Common problems hindering rapid progress in Plant Sciences include cellular, tissue and whole organism complexity, and notably the high level of genomic ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

Preparazione e iniezione di embrioni di zanzare Culex per generare mutazioni nulle utilizzando CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive organs/gametes. Recent advances in CRISPR-Cas9 genome editing technology allow for high editing efficacy and timesaving knockout mutations of endogenous candidate genes at specific sites. Additionally, Agrobacterium-mediated genetic transformation of rice is also a key method for gene modification, which has been widely adopted by many public and private laboratories. In this study, we applied CRISPR-Cas9 genome editing tools and successfully generated three male sterile mutant lines by targeted genome editing of OsABCG15 in a japonica cultivar. We used a modified Agrobacterium-mediated rice transformation method that could provide excellent means of genetic emasculation for hybrid seed production in rice. Transgenic plants can be obtained within 2&#8211;3 months and homozygous transformants were screened by genotyping using PCR amplification and Sanger sequencing. Basic phenotypic characterization of the male sterile homozygous line was performed by microscopic observation of the rice male reproductive organs, pollen viability analysis by iodine potassium iodide (I2-KI) staining semi-thin cross-sectioning of developing anthers.

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

This work describes the use of CRISPR-Cas9 genome editing technology to knockout endogenous gene OsABCG15 followed by a modified Agrobacterium-mediated transformation protocol to produce a stable male-sterile line in rice.

Agrobacterium-Mediato Trasformazione Genetica, Produzione Transgenica, e la sua applicazione per lo studio dello sviluppo riproduttivo maschile nel riso

Male sterility is an important agronomic trait for hybrid seed production that is usually characterized by functional defects in male reproductive ...

Application of Passive Head Motion to Generate Defined Accelerations at the Heads of Rodents

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular mechanisms behind the beneficial effects of exercise are poorly understood. Many physical workouts, particularly those classified as aerobic exercises such as jogging and walking, produce impulsive forces at the time of foot contact with the ground. Therefore, it was speculated that mechanical impact might be implicated in how exercise contributes to organismal homeostasis. For testing this hypothesis on the brain, a custom-designed ''passive head motion'' (hereafter referred to as PHM) system was developed that can generate vertical accelerations with controlled and defined magnitudes and modes and reproduce mechanical stimulation that might be applied to the heads of rodents during treadmill running at moderate velocities, a typical intervention to test the effects of exercise in animals. By using this system, it was demonstrated that PHM recapitulates the serotonin (5-hydroxytryptamine, hereafter referred to as 5-HT) receptor subtype 2A (5-HT2A) signaling in the prefrontal cortex (PFC) neurons of mice. This work provides detailed protocols for applying PHM and measuring its resultant mechanical accelerations at rodents' heads.

The present protocol describes a custom-designed ''passive head motion'' system, which reproduces mechanical accelerations at rodents' heads generated during their treadmill running at moderate velocities. It allows dissecting mechanical factors/elements from the beneficial effects of physical exercise.

Applicazione del movimento passivo della testa per generare accelerazioni definite alle teste dei roditori

Exercise is widely recognized as effective for various diseases and physical disorders, including those related to brain dysfunction. However, molecular ...

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is a newly isolated filamentous cyanobacterium. This paper describes how new filamentous cyanobacteria can be isolated from marine rockpools. It also describes how DNA can be extracted from filaments and how the genomes can be sequenced. Although transformation is established for many single-celled species, it is less frequently reported for filamentous cyanobacteria. A simplified method for the natural transformation of P. lacuna is described here. P. lacuna is the only member of the order Oscillatoriales for which natural transformation is established. This paper also shows how natural transformation is used to express superfolder green fluorescent protein (sfGFP). An endogenous cpcB promoter induced approximately 5 times stronger expression than cpc560, A2813, or psbA2 promoters from Synechocystis sp. PCC6803. Further, a method for the cryopreservation of P. lacuna and Synechocystis sp. CPP 6803 was established, and methods for assessing motility in a liquid medium and on agar and plastic surfaces are described.

Natural Transformation, Protein Expression, and Cryoconservation of the Filamentous Cyanobacterium Phormidium lacuna

Phormidium lacuna is a filamentous cyanobacterium that was isolated from marine rockpools. This article describes the isolation of filaments from natural sources, DNA extraction, genome sequencing, natural transformation, expression of sfGFP, cryoconservation, and motility methods.

Trasformazione naturale, espressione proteica e crioconservazione del cianobatterio filamentoso Phormidium lacuna

Cyanobacteria are the focus of basic research and biotechnological projects in which solar energy is utilized for biomass production. Phormidium lacuna is ...

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite the growing burden of tick-borne diseases, research on ticks has lagged behind insect disease vectors due to challenges in applying genetic transformation tools for functional studies to the unique biology of ticks. Genetic interventions have been gaining attention to reduce mosquito-borne diseases. However, the development of such interventions requires stable germline transformation by injecting embryos. Such an embryo injection technique is lacking for chelicerates, including ticks. Several factors, such as an external thick wax layer on tick embryos, hard chorion, and high intra-oval pressure, are some&#160;obstacles that previously prevented embryo injection protocol development in ticks. The present work has overcome these obstacles, and an embryo injection technique for the black-legged tick, Ixodes scapularis, is described here.&#160;This technique can be used to deliver components, such as CRISPR/Cas9, for stable germline transformations.

Embryo Injection Technique for Gene Editing in the Black-Legged Tick, Ixodes scapularis

The present protocol describes a method for injecting tick embryos. Embryo injection is the preferred technique for genetic manipulation to generate transgenic lines.

Tecnica di iniezione di embrioni per l'editing genetico nella zecca dalle zampe nere, Ixodes scapularis

Ticks can transmit various viral, bacterial, and protozoan pathogens and are therefore considered vectors of medical and veterinary importance. Despite ...

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack of a genetic manipulation system prevents in-depth investigation of gene function, limiting the versatility of this genus as a model. Here, a transformation protocol is presented for Plantago lanceolata, the most commonly studied Plantago species. Using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, 3 week-old roots of aseptically grown P. lanceolata plants were infected with bacteria, incubated for 2-3 days, and then transferred to a shoot induction medium with appropriate antibiotic selection. Shoots typically emerged from the medium after 1 month, and roots developed 1-4 weeks after the shoots were transferred to the root induction medium. The plants were then acclimated to a soil environment and tested for the presence of a transgene using the &#946;-glucuronidase (GUS) reporter assay. The transformation efficiency of the current method is ~20%, with two transgenic plants emerging per 10 root tissues transformed. Establishing a transformation protocol for narrowleaf plantain will facilitate the adoption of this plant as a new model species in various areas.

Agrobacterium tumefaciens-Mediated Genetic Transformation of Narrowleaf Plantain

Because of its versatile application as a model species in various fields of study, there is a need for a genetic transformation toolkit in narrowleaf plantain (Plantago lanceolata). Here, using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation, a protocol is presented that results in stable transgenic lines with a transformation efficiency of 20%.

Agrobacterium tumefaciens-Trasformazione genetica mediata della piantaggine a foglia stretta

Species in the genus Plantago have several unique traits that have led to them being adapted as model plants in various fields of study. However, the lack ...

Metodo di trasformazione della radice pelosa in un solo passaggio per l'avanzamento della biologia correlata alle radici

An Efficient and Reproducible Method for Producing Composite Plants by Agrobacterium rhizogenes-Based Hairy Root Transformation

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a powerful tool to study root-related biology. Hairy root transformation is established in a wide range of dicotyledons and in several monocotyledon species and is almost independent of the genotype. The traditional method of hypocotyl injection with A. rhizogenes to obtain composite plants is inefficient, time-consuming, laborious, and frequently causes the death of tender and tiny hypocotyl plants. A highly efficient, one-step hairy root transformation mediated by A. rhizogenes was established previously, which eliminates the need for transplanting after producing hairy roots. In this study, a partial hypocotyl and primary root were removed, the hypocotyl incision site was coated with A. rhizogenes, and&#160;then hypocotyls were planted in sterile vermiculite. After 12 days of cultivation, the hypocotyl incision expanded and new hairy roots were induced. This article provides the detailed protocol of a one-step transformation method mediated by A. rhizogenes, with its effectiveness demonstrated by producing composite plants of wild soybean, Solanum americanum, and pumpkin.

Autore in primo piano: Razionalizzazione della produzione di piante composite attraverso la trasformazione delle radici pelose mediata da Agrobacterium rhizogenes 

Here, we provide the detailed protocol of a one-step transformation method mediated by Agrobacterium tumefaciens to produce composite plants.

Un metodo efficiente e riproducibile per la produzione di piante composite mediante trasformazione delle radici pelose a base di Agrobacterium rhizogenes

Producing composite plants with transgenic roots and nontransgenic stems and buds using Agrobacterium rhizogenes-mediated hairy root transformation is a ...