Ringraziamo Emily A. Kelly per la progettazione piastra testa. Siamo grati per il sostegno di premi NIH di HAG: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 e il generoso sostegno della Neurologia Pediatrica Geoffrey Waasdorp Fondo senza la quale questo lavoro non sarebbe stato possibile. AKM è finanziato dal NIH (EY019277), Whitehall Foundation, la Fondazione Alfred P. Sloan e un Premio alla Carriera nel Scienze Biomediche dalla Burroughs Wellcome Fondo. MET è finanziato da un Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) premio di formazione post-dottorato. DFM è un tirocinante nel Programma di formazione medica Scientist, finanziato dal NIH GM07356 T32 e T32 AI049815.

1. Preparare l&#39;Animale per l&#39;imaging <ol><li> Nei nostri esperimenti, usiamo adulto CX 3 CR 1 topi GFP / + che esprimono GFP in linee di cellule mononucleate, tra cui la microglia. 4 ceppi diversi di topi possono essere utilizzati per soddisfare le esigenze di uno specifico progetto. </li><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di un cocktail di tre farmaci che consiste di 0,05 mg / kg di fentanyl, 5,0 mg / kg di Midazolam, e 0,5 mg / kg medetomidina 5. Preparazione chirurgica per TSCW inizia dopo che l&#39;animale non risponde più agli stimoli dolorosi, come come un pizzico coda. In tutto l&#39;intervento chirurgico e di imaging, manteniamo l&#39;animale su una piastra elettrica per prevenire l&#39;ipotermia post-anestesia. Se necessario, una dose di richiamo di un terzo la dose originale del cocktail anestetico può essere dato per ripristinare il piano originale anestetico. </li><li> Coprire gli occhi dell&#39;animale con una pomata oftalmica di protezione per mantenere gli occhi umidi durante l&#39;anestesia, che sopprime riflesso lampeggiare dell&#39;animale. Rimuovere i capelli dal cuoio capelluto del animale con un rasoio, cesoie, forbici, o metodi chimici. Disinfettare il cuoio capelluto con un 10% di povidone-iodio soluzione e il 70% di etanolo. Tutti gli strumenti chirurgici devono essere sterilizzati in autoclave, sterilizzati con una perlina di vetro sterilizzatore, o disinfettata con etanolo al 70%. </li><li> Effettuare una incisione mediana del cuoio capelluto con le forbici piccole, a partire 4-5 mm caudale al cranio e avanzando in avanti verso la parte anteriore degli occhi. E &#39;importante che questa incisione essere abbastanza lungo che la pelle non interferirà con l&#39;incollaggio della piastra di testa che viene utilizzato per stabilizzare la testa mouse durante due fotoni di imaging (Figura 1). Identificare l&#39;area da diluire in un ambito di dissezione. Evitare le zone di interesse direttamente trova oltre suture craniche, come il cranio è meno stabile in questi settori e grandi vasi sottostanti e meningi interferirà con l&#39;imaging. </li><li> Applicare il 100% di etanolo al 10% seguita da una soluzione di cloruro ferrico con un tampone di cotone sterile per asciugare le membrane sulla parte superiore del cranio e raschiare via con pinzette multa o una lama di rasoio. La mancata rimozione dei risultati membrane in allegato instabile piastra di testa. </li><li> Mettere uno strato sottile di Permabond 910 colla intorno ai bordi della finestra di visualizzazione sotto la piastra di testa. Posizionare la piastra di testa ricoperti di colla su tutta l&#39;area di interesse sul cranio dell&#39;animale con una leggera pressione (Figura 1). E &#39;importante che la piastra di testa è solo incollata alle ossa del cranio. Ogni pelle o delle membrane che sono in bilico tra la piastra di testa e il cranio si riduce la stabilità del vincolo. Applicare una piccola quantità di acrilato all&#39;interno della finestra di visualizzazione utilizzando una siringa immediatamente legame colla. Infine, applicare una piccola quantità di Loctite 454 ai bordi della finestra di visualizzazione per evitare perdite. </li><li> Avvitare la piastra di testa al titolare animale (Figura 1) e verificare la stabilità della piastra testa sotto un campo di applicazione dissezione con una leggera sondando con un paio di pinze. Ci dovrebbe essere alcun movimento del cranio rispetto alla piastra di testa. Mettere una goccia di soluzione salina sulla finestra di visualizzazione per garantire non vi siano perdite. </li></ol> 2. Preparare la finestra Cranio Assottigliato corticale <ol><li> In preparazione per diluire il teschio, il cranio a secco utilizzando una combinazione di tamponi di cotone sterile e aria compressa. Inizialmente abbiamo sottile il cranio con una punta sterile IRF 007 in un trapano Microtorque II insieme a 4000 giri. Molto delicatamente, iniziare diradamento uno spazio 2-2,5 mm di diametro circolare del cranio. Usare i movimenti radicali solo la luce quasi parallelo al cranio, non utilizzare una pressione diretta verso il basso. Smettere di foratura ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere delle ossa che utilizzano l&#39;aria compressa. Queste interruzioni nella perforazione del cranio permettono di raffreddare quindi non c&#39;è il calore indotto danni al tessuto cerebrale sottostante. <ol class="lalpha"><li> Come la perforazione progredisce, si noti la transizione verso lo strato umido osso spugnoso (cioè la &quot;diploe&quot;). Una volta che questo strato si raggiunge, prestare particolare attenzione in più con il trapano. </li></ol></li><li> Di tanto in tanto controllare la magrezza del cranio mettendo salina sopra la zona assottigliata e la visualizzazione nel campo d&#39;applicazione dissezione. Saline consentirà inoltre la dissipazione del calore. Mentre il cranio è assottigliato, più piccolo vascolarizzazione diventa visibile. </li><li> Utilizzare un MicroBlade sterile dentale per raggiungere la finale assottigliamento in soluzione salina, in quanto il MicroBlade fornisce un feedback tattile molto di più circa la stabilità del cranio. Questo permette di preparazioni molto più sottile con il trapano da solo. Dalla nostra esperienza, lo spessore cranio ottimale è 10-30 micron. <ol class="lalpha"><li> E &#39;importante verificare la sottigliezza del cranio in epifluorescenza più volte durante i primi tentativi di fare un po&#39; alla finestra sottile cranio. La nitidezza e la profondità del visibile microglia e vascolarizzazione dare una buona indicazione su quando la finestra è pronta per l&#39;imaging. </li></ol></li><li> Una volta che la finestra è pronta, colla una custom-made pezzo rettangolare di # 0 coprioggetti wi<html> ° una dimensione inferiore a 2 mm su ogni lato oltre la finestra. Utilizzando un diametro di 1,0 millimetri pipetta di vetro, posto una piccola goccia di colla cianoacrilato sulla zona cranio assottigliato e con attenzione più in basso il piccolo pezzo di coprioggetti, quindi premere leggermente contro il cranio di spremere quantità in eccesso di colla. E &#39;importante evitare la formazione di bolle tra il vetro e la colla poiché l&#39;aria intrappolata causerà l&#39;area sottostante per diventare otticamente opaco. La colla cianoacrilato è utilizzato perché rimane trasparente quando asciutto e impedisce anche la ricrescita dell&#39;osso e membrana mantenendo il teschio sotto la finestra sottile e traslucida. Se c&#39;è qualche colla sulla parte superiore del vetro di copertura, utilizzare il MicroBlade per rimuoverla con cautela una volta che il vetro di copertura è a posto e la colla è asciutta. </li><li> Un analgesico (ad esempio, Buprenorfina 2 mg / kg sottocute) è somministrata immediatamente dopo l&#39;intervento e ri-somministrato in qualsiasi segni di dolore, tra cui riluttanza a muoversi, mangiare o bere, perdita di peso, salivazione, piloerezione, suoni respiratori, ecc </li></ol> 3. A due fotoni Imaging <ol><li> In preparazione a due fotoni di imaging, coprire il TSCW con soluzione salina e individuare l&#39;area di interesse in epifluorescenza (Figura 2). Per consentire l&#39;imaging successive della zona, scattare una foto utilizzando una macchina fotografica. </li><li> Per i due fotoni di imaging, si usa una misura microscopio a due fotoni 6 con un laser Ti: zaffiro sintonizzati nm 920. Fluorescenza viene rilevata da un tubo fotomoltiplicatore per intero campo modalità di rilevazione e un 580/180 filtro per le emissioni. A 20X acqua-immersion lente (0,95 NA) è usato per tutta la sessione di imaging. La potenza massima della potenza laser, l&#39;obiettivo è impostata tra 50 e 65 mW. </li><li> Selezionare una zona di interesse in strati corticali I o II (fino a 150 micron sotto la superficie piale). Per facilitare il re-imaging, scattare foto dello stesso campo visivo a 1X, 2X, 3X e zoom digitale. I vasi sanguigni possono servire come punti di riferimento per trovare facilmente lo stesso campo di vista durante le sessioni di imaging successive. Sotto di uno zoom 3X, più z-stack con 80-90 Z-passi in ogni pila e un passo 0,69 micron possono essere acquisiti ogni 5 minuti per un massimo di 30 minuti, che consente un buon campionamento di microgliali morfologia e comportamento nel tempo ( Figura 3). Tra le acquisizioni di z-stack, si dovrebbe verificare il livello di soluzione salina negli TSCW, così come la profondità degli animali di anestesia. </li></ol> 4. L&#39;iniezione del virus HIV-1 Neurotossina, Tat <ol><li> In primo luogo, silanize il rivestimento interno di un ago calibro 35 e siringa da 10 microlitri microvolumi per evitare deposizione Tat. Prelevare la soluzione silanizzazione (Sigmacote) fino a riempire sia l&#39;ago e siringa. Lasciare che la soluzione di sedersi per 5 minuti a temperatura ambiente. Svuotare la soluzione dalla siringa, togliere il pistone, e consentire la siringa e l&#39;ago si asciughi completamente. Infine, lavare la siringa e l&#39;ago accuratamente con acqua deionizzata. </li><li> Eseguire una piccola craniotomia 0,5 millimetri di diametro o 3 millimetri rostrale o laterale alla TSCW in cui due fotoni immagini sono state ottenute, con una punta più piccola e con attenzione assottigliamento del cranio fino a un paio di pinze con punte taglienti in grado di rimuovere lo strato diluito di osso via facilmente. Noi usiamo una siringa da 10 microlitri microvolumi dotato di 35 gauge controllato da una pompa siringa Ultramicropump III montato su un 3-asse micromanipolatore e dopo allineando la punta dell&#39;ago alla craniotomia, è attentamente avanzato ad una profondità di 700-900 micron al di sotto la superficie piale cui 3 ml Tat 1-72 (o altri agenti pro-infiammatorie) o di soluzione fisiologica (o veicolo di controllo) viene consegnato a 80 Nl / min. </li></ol> 5. Animal Housing <ol><li> Se l&#39;animale deve essere ripreso più volte in un solo giorno, coprire l&#39;area aperta del cranio con un misto di pomata oftalmica e vaselina per evitare disagi o danni al cranio tra le sessioni di imaging. Scollegare il ponte di sostegno dal piccolo testa-plate (vedi Figura 1B) e posto l&#39;animale in una gabbia con cibo riscaldato facilmente accessibile e acqua. Tutti gli animali devono essere alloggiati singolarmente dopo l&#39;intervento in ogni momento. Una volta che le sessioni di imaging per un animale sono complete per un dato giorno, rimuovere con attenzione l&#39;intera testa piastra e suturare la pelle indietro al cranio con # 6 o più piccole suture. Ancora una volta, la casa gli animali singolarmente con il cibo facilmente accessibili e acqua tra i giorni di sperimentazione. Controllare ogni giorno gli animali per rilevare eventuali segni di stress, dolore o infezione. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Stabilizzazione di animali per la chirurgia e due fotoni di imaging (A) e la piastra di progettazione testa (B). <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. GFP-etichettata microglia visualizzate con epifluorescenza. jove_content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. GFP-etichettata microglia visualizzati con due fotoni immagini dopo l&#39;impianto del TSCW, circa 50 micron sotto la superficie piale. Il singolo a due fotoni sezioni presa 15-30 minuti dopo l&#39;impianto del TSCW (giorno 0), così come 7 e 17 giorni più tardi, dimostrare che le finestre rimane chiaro microglia mentre restano inattivati ​​in assenza di insulti infiammatori. Lo z-proiezioni preso 6 e 24 ore dopo l&#39;iniezione del virus HIV tat mostra neurotossina impressionanti cambiamenti morfologici di microglia attivata. Scala grafica: 10 micron.

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Vi è un consenso crescente che il substrato reale per l&#39;HIV-1 deficit neurocognitivi associati (mano) è la distruzione di architettura sinaptica, presumibilmente causata da mediatori pro-infiammatori rilasciati da HIV-1 infetti fagociti mononucleari. Attivazione della microglia, cellule giganti multinucleate e gliosi a causa di ipertrofia degli astrociti sono considerate caratteristiche non specifiche di HIV-1 e l&#39;infiammazione del sistema nervoso centrale 7. Al contrario, la gravità della malattia neurologica premortem è stata correlata con la perdita di complessità sinaptica, così come fardello dei macrofagi nel SNC 8,9,10,11. Tuttavia, le interazioni dinamiche tra microglia, macrofagi periferici infiltrazione, e neuroni nei pazienti con MANO semplicemente non possono essere modellati con i convenzionali di lavorazione statici ottenuti da studi convenzionali immunocitochimica. Recenti studi nei nostri laboratori hanno suggerito che almeno alcune di queste interazioni tra le cellule mononucleate periferiche e centrali e neuroni possono essere modellati in parte mediante iniezione stereotassica di HIV-1 proteina Tat 1-72 nel parenchima cerebrale (Lu, Marker, Tremblay, Qi, e Gelbard, dati non pubblicati). Abbiamo quindi deciso di applicare l&#39;imaging in vivo due fotoni per esaminare l&#39;interazione tra monociti-macrofagi derivati, residente microglia e neuroni del cervello, in un modello animale docile piccolo per neuroAIDS. Mentre aperto cranio o diluito-cranio preparati permettersi un singolo esame di architettura corticale per un breve periodo di tempo (in ore), i ricercatori interessati nel corso di tempo degli eventi subacuta non può usare queste preparazioni senza artifactually attivare microglia / macrofagi a causa della manipolazione chirurgica del la finestra cranica. Qui mostriamo un modo semplice per aggirare queste limitazioni incollando un piccolo pezzo di vetro coprioggetto sopra la zona cranio assottigliato prevenire la calotta cranica di rigenerarsi nel TSCW così come mantenere la trasparenza per ≥ 3 settimane. Abbiamo inoltre dimostrato che questa tecnica ci permette di monitorare il comportamento dei monociti periferici entrare microcircolo cerebrale e cervello residenti microglia in risposta a iniezione stereotassica di HIV Tat 1-72 nella corteccia di topi eterozigoti per CX 3 CR 1 / GFP ( per identificare le cellule mononucleate del lignaggio). Questa tecnica può essere facilmente adattato per l&#39;uso su topi con diverso background genetico, ad esempio, si usano abitualmente eterozigoti CX 3 CR 1 / GFP X Thy-1 YFP 12 topi per indagare le interazioni tra le derivate da monociti macrofagi, microglia residente cervello e neuroni modelli in vivo di neuroinfiammazione rilevanti per MANO. La nostra preparazione TSCW consente agli investigatori di studiare interazioni cellula-cellula tra la periferia e sistema nervoso centrale che possono verificarsi in periodi di settimane, in cui l&#39;animale può essere più volte ripreso, prima e dopo il trattamento sperimentale. Così, ogni animale può servire come proprio controllo. Un avvertimento per questo modello TSCW è che le cellule bersaglio sotto inchiesta devono essere geneticamente per esprimere una maggiore proteine ​​fluorescenti (eXFP) o essere marcati con un colorante fluorescente senza violazione meccanica della calotta cranica, e che l&#39;espressione eXFP devono essere sufficientemente robuste per permettono architettura cellulare da visualizzare dopo le sessioni di imaging ripetuti per un periodo di settimane.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fentanyl Citrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hospira</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Midazolam hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Baxter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Medetomidine hydrocholoride (Domitor)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Heating pads</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beyond Bodi Heat</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tobramycin and dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Alcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Povidone-iodine 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Betadine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ferric chloride 10% solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ricca Chemical Company</td>
<td>3120-32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Methyl cyanoacrylate 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Permabond</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate 454</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Loctite</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TEETS denture material crosslinking methyl methacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microtorque II handpiece kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pearson</td>
<td>R14-0002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IRF 007 drill bits</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>19008-07</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Norland bendable microblade full radius</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Salvin Dental</td>
<td>BLAD-NORLAND-69</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanoacrylate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>The Original Superglue</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>#0 glass coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>63750-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Microvolume syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>ILS010LT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>UMP3-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 gauge NanoFil needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>NL35BL-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ball Mill, Carbide bits #1/4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>501860</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sigmacote</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>SL2-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Photomultiplier tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hamamatsu</td>
<td>HC125-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ti:Sapphire laser Mai-Tai</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Spectra-Physics</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

a thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation

Tradizionalmente nel campo delle neuroscienze, l&#39;imaging in vivo due fotoni del murino sistema nervoso centrale o ha comportato l&#39;uso di open-cranio 1,2 o diluito cranio-3 preparati. Mentre la tecnica open-cranio è molto versatile, non è ottimale per lo studio microglia, perché è invasiva e può causare l&#39;attivazione della microglia. Anche se il diradamento-cranio approccio mini-invasivo, le ripetute ri-assottigliamento del cranio necessari per l&#39;imaging cronica aumenta il rischio di danno tissutale e attivazione della microglia e permette per un numero limitato di sessioni di imaging. Qui vi presentiamo una malattia cronica sottile cranio metodo della finestra per il monitoraggio microglia murini in vivo per un periodo prolungato di tempo utilizzando la microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare una stalla, accessibile, assottigliato-cranio finestra corticale (TSCW) con un coprioggetto di vetro traslucido apposto che rimane nel corso di tre settimane di osservazione intermittente. Questa preparazione è molto più TSCW immunologicamente inerte rispetto alla attivazione della microglia di craniotomia aperti o cranio ripetuti assottigliamento e permette un numero arbitrario di sessioni di imaging durante un periodo di settimane. Prepariamo TSCW in CX 3 GFP CR 1 / 4 + mouse per visualizzare microglia con maggiore proteina fluorescente verde a ≤ 150 micron sotto la superficie piale. Mostriamo anche che questa preparazione può essere utilizzato in combinazione con iniezioni cerebrale stereotassica della proteina HIV-1 Tat neurotossici, adiacente al TSCW, che è in grado di indurre microgliosis durevole. Pertanto, questo metodo è molto utile per esaminare i cambiamenti nella morfologia e la motilità della microglia nel corso del tempo nel cervello che vivono in modelli di Disturbo da HIV Associated neurocognitive (mano) e di altre malattie neurodegenerative con una componente neuroinfiammatorie.

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A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Descriviamo un metodo per la visualizzazione ripetutamente microglia murina e monociti circolanti<em&gt; In vivo</em&gt; Più di ore, giorni o settimane utilizzando transcranico microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare un assottigliato-teschio finestra che permette l&#39;osservazione intermittenti di microglia quiescenti che possono essere attivate mediante iniezione stereotassica adiacenti del virus HIV-1 proteina regolatrice Tat.

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo</emImaging> della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione

Traditionally in neuroscience, in vivo two photon imaging of the murine central nervous system has either involved the use of open-skull1,2 or ...

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

23.4K Views.  University of Rochester. Descriviamo un metodo per la visualizzazione ripetutamente microglia murina e monociti circolanti In vivo Più di ore, giorni o settimane utilizzando transcranico microscopia a due fotoni. Dimostriamo come preparare un assottigliato-teschio finestra che permette l'osservazione intermittenti di microglia quiescenti che possono essere attivate mediante iniezione stereotassica adiacenti del virus HIV-1 proteina regolatrice Tat.

Video: A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imaging in vivo del midollo spinale di topo Utilizzo di due fotoni Microscopia

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

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Neuroscienze

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT has been used extensively in ophthalmology, dermatology, and gastroenterology1-3. Using a thinned-skull cortical window (TSCW), we employ spectral-domain OCT (SD-OCT) modality as a tool to image the cortex in vivo. Commonly, an opened-skull has been used for neuro-imaging as it provides more versatility, however, a TSCW approach is less invasive and is an effective mean for long term imaging in neuropathology studies. Here, we present a method of creating a TSCW in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging

We present a method of creating a thinned-skull cortical window (TSCW) in a mouse model for in vivo OCT imaging of the cerebral cortex.

Diluito-cranio Tecnica finestra corticale per<em&gt; In Vivo</em&gt; Tomografia a coerenza ottica Imaging

Optical coherence tomography (OCT) is a biomedical imaging technique  with high spatial-temporal resolution. With its minimally invasive approach OCT  has ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their close-to-surface positioning facilitates microscopic imaging of skin nerve endings in living intact animal. Using multiphoton microscopy, it is possible to obtain fine images overcoming the problem of strong light scattering of the skin tissue. Reporter transgenic mice that express EYFP under the control of Thy-1 promoter in neurons (including periphery sensory neurons) are well suited for the longitudinal studies of individual nerve endings over extended periods of time up to several months or even life-long. Furthermore, using the same femtosecond laser as for the imaging, it is possible to produce highly selective lesions of nerve fibers for the studies of the nerve fiber restructuring. Here, we present a simple and reliable protocol for longitudinal multiphoton in vivo imaging and laser-based microsurgery on mouse skin nerve endings.

In Vivo Two-Photon Microscopy of Single Nerve Endings in Skin

The protocol for dynamic longitudinal imaging and selective laser lesion of nerve endings in reporter transgenic mice is presented.&#160;

In Vivo microscopia a due fotoni di Endings singolo nervo in pelle

Nerve endings in skin are involved in physiological processes such as sensing1 as well as in pathological processes such as neuropathic pain2. Their ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

Two-Photon<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di spine dendritiche nella corteccia mouse Uso un teschio Diluito-Preparazione

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Quantificazione dei cerebrale vascolare Architettura con due fotoni Microscopia in un modello murino di Neuroinflammation HIV-indotta

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Due-fotone Imaging dei neuroni corticali in topi neonatali

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

Un sottile cranio Tecnica Finestra per cronica a due fotoni In vivo della microglia nei modelli murini di neuroinfiammazione