Questo protocollo descrive un metodo che si concentra sull'estrazione in parallelo delle due popolazioni di cellule gliali più abbondanti, astrociti e microglia, da topi postnatali. Il nostro metodo differisce dagli altri protocolli precedentemente descritti per l'isolamento di astrociti e microglia perché ci concentriamo sull'ottenimento e l'isolamento di entrambi i tipi di cellule nella stessa estrazione alle stesse condizioni, ottimizzando così l'uso di animali da esperimento e migliorando lo studio dei ruoli relativi per queste cellule in contesti immunologici. Questo protocollo può essere utile per indagare meglio i ruoli di microglia e astrociti in molti contesti e malattie nel sistema nervoso centrale come Alzheimer, Parkinson e infezioni da parassiti o virus protozoi.
Ottenere e isolare entrambi i tipi di cellule dalla stessa estrazione è auspicabile per valutare il ruolo comparativo di ogni sottoinsieme cellulare contesti immunologici come infezione o infiammazione. Le persone dovrebbero stare attenti soprattutto durante la rimozione del cervello e i lavaggi nervosi dei tessuti, ma credo che con questo protocollo e il video girato, le persone non faranno fatica. Questo protocollo può essere lungo a seconda del numero di animali per estrarre i cortici, quindi preparati a trascorrere circa quattro ore o più.
Il primo giorno, prepara HBSS e HBSS puri più FBS inattivati dal calore al 10%. Preparare dmem F12 integrato e filtrarlo con un filtro da 0,22 micron. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e utilizzare il 70% di etanolo durante la procedura.
Mettere i topi appena nati in una camera sigillata contenente cotone imbevuto di isoflurane per cinque minuti per un'anestesia profonda. Spruzzare il cucciolo di topo con il 70% di etanolo e decapitare l'animale con le forbici. Fai un taglio sagittale con forbici lungo il cranio per aprirlo ed esporre il cervello.
Rimuovere il cervello usando una micro spatola per mantenere l'integrità cerebrale. Posizionare il cervello in una piastra di Petri asciutta di sei centimetri di diametro. Utilizzando una micro spatola, rimuovere il bulbo olfattivo e il cervelletto.
Spostare la corteccia su un'altra piastra di Petri contenente due millilitri di HBSS più 10%FBS. Tagliare il tessuto cerebrale in piccoli pezzi con forbici sterili e utilizzando una micropipetta P1000, trasferire ogni tessuto cerebrale con HBSS più 10%FBS in diversi tubi conici da 15 millilitri. Se necessario, utilizzare HBSS più 10%FBS per riempire il volume finale a due millilitri.
Lavare il tessuto cerebrale tagliato con tre millilitri di HBSS più 10%FBS per ogni tubo. Dopo la decantazione, rimuovere con cura il supernatante. Ripetere il lavaggio con HBSS più 10%FBS tre volte in più.
Quindi lavare con tre millilitri di HBSS puro tre volte. Dopo la decantazione, rimuovere con cura il supernatante. Quindi, aggiungere tre millilitri di tripina e posizionare il tubo in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 30 minuti scuotendo delicatamente i tubi ogni cinque minuti.
Questo digerisce il tessuto raccolto. Evitare bolle. Per inattivare la tripsiderina, lavare il tessuto con tre millilitri di HBSS più 10%FBS e dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con cura il supernatante.
Ripetere questo lavaggio tre volte. Quindi lavare il tessuto con tre millilitri di HBSS puro e ripetere due volte aggiuntive. Dopo la decantazione del tessuto, rimuovere con cura il supernatante.
Aggiungere sette millilitri di HBSS puro e omogeneizzare il tessuto attraverso passaggi successivi in pipette, prima con una pipetta sierologica da 10 millilitri, seguita da una pipetta da cinque millilitri e infine con una micropipetta P1000. Dopo l'omogeneizzazione, centrifugare i tubi a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il supernatante e rimescolare il pellet con quattro millilitri di HBSS più 10%FBS per ogni tubo.
Trasferire le cellule in un pallone T75 pretrattato commercialmente per un'adesione ottimale della coltura cellulare. Posizionare il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius al 5% di anidride carbonica per 30 minuti per l'aderenza. Quindi aggiungere 10 millilitri di DMEM F12 integrato al pallone e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per due notti.
Il terzo giorno, rimuovere sette millilitri di mezzo di coltura dal pallone T75 e aggiungere sette millilitri di DMEM F12 fresco integrato. Riportare il pallone nell'incubatrice. Il quinto giorno, per rimuovere detriti e cellule non arent, scambiare tutto il mezzo dal pallone T75 con 14 millilitri di DMEM F12 fresco integrato.
Quindi, ogni 48 ore, rimuovere sei millilitri del supernatante e aggiungere sette millilitri di DMEM F12 fresco integrato medio fino al giorno 14 di coltura. Il giorno 14, dopo aver rimosso sei millilitri di supernatante e aver aggiunto sette millilitri di mezzo DMEM F12 integrato fresco, chiudere saldamente i contenitori T75 con un involucro di plastica. Posizionarli nello shaker orbitale del pavimento a 200 RPM e 37 gradi Celsius durante la notte per dissociare meccanicamente le microglia dagli astrociti.
Il giorno 15, prendere i matracci dallo shaker e lavarli vigorosamente con il proprio mezzo al fine di ottimizzare la dissociazione cellulare e raccogliere il numero massimo di microglia. Quindi raccogliere il supernatante e trasferirlo in un tubo conico da 50 millilitri. Successivamente, aggiungere quattro millilitri di tripside ad ogni pallone e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius per staccare gli astrociti.
Quindi aggiungere cinque millilitri di DMEM F12 integrato per inattivare la tripina. Lavare i contenitori con il proprio mezzo e trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare tutti i tubi contenenti microglia dissociata o astrociti a 450 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il supernatante. Resuspend il pellet di microglia in un millilitro di DMEM F12 integrato e gli astrociti in 10 millilitri di DMEM F12 integrato. Procedere al conteggio delle celle in una camera Neubauer o in un contatore automatico di celle.
Placcare le celle con DMEM F12 integrato alla densità desiderata in una piastra di coltura cellulare piatta pretrattata. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 24 ore per consentire loro di attaccarsi. Il 14 ° giorno, la coltura cellulare gliale è stata sottoposta a dissociazione meccanica.
È stato osservato con una purezza dell'89,5% per la popolazione di astrociti e del 96,6% per la popolazione di microglia. Astrociti e microglia di topi C57BL6 sono stati infettati da T.cruzi Y.Dopo due ore, 48 ore e 96 ore, le camere sono state fissate con metanolo e macchiate con marcatore di nucleasi cellulare DAPI e anti-GFAP. L'uso di parassiti geneticamente modificati che esprimono reporter fluorescenti o parassiti etichettati con specifici anticorpi fluorescenti ha migliorato la microscopia ad immunofluorescenza poiché si distinguono meglio dal nucleo cellulare.
Qui vengono presentati due esempi. Ceppo T.gondii RH che esprime in modo costitutivo ceppo YFP e T.cruzi Y macchiato con anticorpo monoclonale non commerciale 2C2 anti-SSP4 proteina. È importante lavare attentamente le cellule per non perdere aggregati cellulari.
Dopo l'infezione da cellule gliali, possono essere valutati altri parametri come ELISA per la produzione di citochine presente nel supernatante, western blotting per l'espressione proteica e PCR quantitativo in tempo reale per la valutazione della trascrizione dell'RNA. Molte domande relative alla funzione delle cellule gliali, ad esempio il loro metabolismo, la risposta immunitaria e la stessa biologia cellulare possono essere affrontate e avvantaggiate da questa tecnica. Tutti i parassiti dei protozoi sono in grado di infettare le cellule umane e di coltura delle cellule del topo, quindi è importante fare attenzione quando si maneggia questo parassita.
