Questo lavoro è stato sostenuto dal Canadian Institute of Health Research (CIHR) concede 191.597, 299.432 e 324.265, a scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada Discovery concessione e un finanziamento Human Frontier Science Program al CRL. CRL è un CIHR Nuova Investigator. Guillaume Diss è sostenuto da una borsa di studio PROTEO. Samuel Rochette è supportato da NSERC e FRQNT borse.

1. Costruzione / verifica di Bait Ceppi <ol><li> Se il ceppo esca di interesse è disponibile in [1,2] collezione Mata DHFR F, recuperarlo dalla collezione come descritto al punto 1.1.1, altrimenti costruire il ceppo come descritto al punto 1.1.2. NOTA: Il protocollo descritto qui utilizza un DHFR F [1,2] ceppo come esca e la DHFR F [3] raccolta come prede, come questa raccolta contiene più ceppi rispetto alla DHFR F [1,2] collezione. Tuttavia, è possibile eseguire la schermata viceversa se il ceppo esca è disponibile solo nella DHFR F [3] raccolta o in entrambi gli orientamenti, se si richiede una maggiore copertura dell&#39;interattoma. <ol><li> Scongelare la targa di glicerolo che contiene il ceppo esca sul ghiaccio per un&#39;ora. Sterilizzare il foglio di alluminio che copre la piastra con etanolo al 95%. Pierce il foglio con una punta sterile, pipettare su e giù per sospendere nuovamente le cellule e striscia 2-3 ml di glicerolo magazzino dal estratto di lievito selettivo peptonedestrosio (YPD) + 100 ug / ml Nourseothricin (Nat) per isolare singole colonie. Incubare per due giorni a 30 ° C. </li><li> Costruzione di un ceppo esca PCA (Mata DHFR F [1,2]). <ol><li> Utilizzando ad alta fedeltà polimerasi e un protocollo standard di PCR, amplificare il DHFR F [1,2] cassetta dal plasmide pAG25-linker-DHFR F [1,2] -ADHterm utilizzando oligonucleotidi con sovrastante finisce omologa per gli ultimi 40 bp della ORF del 3&#39;-end escluso il codone di stop (primer forward) ed al primo 40 bp del gene 3&#39;-UTR (primer reverse) (Figura 1A). </li><li> Trasformare il prodotto di PCR in cellule di lievito competenti (di solito in un ceppo BY4741) utilizzando il protocollo di trasformazione di lievito LiOAc / PEG standard a 29 (Figura 1A). </li><li> Piatto su YPD selettiva + Nat medio isolare trasformanti positivi. </li><li> Eseguire un PCR colonia di diagnostica colonie isolate per confermare il corretto DHFR F [1,2] la fusione. Utilizzare prIMers ricottura 1) nella sequenza genica codificante (oligo Forward) circa 100 bp a monte della fusione DHFR e 2) nel terminatore ADH della cassetta (oligo inversa) (Figura 1B). </li><li> Sequenza il prodotto di PCR da Sanger sequenziamento per confermare il corretto fusion gene. </li><li> Archiviare il ceppo esca confermata nel 25% glicerolo a -80 ° C. NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa in questa fase. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Pin-strumento di sterilizzazione e di stampa Procedure NOTA: La procedura di sterilizzazione descritta di seguito è stato ottimizzato per le pin-tools manipolate dal BM3-BC (S &amp; P Robotics) piattaforma robotica, ma può essere adattato ad altre piattaforme. Questa sezione descrive le procedure di sterilizzazione e stampa Pin utensili che vengono utilizzati per trasferire le cellule da un mezzo ad un altro per il resto del protocollo. In-house script usati per eseguire queste procedure possono essere richiesti. Nota that tutte le misure possono essere eseguite senza la necessità di una piattaforma robotica con un pin-utensile manuale 30. <ol><li> Montare il perno-strumento appropriato sulla piattaforma robotica. </li><li> Preparare pulizia e stazioni bagnate come segue: <ol><li> Aggiungere 500 ml di acqua sterile nella stazione bagnomaria. </li><li> Aggiungere 320 ml di acqua sterile nella stazione pennello. </li><li> Aggiungere 380 ml di etanolo al 70% nel sonicatore durante la replica dalla piastra di agar (86 x 128 millimetri omnitray, contenente 35 ml di terreno solidificato) alla piastra di agar, o 400 ml quando la replica da micropiastra contenente colture liquide ad una piastra di agar. </li><li> Aggiungere 35 ml di acqua sterile nella stazione bagnato (costituito da una omnitray vuoto sterile). </li></ol></li><li> All&#39;inizio di ogni giornata che richiede la piattaforma robotica, sterilizzare gli strumenti pin-cinque volte per un minuto nel bagno sonicatore. Nel frattempo, accendere la lampada UV per cinque minuti per sterilizzare il recinto robot. NOTA: Questo non è necessaria se il robot è alloggiato sotto una cappa sterile. </li><li> Tra ogni turno di replica pin-strumento, sterilizzare il pin-strumento come segue: <ol><li> Mettere a bagno la pin-strumento cinque volte per 10 secondi nella stazione bagnomaria per rimuovere grumi di cellule. </li><li> Mettere a bagno la pin-strumento due volte avanti e indietro nella stazione di pennello. NOTA: La spazzola rotante rimuove le cellule residue. </li><li> Mettere a bagno la pin-strumento due volte per 20 secondi nella stazione sonicatore. NOTA: Rimanendo cellule sui pin verrà rimosso mediante ultrasuoni o ucciso da etanolo. </li><li> Assicurarsi che la profondità di immersione dei perni aumenta ad ogni bagno successivo per garantire una corretta sterilizzazione. </li></ol></li><li> Asciugare la pin-strumento nella stazione di aria essiccatore per 25 sec. </li><li> Prima di cellule sulle piastre source, bagnare i perni nella stazione bagnato, contenente 35 ml di acqua sterile in un omnitray. </li><li> Bagnare i perni due volte nelle colonie dalla piastra sorgente. </li><li> Stampa su un piatto di destinazione appena versato toccando l&#39;agSuperficie ar due volte (di seguito indicato come l&#39;azione di &quot;stampa&quot; di un array). </li></ol> 3. La condensazione della DHFR F [3] Collection in 1.536 matrici Utilizzo di un Robotic Platform automatizzata <ol><li> Scongelare su ghiaccio il DHFR F [3] raccolta (60 piastre a 96 pozzetti) e un ulteriore piastra a 96 pozzetti riempiti con il DHFR L-F [3] ceppo di controllo (Figura 1C), che contiene il DHFR F [3] frammento e il linker monte espresso solo come controllo negativo. NOTA: In linea di principio, questo frammento non deve interagire con qualsiasi proteina di fusione DHFR-frammento (vedi la discussione per i dettagli). </li><li> Piastre centrifuga (giro veloce) prima di rimuovere il foglio di alluminio per evitare i rischi di contaminazione incrociata tra i pozzetti. </li><li> Condensare la collezione su 16 matrici di 384 ceppi (Figura 2a). Per fare questo, per ogni array 384, stampa quattro piatti glicerolo su quattro quadranti di YPD selettiva + 250 mg / ml Hygromycin B (HygB) omnitray utilizzando the 96 pin-utensile (qui, una matrice 384 può essere suddiviso in quattro quadranti ugualmente distanziate, ciascuna composta da 96 posizioni in una disposizione 2 x 2 matrice). Inserire quattro piastre a 96 pozzetti contenenti il ​​[3] controllo negativo L-DHFR F tra le altre piastre 60 in modo da avere una serie finale di 64 placche che riempiono esattamente quattro 1.536 matrici. Sterilizzare il-strumento pin tra ogni ciclo di replica come descritto al punto 2. NOTA: Inserire la L-DHFR F [3] piastre in modo da avere una tale lastra su ciascuno dei quattro finali 1.536 matrici. </li><li> Incubare le piastre per due giorni a 30 ° C. NOTA: In questa fase, la raccolta DHFR può essere memorizzato in un formato 384 a 4 ° C fino ad un mese su piastre di agar. </li><li> Condensare la collezione in quattro array di 1.536 ceppi (Figura 2a). A tale scopo, per ogni array 1.536, stampare quattro matrici di 384 ceppi sui quattro quadranti di una piastra dello stesso mezzo come al punto 3.2 utilizzando il perno-utensile 384 (qui, un array di 1.536 può essere suddiviso in quattro equally distanziate quadranti ognuno composto da 384 posizioni in un layout 2 x 2 matrice). </li><li> Incubare le piastre per due giorni a 30 ° C. NOTA: In questa fase, la raccolta DHFR può essere memorizzato in un formato 1.536 a 4 ° C fino ad un mese su piastre di agar. </li><li> Replicare le quattro matrici sullo stesso mezzo di standardizzare le dimensioni delle colonie con un pin-tool 1.536. </li><li> Incubare le piastre per due giorni a 30 ° C. </li></ol> 4. High-throughput Procedura DHFR-PCA <ol><li> Seminare una coltura del ceppo esca (DHFR F [1,2] fusione) ottenuto nella fase 1.1.1 o 1.1.2 in 20 ml di liquido YPD + Nat in un tubo da 50 ml (Figura 2B). </li><li> Incubare per due giorni a 30 ° C con agitazione a 250 rpm per consentire alla cultura di raggiungere la saturazione. </li><li> Dopo due giorni di incubazione, piatto 5 ml di cultura su un YPD + Nat omnitray. Let cellule adsorbono sulla superficie per 5-10 min e rimuovere il liquido in eccesso (Figura 2B). Ripetere tWICE per fare tre repliche. </li><li> Incubare per due giorni a 30 ° C. </li><li> Stampa il ceppo esca dai passi 4.3 e 4.4 da 12 piastre YPD (abbastanza per accoppiamento quattro piatti della DHFR F [3] di raccolta × tre repliche) con una pin-strumento di 1.536 con ogni prato cella non più di quattro volte. </li><li> Stampa la matrice appropriata della DHFR F [3] raccolta sopra le celle esca utilizzando il pin-utensile 1.536 (Figura 2C). </li><li> Lasciate che i ceppi accoppiano incubando per due giorni a 30 ° C. </li><li> Selezionare cellule diploidi stampando colonie omnitrays contenenti YPD + HygB + Nat (Figura 2C). </li><li> Incubare per due giorni a 30 ° C. </li><li> Selezione diploide Ripetere come descritto ai punti 4.8 e 4.9 (Figura 2B). </li><li> Preparare piatti con supporti contenenti MTX (MTX media) un giorno prima dell&#39;uso seguendo questi passaggi 21 (ATTENZIONE:. Fare attenzione quando si lavora con MTX in quanto è un composto tossico Indossare sempre guanti, proteocchiali ction e un camice da laboratorio nel maneggiarlo) (Figura 2C): <ol><li> Preparare i 10x -lys / incontrato / ade aminoacido drop-out in acqua deionizzata. Filtro-sterilizzare il drop-out in una bottiglia sterile utilizzando un filtro siringa sterile 0,2 micron o, se necessario, in grandi quantità, un imbuto di filtrazione superiore 0,2 micron bottiglia (Tabella 1). </li><li> Preparare una / ml soluzione madre MTX 10 mg in dimetilsolfossido (DMSO). Utilizzare immediatamente dopo la preparazione della soluzione e congelare il resto a -20 ° C. Proteggere dalla luce che è fotosensibile. Non congelare MTX dopo scongelamento esso. </li><li> Preparare il supporto come segue (ingredienti e le quantità medie sono uguali a quelli utilizzati in Tarassov et al. 11): <ol><li> Per un litro di media, mescolare in due palloni separati: 1) 6,69 g di base di azoto lievito senza aminoacidi e senza solfato di ammonio e 330 ml di acqua deionizzata; 2) 25 g di agar nobili e 500 ml di acqua deionizzata. </li><li> Boccette autoclave a 121 ° C per 20 min. </li><li> Equilibrare temperatura in un bagno di acqua a 55 ° C per almeno un&#39;ora. </li><li> Mescolare i due palloni insieme e aggiungere 50 ml di sterile il 40% di glucosio, 100 ml di 10x sterile drop-out, e 20 ml di MTX 10 mg / ml. </li><li> Versare 35 ml (vedi nota sotto) di medie omnitrays. Lasciare solidificare per almeno un&#39;ora e mezza. Piastre Shield dalla luce. NOTA: Qui, versando 35 ml di media per omnitray è fondamentale per garantire la parità di spessore della piastra, che è importante per tutte le fasi a valle. </li></ol></li></ol></li><li> Fosfori del secondo turno di selezione diploide con la piattaforma robotica o con una normale fotocamera digitale con l&#39;uniforme illuminazione targa. Utilizzare queste immagini per identificare le posizioni vuote sulle matrici quando si esegue l&#39;analisi a valle. Assicurarsi che i parametri della telecamera sono sempre le stesse e che la luce robot è accesa. </li><li> Stampa cellule diploidi su MTX supporto USIng pin-tool 1.536. </li><li> Incubare per quattro giorni a 30 ° C in sacchetti di plastica per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Preparare un secondo lotto di omnitrays contenenti MTX media come descritto al punto 4.11. </li><li> Dopo quattro giorni di incubazione, le piastre di immagine utilizzando la piattaforma robotica o regolare la macchina fotografica digitale. Assicurarsi che i parametri della telecamera sono sempre le stesse e che la luce robot è accesa. </li><li> Eseguire una seconda tornata di selezione MTX replicando le celle del secondo lotto di MTX media. NOTA: Ciò farà diminuire la crescita di ceppi PCA sfondo e aumentare la risoluzione quantitativa. </li><li> Incubare per quattro giorni a 30 ° C in sacchetti di plastica per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Fosfori come descritto al punto 4.16. </li></ol> Analisi 5. Immagine <ol><li> Analizzare le immagini di array colonia con ImageJ personalizzata 31 script o utilizzando software pubblicati quali Colonizer, Ht analizzatore griglia colonia, profiler cellule, Colony Immaginer, ScreenMill, YeastXtract e gitter (compilato in 32). L&#39;analisi delle immagini deve uscita uno o più fogli contenenti formati colonie per ciascuna posizione di ciascuna matrice, utilizzare questi formati colonie per tutte le analisi a valle. NOTA: In questo studio, abbiamo utilizzato uno script ImageJ personalizzato descritto in Leducq et al 33 (vedi la sezione di discussione per maggiori dettagli).. </li></ol> Analisi 6. I dati NOTA: I risultati di analisi di immagine possono essere elaborati in una tabulazione come Excel o usando un linguaggio di scripting come R 34. Di seguito viene descritto il procedimento con una personalizzata ImageJ 31 sceneggiatura. <ol><li> Utilizzando uno script personalizzato, concatenare i file di output di analisi di immagine e annotare ogni riga con la piastra e filtrare le informazioni, come nella Tabella supplementare 1. </li><li> Log 2 trasformare i valori delle dimensioni delle colonie (densità integrata o zona colonia, qui, colonna &quot;IntDenBackSub &amp; #8221; dalla tabella integrativa 1 è stato utilizzato). NOTA: Distribuzione Valore sarà come in Figura 3A. </li><li> Normalizzare i valori sottraendo il valore medio di ogni piatto. NOTA: Questo controllo passo per piastra di polarizzazione, che possono derivare da quantità supporti diseguale o variazione di acquisizione automatica delle immagini, e riduce la varianza inter-replicare (Figura 3B). </li><li> Verificare che correlano replicati tra loro (Figura 3C) per valutare la riproducibilità degli esperimenti. </li><li> Per differenziare interagendo da coppie non interagenti esca-preda, impostare una soglia alta fiducia corrispondenti ai 95 ° percentile della distribuzione del L-DHFR F [3] controlli. NOTA: In questo esperimento, ciò corrisponde a 3,39 (Figura 3D). In alternativa, può essere utilizzata una soglia basato sulla sovrapposizione con noti interattori fisici quali quelli riportati nella BIOGRID 35.Vedere la discussione per ulteriori dettagli. </li><li> Per qualsiasi esca, filtro prede identificato come coinvolti nelle interazioni falsi positivi in schermi DHFR-PCA (vedi la discussione per ulteriori dettagli) e riportate nella tabella integrativa 2 (identificato come &quot;1&quot; nella colonna &quot;filtrato&quot;). </li><li> La media dei log2 dimensioni colonia normalizzato delle tre repliche di ogni interazione (colonna &quot;Ripartizione&quot; in tabella integrativa 2). </li></ol> 7. Convalida dei Interactiani fisici utilizzando Esperimenti in piccola scala NOTA: Qualsiasi PPI di particolare interesse avere un punteggio sopra o vicino alla soglia applicato può essere convalidato usando il saggio DHFR-PCA in un disegno sperimentale scala ridotta utilizzando un saggio di crescita su terreno solido o liquido MTX. I passi seguenti mostrano la procedura per costruire manualmente ceppi PCA diploidi ed eseguire test a campione su MTX media. Lo sperimentatore deve eseguire queste operazioni per tutti necessarControlli y (Bait-DHFR F [1,2] x L-DHFR F [3], Zipper-linker-DHFR ceppi diploidi e linker-DHFR ceppo diploide). <ol><li> Piatto 2-3 ml dello stock glicerolo del ceppo esca generata in 1.1.2.6), la L-DHFR F [3] ceppo di controllo, la Zipper-linker-DHFR e linker-DHFR ceppi diploidi su YPD + Nat, YPD + HygB e due volte YPD + Nat + HygB media, rispettivamente. </li><li> Recuperare la preda di interesse per il DHFR F [3] la raccolta e seguire le istruzioni nel passaggio 1.1.1, ma striscia la tensione sul YPD + HygB medio invece di YPD + Nat media. </li><li> Eseguire PCR diagnostico in 1.1.2.4 per confermare la DHFR F [3] fusa al locus prede e la sequenza del prodotto. </li><li> Seminare 1 ml di terreno YPD liquido con ceppi aploidi di accoppiarsi (Bait x Prey, Bait x L-DHFR F [3] controllo) e crescere almeno due giorni a 30 ° C per permettere ai diploidi di formare. </li><li> Selezionare diploidi strisciando 4-5 microlitri della cultura in 7.4 su terreno solido YPD + HygB + Nat. Crescere due giorni a 30 ° C. </li><li> Select una colonia isolata e crescere durante la notte in coltura liquida (1 ml) per eseguire il test di crescita. </li><li> Preparare piatti MTX e DMSO (stessi ingredienti MTX media, ma senza MTX) un giorno prima dell&#39;uso. Vedere il punto 4.11 per ulteriori dettagli. </li><li> Effettuare test crescita individuando diluizioni seriali delle diverse culture sul controllo (DMSO) e le piastre di selezione (MTX). <ol><li> Diluire precultures a OD = 1. </li><li> Eseguire diluizioni cinque volte (fino a un fattore di diluizione di 625) in una piastra a 96 pozzetti sterili. </li><li> Spot 4 ml di ogni diluizione sul supporto PCA (DMSO e MTX). </li><li> Incubare a 30 ° C in sacchetti di plastica per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Fosfori da 1 a 7 giorni di incubazione che utilizzano la piattaforma robotica o una normale fotocamera digitale. </li></ol></li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+approach+for+the+genetic+dissection+of+protein+complexes+in+living+cells.">A systematic approach for the genetic dissection of protein complexes in living cells.</a> Cell Rep. 3, 2155-2167 (2013).</li><li>Gagnon-Arsenault, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+divergence+plays+a+role+in+the+rewiring+of+protein+interaction+networks+after+gene+duplication.">Transcriptional divergence plays a role in the rewiring of protein interaction networks after gene duplication.</a> Journal of proteomics. 81, 112-125 (2013).</li><li>Schlecht, U., Miranda, M., Suresh, S., Davis, R. W., St Onge, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=qPCA:+a+scalable+assay+to+measure+the+perturbation+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">qPCA: a scalable assay to measure the perturbation of protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Biosyst. 9, 36-43 (2013).</li><li>Pelletier, J. N., Campbell-Valois, F. X., Michnick, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+domain-directed+reassembly+of+active+dihydrofolate+reductase+from+rationally+designed+fragments.">Oligomerization domain-directed reassembly of active dihydrofolate reductase from rationally designed fragments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 12141-12146 (1998).</li><li>Gietz, R. D., Woods, R. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+robustness+of+protein+complexes+to+inter-species+hybridization.">Evidence for the robustness of protein complexes to inter-species hybridization.</a> PLoS Genet. 8, e1003161 (2012).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Development Core Team: A language and environment for statistical computing. , (2008).</li><li>Stark, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioGRID:+a+general+repository+for+interaction+datasets.">BioGRID: a general repository for interaction datasets.</a> Nucleic Acids Res. 34, D535-D539 (2006).</li><li>Vinayagam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex-based+analysis+framework+for+high-throughput+data+sets.">Protein complex-based analysis framework for high-throughput data sets.</a> Science signaling. 6, rs5 (2013).</li><li>Jansen, R., Gerstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+function+on+a+genomic+scale:+the+importance+of+gold-standard+positives+and+negatives+for+network+prediction.">Analyzing protein function on a genomic scale: the importance of gold-standard positives and negatives for network prediction.</a> Current opinion in microbiology. 7, 535-545 (2004).</li><li>Ito, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+two-hybrid+analysis+to+explore+the+yeast+protein+interactome.">A comprehensive two-hybrid analysis to explore the yeast protein interactome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 4569-4574 (2001).</li><li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetic+landscape+of+a+cell.">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li></ol>

Parte delle tasse di pubblicazione ad accesso aperto per questo articolo sono stati pagati da S &amp; P Robotics.

Descriviamo un protocollo basato sul dosaggio DHFR-PCA che consentano l&#39;identificazione sistematica delle interattori fisici per ogni proteina esca a high-throughput. Questo protocollo può essere adattato dallo screening altre esche, e questo a qualsiasi livello desiderato di replica. Dimostriamo l&#39;affidabilità di questo protocollo per l&#39;identificazione di partner di interazione fisica per una proteina esca coinvolta nel complesso nucleare Pore: Nup82. La nostra analisi ha permesso di trovare cinque interattori precedentemente segnalati e uno precedentemente non dichiarata Interactiano (Figure 3F e 3G), mettendo in evidenza la capacità del metodo per studiare il interattoma proteine ​​del lievito. Il protocollo qui descritto comprende diversi passaggi critici in cui lo sperimentatore deve prestare attenzione. Consigliamo a 1) Assicurarsi che il DHFR esca F [1,2] la fusione sia corretta (Figura 1B); ciò può essere ottenuto mediante sequenziamento costruzione e measuring espressione della proteina corretta usando un anti-DHFR F [1,2] o DHFR anti-F [3] anticorpo; 2) Prima di iniziare lo schermo, si consiglia di verificare se qualcuno esca di interesse presenta interazioni promiscue in schermi PCA. Questo può essere fatto eseguendo schermate di controllo con esche incrociate con il controllo L-DHFR appropriato o accoppiando manualmente l&#39;esca con il controllo L-DHFR appropriata ed eseguendo un test crescita MTX medie. 3) Le piastre devono essere versato il giorno prima di essere utilizzate in modo che l&#39;umidità è ottimale per l&#39;adesione delle cellule sulla superficie agar durante il processo di stampa; 4) piastre di origine non dovrebbero essere usati più di quattro volte a trasferire abbastanza cellule sulla piastra di destinazione. Aumentando il numero di copie della piastra di destinazione può essere fatto da fasi successive di espansione (ad esempio 4 copie -&gt; 16 copie -&gt; 64 copie). In alternativa, le cellule possono essere ritirati in posizioni diverse sui prati o nella colonia tra i diversi cicli di replica; 5) Se più positions mancano dopo la selezione diploide (s), assicurarsi che le piastre di origine non sono stati utilizzati troppe volte nella fase di accoppiamento (passi 4,5-4,7); 6) Verificare che il medium MTX contiene tutti gli ingredienti essenziali alle concentrazioni di destra. Infatti, se nessuna crescita a tutti si osserva sul supporto MTX, può essere sia perché nessuna interazione è rilevabile con PCA per le proteine ​​di interesse o perché il mezzo MTX non era preparato correttamente. Per garantire che il mezzo permette la crescita di ceppi che mostrano DHFR frammenti complementazione, un&#39;interazione costitutiva può essere aggiunto in posizioni vuote della raccolta e usata come controllo positivo come DHFR-frammenti fusi a leucina frazioni cerniera 33 (Figura 1C). Test parallelo utilizzando i frammenti linker-DHFR o frammenti cerniera-linker-DHFR permetterà di discriminare tra le condizioni che consentono tutte le cellule di crescere (bassa concentrazione di MTX o proteine ​​esca che tendono a rendere le interazioni falsi positivi, come described sotto) e le condizioni che impediscono la crescita di tutti i ceppi (Concentrazione MTX troppo alto o essenziale mancante nel mezzo); 7) Dato che PCA viene eseguita attraverso cicli successivi di repliche da un mezzo ad un altro, la contaminazione crociata tra ceppi tra piatti diversi si può verificare se, per esempio, la pin-utensile non è sterilizzato correttamente tra un round di replica e / o l&#39;ultima acqua Bagno (station cioè umido) nella procedura di sterilizzazione è contaminato da colonie di precedenti round di replica. Diverse posizioni gli array sono vuoti e possono quindi essere utilizzati come posizioni di comando in cui deve essere osservato nessuna crescita per rilevare contaminazioni crociate. L&#39;analisi delle immagini può essere eseguita utilizzando diversi software pubblicati (vedi sezione 5 del protocollo) o qualsiasi script personalizzato. In questo studio, lo script personalizzato esegue i seguenti passi: 1) Lo script sottrae i valori dei pixel di un piatto vuoto a Pixel valori di ogni piatto in modo da corRect per illuminazione pregiudizi. 2) Lo script converte ogni immagine di sfondo con correzione per binario utilizzando una soglia di valore di pixel pari a 10. 3) Per ogni 1.536 posizioni di ogni piatto, determinati sovrapponendo un rettangolo sulle colonie bordo, lo script viene eseguito ImageJ &quot;Analizza particelle ... Funzione &quot;in una selezione circolare. La selezione circolare è impostata con un raggio pari all&#39;intervallo tra due posizioni meno 10 pixel. 4) Lo script seleziona la particella più vicina dal centro della selezione e conferma come colonia se la sua posizione non è più di metà dell&#39;intervallo tra due colonie di distanza dal centro della selezione. 5) Lo script misura valori dei pixel della particella selezionata sull&#39;immagine sfondo corretta. 6) Per correggere ulteriormente i restanti pregiudizi retroilluminazione, lo script sottrae il valore medio di tutti i pixel dalla selezione circolare che non erano parte di una particella di valori dei pixel della colonia. La somma di questi valori di pixel correttos, memorizzati nella colonna &quot;IntDenBackSub&quot; della tabella complementare 1, sono usati come misura di dimensioni delle colonie. Un punto critico all&#39;interno della parte analisi è la scelta della soglia di significatività. Qui, abbiamo scelto una soglia basato sulla distribuzione del negativo L-DHFR F [3] controlli, ma a seconda dell&#39;obiettivo dello schermo, tale soglia può essere troppo severe. Infatti, L-DHFR F [3] controlli vengono sovraespressi (promotore forte TEF) tale che i frammenti complementari possono spontaneamente complementari e questi non sono quindi rappresentativi della maggior parte delle proteine ​​di espressione. Ciò è evidenziato dal fatto che la distribuzione della L-DHFR F [3] controlli è superiore alla media della crescita sfondo (Figura 3D). Così, alcune interazioni che hanno punteggi inferiori a questa soglia rigorosa ma che sono chiaramente al di fuori della distribuzione crescita di fondo può essere considerato come colpi presunti che possono rappresentare, per esempio, tra transitoria o deboleazioni. Questi possono essere ulteriormente studiate e cross-validati se, per esempio, le due proteine ​​non sono espressi a livelli che possono consentire la complementazione spontanea dei frammenti DHFR come controlli L-DHFR. In alternativa, si può impostare una soglia di significatività in base alla percentuale di sovrapposizione con Interactiani fisici riportati in database come BIOGRID 35 al fine di massimizzare la percentuale di veri positivi su falsi positivi. Tuttavia, a differenza l&#39;uso della distribuzione L-DHFR, questa alternativa può non essere sempre fattibile se, per esempio, il numero di noti interattori fisici non è sufficientemente elevato. Inoltre, la scelta della soglia di significatività ha un impatto sulla percentuale di falsi positivi e falsi negativi nel set di dati finale. Infatti, come qualsiasi altro test PPI rilevamento, falsi positivi possono derivare da interazione aspecifica di una proteina con la proteina di fusione DHFR-se, per esempio, la proteina è altamente abbondante come accennato in precedenza. Questoè esemplificato dal fatto che alcuni prede interagiscono sistematicamente con tutte le proteine ​​esca in schermi PCA e, quindi, devono essere rimossi dall&#39;analisi 11 (es Tef2 e Ade17 e Tabella integrativa 2). Per aggirare questo problema, una schermata di controllo PCA delle due collezioni contro il controllo L-DHFR appropriata (F [1,2] o F [3]) per identificare esche e prede espositrici spontanea DHFR frammenta complementazione può essere eseguita in condizioni specifiche di ogni schermata. Inoltre, l&#39;esecuzione di un&#39;analisi arricchimento Gene Ontology può aumentare la fiducia nei dati se la funzione di un determinato esca è noto. D&#39;altra parte, DHFR-PCA può dar luogo a falsi negativi per diverse ragioni: 1) non tutte le proteine ​​possono essere fuse ai frammenti DHFR quanto potrebbero destabilizzare proteine ​​o modificare la loro localizzazione se, per esempio, la fusione della DHFR C-terminale interferisce con un segnale di localizzazione; 2) la ricostituzione DHFR in alcuni compartimenti cellulari may non producono folato se, per esempio, un elemento indispensabile per la sintesi folato non è disponibile; 3) C-termini necessità di essere all&#39;interno di una distanza di 8 nm per DHFR complementazione si verifichi 11. Pertanto, un&#39;interazione noto potrebbe non essere rilevato se la loro C-terminali non sono abbastanza vicino nello spazio. Questo è esemplificato qui dal fatto che una grande frazione di interazioni fisiche Nup82 riportati in banche dati, la maggior parte dei quali sono indiretto, non sono stati rilevati nel nostro test. Analogamente, le interazioni tra le proteine ​​di membrana per cui il C-termini sono in trans rispetto alla membrana non comporteranno DHFR frammenta complementazione e non sarà rilevato 11. Limitazioni 1) e 3) può essere aggirato relativamente semplice fondendo il frammento DHFR alla N-terminali della proteina. Ciò potrebbe evitare di interferire con un segnale di localizzazione vicino al C-termini e può consentire di individuare una interazione tra le proteine ​​di membrana la cui N e C-terminale sono in relativa cisalla membrana. Diverse sfide rimangono nello studio di PIN (rivisto in 2,3). Le mappe di PIN prodotte finora sono stati ampiamente descritti in un&#39;unica condizione sperimentale per ogni specie e quindi offrire una singola istantanea di come potrebbero essere organizzate reti di proteine. Vi è quindi una necessità per l&#39;esplorazione di altre condizioni sperimentali per vedere come PIN possono essere riorganizzati in risposta ai cambiamenti ambientali, stimoli specifici, attraverso lo sviluppo o seguenti mutazioni. Queste sfide saranno superate dallo sviluppo di nuove tecnologie per interrogare IPP in tempo reale, in cellule viventi e adattando attuali tecniche in modo che possano essere utilizzati da un grande comunità di laboratori. Come una tecnica quantitativa in grado di rilevare i cambiamenti nella quantità di DHFR complementazione complessi 27, DHFR-PCA può essere adattato per superare queste sfide ed è stato utilizzato per studiare come i PPI sono interessate da un DNA agente 22 danni </sup&gt;, agenti chimici 25, delezioni geniche 23,26 o in altre specie di lievito e loro ibridi 33. Exploring queste nuove dimensioni diventerà sempre più importante per rivelare la dinamica del PIN.

Reti di interazione proteina (PIN) offrono una risoluzione bassa mappa di come le proteine ​​sono funzionalmente organizzati nella cella 1. Ogni connessione fisica tra due proteine, o interazione proteina-proteina (PPI), possono rappresentare un&#39;associazione che è stabile nel tempo, come quelli trovati all&#39;interno complessi proteici e che contribuiscono alla organizzazione strutturale della cellula. Queste connessioni possono anche rappresentare associazioni transitori che regolano l&#39;attività, la stabilità, la localizzazione e le interazioni dei due partner. Identificare i partner di interazione fisica di una certa proteina fornisce quindi ricca informazioni sulla funzione e la regolazione di quella proteina 2,3. Per queste ragioni, grandi sforzi sono stati messi verso la mappatura dei PIN in organismi modello, tra cui Escherichia coli 4-6, Arabidopsis thaliana 7, Saccharomyces cerevisiae 8-12, Drosophila melanogaster &lt;/ Em&gt; 13, Caenorhabditis elegans 14 e Homo sapiens 15. Questi studi hanno fornito importanti informazioni come le proteine ​​sono organizzati in cella e informazioni così chiave sulle proteine ​​con funzioni precedentemente sconosciuti. Diverse strategie sono state sviluppate nel corso degli anni per studiare PIN. Queste tecnologie possono essere sostanzialmente raggruppati in tre categorie a seconda del tipo di informazioni che forniscono sul PPI (rivisto nel 16-18). Il primo si basa su lieviti doppio ibrido e dei suoi derivati ​​19. Queste tecnologie forniscono informazioni sulla diretta associazione tra coppie di proteine, che permette di costruire reti binari. La seconda famiglia è basata sulla purificazione di affinità delle proteine ​​esca e l&#39;identificazione dei loro partner associati, come la purificazione di affinità seguita da spettrometria di massa 20. Questi approcci identificano gruppi di proteine ​​che sono direttamenteo indirettamente associato, generalmente in modo stabile, e sono estremamente potenti per identificare complessi proteici. Il terzo approccio si basa su saggi di complementazione proteica-frammento (APC) 11,21. Questo approccio fornisce un livello intermedio di risoluzione tra i due approcci precedenti, in quanto permette di rilevare associazioni dirette e prossimale tra proteine. Ogni tecnica ha i suoi punti di forza e di debolezza, come recentemente rivisto 18. Il PIN eucariotica meglio descritta è di gran lunga quello del lievito Saccharomyces cerevisiae erba, in parte perché la sua proteoma è relativamente meno complessi di quelli di altri eucarioti modello e per saggi high throughput per rilevare IPP sono stati analizzati prima e sono più efficiente implementato in questo organismo modello 9-12. Un metodo particolarmente potente per il sistema lievito è la diidrofolato reduttasi proteina-frammento complementazione assay (DHFR-PCA), un metodo che è statoutilizzato in contesti diversi per studiare il PIN lievito in condizioni standard e perturbate 11,22-26. Questo metodo si basa su un saggio di sopravvivenza che consente il rilevamento di IPP ​​diretti e quasi diretta per una data proteina esca ad entrambi i livelli di espressione endogeni e localizzazioni subcellulari native dei partner di interazione 11,21 in maniera quantitativa 27. Il segnale ottenuto da questo test (cioè dimensioni delle colonie su array colonia alta densità) riflette quindi la quantità di complessi proteici formati tra l&#39;esca e la preda in un ambiente cellulare quasi equivalente a quella delle cellule wild-type. Il saggio si basa sulla ricostituzione di un enzima coinvolto nel metabolismo giornalista folati, la diidrofolato reduttasi (DHFR), in cui due frammenti complementari della DHFR che sono fusi alle due proteine ​​di interesse vengono portati in prossimità quando le due proteine ​​interagiscono, che a sua volta porta alla ricostituzione reversibili dell&#39;attività enzimatica 11 e la crescita del ceppo su un terreno contenente metotrexato (MTX; Figura 1). Questo composto inibisce l&#39;enzima DHFR endogena, ma non quello mutato utilizzato nel test 28. Due raccolte di ceppi PCA, uno contenente ~ 4.300 Mata ceppi con ORF fusa alla DHFR F [1,2] frammento e una contenente ~ 4.800 MAT α ceppi con un ORF fusa alla DHFR [3] frammento, può essere acquistato a implementare DHFR-PCA a scala piccola o grande in qualsiasi laboratorio. Qui, descriviamo un protocollo generale, ma dettagliato per schermo per PPI tra una proteina esca e ~ 4.800 proteine ​​preda da questo test.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipement</td>
			<td>&#160;Company&#160;</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>&#160;Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioMatrix Robot, Bench-top Configuration</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>BM5-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-96-10</td>
			<td>Standard 96-format Pin-tool with 96 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-384-10</td>
			<td>Standard 384-format Pin-tool with 384 high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1536-format Pin-tool</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>PH-1536-05</td>
			<td>Custom 1536-format Pin-tool with 0.5mm high-precision floating pins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated imaging module&#160;</td>
			<td>S&#38;P Robotics Inc.</td>
			<td>IMG-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methotrexate&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>MTX440&#160;</td>
			<td>CAUTION: toxic compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B&#160;</td>
			<td>Bioshop Canada Inc.</td>
			<td>HYG003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nourseothricin dihydrogen sulfate</td>
			<td>Werner BioAgents</td>
			<td>5010000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast-Interactome Collection&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>YSC5849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tray w/lid sterile&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>242811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[1,2] antibody&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DHFR F[3] antibody&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0942</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide protein-protein interaction screening by protein-fragment complementation assay (pca) in living cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Tabella integrativa 2 è un esempio di risultati rappresentativi ottenuti con la proteina di lievito Nup82 fusa alla DHFR F [1,2] frammento come esca. La soglia definita con la L-DHFR F [3] controlli può essere usato come una soglia empirica per determinare risultati confidenza elevati (figure 3D e 3E). In alternativa, la classifica punteggio può essere utilizzato per eseguire arricchimenti Gene Ontology o altro funzionale analizza 36 sulla base di standard di riferimento 37. Gli interattori fisiche conosciute della esca possono essere recuperati dal database come BIOGRID 35 e sovrapporre i dati (Figure 3E e 3F). In questo esempio, cinque degli otto colpi di alta fiducia sono stati precedentemente segnalato come interattori Nup82 e due fanno parte del subcomplesso Nup82, Nup116 e Nup159 (Figura 3F e 3G). L&#39;altro membro del complesso, NSP1, non mostra alcun Interaczione nel nostro esperimento. Due prede, Ade17 e Tef2 (non mostrato in figura 3F), avevano punteggi al di sopra della soglia dura applicata, ma questi sono probabilmente falsi positivi mentre interagiscono quasi ogni proteina esca in schermi PCA abbiamo eseguito (risultati non pubblicati). D&#39;altra parte, Pex30 può rappresentare un interattore fisica romanzo Nup82 e siamo stati in grado di confermare questa interazione con DHFR-PCA a bassa velocità (Figura 3G). Pex30 è una proteina di membrana perossisomica e poche interazioni dirette sono stati segnalati tra il complesso del poro nucleare (NPC) e questo organello. Uno schermo doppio ibrido identificato altre due proteine ​​NPC, Nup53 e Asm4 (Nup59), come interattori fisiche di Pex30 38, e una interazione genetica tra Pex30 e Nup170 è stato segnalato 39. Due altri partner interazione rilevato, Nup120 e Nup85 (Figura 3F e 3G), non fanno parte del sub-complesso Nup82, illustrando la capacitàdella DHFR-PCA per rilevare le interazioni all&#39;interno e tra Sottocomplessi in complessi più grandi 11. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig1highres.jpg" /> Figura 1:. Ceppi di lievito di ingegneria per high-throughput DHFR-PCA (. Figura adattato da Leducq et al 2012 33) (A) Costruzione di aploidi Mata e MAT α ceppi di fondere Gene1 (G1) e Gene2 (G2) con la DHFR F [1,2] -NatMX e la DHFR F [3] -HPH cassette, rispettivamente. Le cassette sono amplificati da plasmidi pAG25-DHFR F [1,2] e pAG32-DHFR F [3] con primer avanti G1-5 &#39;e G2-5&#39;, e reverse primer G1-3 &#39;e G2-3&#39;, e poi inserito nel genoma all&#39;estremità 3 &#39;del gene bersaglio di ricombinazione omologa. Le proteine ​​risultanti, P1 e P2, rispettivamente, sono fusi al DHFR F [1,2] frammento (Mata) e la DHFR F [3] frammento (MATα) attraverso un linker flessibile. (B) Verifica della costruzione di (A) viene eseguita mediante sequenziamento le giunzioni tra Gene1 e di ORF di Gene2 e le cassette DHFR. I ceppi PCA costruiti su opposti tipi di accoppiamento sono poi accoppiati per formare un diploide. Ceppi diploidi crescono su MTX medio se i due frammenti complementari DHFR vengono portati in prossimità da un&#39;interazione tra P1 e P2, che ricostituisce la attività dell&#39;enzima DHFR. (C) Costruzione del controllo diploidi PCA ceppi per schermi DHFR-PCA. I controlli negativi (L-DHFR) sono costruiti trasformando Mata e MATα ceppi separatamente aploidi con plasmidi P41-linker-DHFR F [1,2] e P41-linker-DHFR F [3] 11, rispettivamente. I due ceppi sono accoppiati con un conseguente controllo negativo ceppo diploide in cui i frammenti DHFR potutoper completarsi a vicenda (in alto). I controlli positivi sono costruiti utilizzando lo stesso approccio per i controlli negativi, ma i plasmidi trasformati in ceppi aploidi (P41-cerniera-linker-DHFR F [1,2] (P41-ZL-DHFR F [1,2]) e p41 -zipper-linker-DHFR F [3] (P41-ZL-DHFR F [3])) contengono due GCN4 leucina parallelo frammenti cerniera fusi ai frammenti complementari DHFR, che porta ad una interazione forte e costitutivo che ricostituisce l&#39;attività DHFR (bottom ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig2highres.jpg" /> Figura 2: High-throughput procedura DHFR-PCA (figura adattato da Leducq et al 33.) (A) Il MAT α DHFR F [3] collezione.<html> è condensato in un formato 1536 attraverso due successivi cicli di condensazione. In primo luogo, le piastre glicerolo azionari sono combinati da gruppi di quattro su terreno selettivo YPD + HygB in un formato 384 tramite il pin-strumento 96. In secondo luogo, 384 matrici vengono combinati da gruppi di quattro su terreno selettivo YPD + HygB in formato 1536 con il pin-tool 384. (B) prati cellulari del ceppo esca MATA PCA sono preparati da crescere una cultura satura del ceppo esca in YPD selettiva + Nat medio e placcatura la cultura su un YPD + Nat omnitray. (C) Questi prati sono utilizzati per accoppiare il ceppo esca con la DHFR F [3] raccolta su YPD media. Le cellule vengono successivamente trasferiti due volte sul YPD + HygB + Nat medio di selezionare per diploidi e due volte su MTX medio per eseguire PCA. La crescita sarà osservata solo MTX medio se i frammenti DHFR si completano a vicenda a seguito di una interazione tra l&#39;esca e le proteine ​​preda.e.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52255/52255fig3highres.jpg" /> Figura 3:.. Analisi dei dati attraverso i passaggi di normalizzazione, la determinazione di una soglia di significatività e l&#39;identificazione delle interazioni positive (A) la distribuzione di densità di dimensioni colonia su ciascuna piastra (log 2) (B) normalizzazione della mediana di ogni immagine corregge per bias associato con effetti piastra-piastra. (C) Heatmap che mostra il coefficiente di correlazione Spearman tra le piastre, confermando la riproducibilità della procedura. (D) Distribuzione dei punteggi per le IPP testati e [3] controlli L-DHFR F. Una soglia rigido può essere impostata sui 95 ° percentile della L-DHFR F [3] distribuzione per identificare PPI alta fiducia (rappresentato da una verticale tratteggiatadistribuzione di linea). (E) per Classifica del punteggio medio di ogni preda. Precedentemente riportati partner interazione fisiche del Nup82p nel BIOGRID 35 sono identificati da cerchi e quelli riportati in questo studio sono identificati da punti rossi. La soglia definita in (D) viene mostrata come una linea tratteggiata. (F) Rete mostrando le IPP ad elevata affidabilità identificati in questo studio. Bordi blu mostrano precedentemente segnalati interattori fisici (BIOGRID 35) e bordi gialli mostrano un&#39;interazione precedentemente non dichiarata con Pex30. (G) Spot-diluizione di prova del PCA ceppi diploidi coinvolge Nup82-DHFR F [1,2] e preda-DHFR F [3 ] paia identificati come interattori fisiche del Nup82p nel presente studio. Test La crescita è stata eseguita in DMSO medio (MTX solvente, pannello di sinistra) e MTX medio (pannello di destra). Controlli negativi costituiti da Nup82-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] e Linker-DHFR F [1,2] - Linker-DHFR F [3] e un controllo positivo costituito da tha una forte interazione tra due porzioni leucina cerniera (zip-DHFR F [1,2] - zip-DHFR F [3]) sono stati inclusi. La crescita delle cellule superiori ai controlli negativi in MTX terreno deve essere interpretata come una interazione fisica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52255/52255fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Aminoacidi </td><td> Quantità (g) </td></tr><tr><td> Adenina solfato * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-triptofano </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> L-tirosina </td><td> 0.3 </td></tr><tr><td> L-fenilalanina </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> L&#39;acido L-glutammico (sale monosodico) </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-Asparagine </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> L-Valina </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> L-treonina </td><td> 2.0 </td&gt; </tr><tr><td> L-Serina </td><td> 3.75 </td></tr><tr><td> Uracile </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-istidina HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Arginina HCl </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-metionina * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Lisina * </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> L-Leucina </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td colspan="2"> * Ritirato durante l&#39;esecuzione di serie PCA (come in questo protocollo), ma possono essere aggiunti per altri scopi. </td></tr></tbody></table> Tabella 1:. Composizione del 10X -lys / incontrato / ade drop-out nel mezzo MTX quantità sono per un litro di 10x drop-out. Gli asterischi indicano i composti che devono essere esclusi per il mezzo MTX standard, ma che possono essere aggiunti per altri scopi. Tabella supplementare 1:. I dati combinati dalle piastre 12 di prova La tabella 1 contiene il da concatenatota dall&#39;analisi ImageJ eseguita utilizzando uno script ImageJ personalizzato con ogni riga corrisponde ad una sola posizione su ogni array 1.536. Inoltre, ogni riga è stato annotato con le informazioni relative al file immagine, piastra raccolta DHFR, replicare, ORF e il nome della proteina. Tabella integrativa 2:. La crescita media normalizzata per ceppo tabella 2 contiene il registro 2 crescita normalizzata media per ogni ceppo della collezione con la deviazione standard. Prede filtrati, successi e noti interattori fisici sono identificati in colonne separate.

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Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

Genome-wide proteina-proteina interazione Screening per Protein-frammento Complementation Assay (PCA) in cellule viventi

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...

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Research

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Biology

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

13.2K Views.  Université Laval. Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA). 

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Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Biomolecolare fluorescenza complementazione (BiFC) Assay per interazione proteina-proteina nelle cellule Cipolla Utilizzando la Helios Gun Gene

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

Ricerca

Biologia

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. elegans, gene function can be knocked down simply and efficiently by feeding worms with bacteria expressing a dsRNA corresponding to a specific gene 1. While the creation of libraries of RNAi clones covering most of the C. elegans genome 2,3 opened the way for true functional genomic studies (see for example 4-7), most established methods are laborious. Moy and colleagues have developed semi-automated protocols that facilitate genome-wide screens 8. The approach relies on microscopic imaging and image analysis. 
	Here we describe an alternative protocol for a high-throughput genome-wide screen, based on robotic handling of bacterial RNAi clones, quantitative analysis using the COPAS Biosort (Union Biometrica (UBI)), and an integrated software: the MBioLIMS (Laboratory Information Management System from Modul-Bio) a technology that provides increased throughput for data management and sample tracking. The method allows screens to be conducted on solid medium plates. This is particularly important for some studies, such as those addressing host-pathogen interactions in C. elegans, since certain microbes do not efficiently infect worms in liquid culture.
	We show how the method can be used to quantify the importance of genes in anti-fungal innate immunity in C. elegans. In this case, the approach relies on the use of a transgenic strain carrying an epidermal infection-inducible fluorescent reporter gene, with GFP under the control of the promoter of the antimicrobial peptide gene nlp 29 and a red fluorescent reporter that is expressed constitutively in the epidermis. The latter provides an internal control for the functional integrity of the epidermis and nonspecific transgene silencing9. When control worms are infected by the fungus they fluoresce green. Knocking down by RNAi a gene required for nlp 29 expression results in diminished fluorescence after infection. Currently, this protocol allows more than 3,000 RNAi clones to be tested and analyzed per week, opening the possibility of screening the entire genome in less than 2 months.

Quantitative and Automated High-throughput Genome-wide RNAi Screens in C. elegans

We describe a protocol using C. elegans and RNAi feeding libraries that allows automated measurement of multiple parameters such as fluorescence, size and opacity of individual worms in a population. We give one example of a screen to identify genes involved in anti-fungal innate immunity in C. elegans.

Quantitative e automatica High-throughput Genome-wide Schermi RNAi in C. elegans</em

RNA interference is a powerful method to understand gene function, especially when conducted at a whole-genome scale and in a quantitative context. In C. ...

A Liquid Phase Affinity Capture Assay Using Magnetic Beads to Study Protein-Protein Interaction: The Poliovirus-Nanobody Example

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein labeled, this method can be implemented for the investigation of protein-protein interactions. It is based on one hand on the recognition of the tagged protein by cobalt coated magnetic beads and on the other hand on the interaction between the tagged protein and a second specific protein that is labeled. First, the labeled and tagged proteins are mixed and incubated at room temperature. The magnetic beads, that recognize the tag, are added and the bound fraction of labeled protein is separated from the unbound fraction using magnets. The amount of labeled protein that is captured can be determined in an indirect way by measuring the signal of the labeled protein remained in the unbound fraction. The described liquid phase affinity assay is extremely useful when conformational conversion sensitive proteins are assayed. The development and application of the assay is demonstrated for the interaction between poliovirus and poliovirus recognizing nanobodies1. Since poliovirus is sensitive to conformational conversion2 when attached to a solid surface (unpublished results), the use of ELISA is limited and a liquid phase based system should therefore be preferred. An example of a liquid phase based system often used in polioresearch3,4 is the micro protein A-immunoprecipitation test5. Even though this test has proven its applicability, it requires an Fc-structure, which is absent in the nanobodies6,7. However, as another opportunity, these interesting and stable single-domain antibodies8 can be easily engineered with different tags. The widely used (His)6-tag shows affinity for bivalent ions such as nickel or cobalt, which can on their turn be easily coated on magnetic beads. We therefore developed this simple quantitative affinity capture assay based on cobalt coated magnetic beads. Poliovirus was labeled with 35S to enable unhindered interaction with the nanobodies and to make a quantitative detection feasible. The method is easy to perform and can be established with a low cost, which is further supported by the possibility of effectively regenerating the magnetic beads.

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. It is a reliable technique based on the interaction between magnetic beads and tagged proteins (e.g. nanobodies) on one hand and the affinity between the tagged protein and a second, labeled protein (e.g. poliovirus) on the other.

Un liquido fase di cattura test affinità utilizzando biglie magnetiche per studiare interazioni proteina-proteina: il poliovirus-Nanobody Esempio

In this article, a simple, quantitative, liquid phase affinity capture assay is presented. Provided that one protein can be tagged and another protein ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is less time consuming, less costly, and does not require completed genome information, there are two weaknesses in this method: (1) the possibility of a disparate mutants in the mixed mutant library that counter-selects mutants with decreased competition; and (2) the possibility of partial gene inactivation whereby genes do not entirely lose their function following the insertion of a transposon. Single-gene deletion analysis may compensate for the drawbacks associated with transposon mutagenesis. To improve the efficiency of genome-wide single gene deletion, we attempt to establish a high-throughput technique for genome-wide single gene deletion using Streptococcus sanguinis as a model organism. Each gene deletion construct in S. sanguinis genome is designed to comprise 1-kb upstream of the targeted gene, the aphA-3 gene, encoding kanamycin resistance protein, and 1-kb downstream of the targeted gene. Three sets of primers F1/R1, F2/R2, and F3/R3, respectively, are designed and synthesized in a 96-well plate format for PCR-amplifications of those three components of each deletion construct. Primers R1 and F3 contain 25-bp sequences that are complementary to regions of the aphA-3 gene at their 5' end. A large scale PCR amplification of the aphA-3 gene is performed once for creating all single-gene deletion constructs. The promoter of aphA-3 gene is initially excluded to minimize the potential polar effect of kanamycin cassette. To create the gene deletion constructs, high-throughput PCR amplification and purification are performed in a 96-well plate format. A linear recombinant PCR amplicon for each gene deletion will be made up through four PCR reactions using high-fidelity DNA polymerase. The initial exponential growth phase of S. sanguinis cultured in Todd Hewitt broth supplemented with 2.5% inactivated horse serum is used to increase competence for the transformation of PCR-recombinant constructs. Under this condition, up to 20% of S. sanguinis cells can be transformed using ~50 ng of DNA. Based on this approach, 2,048 mutants with single-gene deletion were ultimately obtained from the 2,270 genes in S. sanguinis excluding four gene ORFs contained entirely within other ORFs in S. sanguinis SK36 and 218 potential essential genes. The technique on creating gene deletion constructs is high throughput and could be easy to use in genome-wide single gene deletions for any transformable bacteria.

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

An efficient genome-wide single gene mutation method has been established using Streptococcus sanguinis as a model organism. This method has achieved via high throughput recombinant PCRs and transformations.

Genome-wide gene delezioni in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Da Throughput PCR ad alta

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

L&#39;analisi citofluorimetrica di bimolecular Complementation Fluorescenza: A High Throughput Metodo quantitativo per studiare l&#39;interazione proteina-proteina

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. However, the use of biochemical screens aimed at extending the knowledge gained from genetic analysis was explored only recently. Here we describe a method to purify the protein complex that associates with any protein of interest from adult fly heads. This method takes advantage of the Drosophila GAL4/UAS system to express a bait protein fused with a Tandem Affinity Purification (TAP) tag in fly neurons in vivo, and then implements two rounds of purification using a TAP procedure similar to the one originally established in yeast1 to purify the interacting protein complex. At the end of this procedure, a mixture of multiple protein complexes is obtained whose molecular identities can be determined by mass spectrometry. Validation of the candidate proteins will benefit from the resource and ease of performing loss-of-function studies in flies. Similar approaches can be applied to other fly tissues. We believe that the combination of genetic manipulations and this proteomic approach in the fly model system holds tremendous potential for tackling fundamental problems in the field of neurobiology and beyond.

Identifying Protein-protein Interaction in Drosophila Adult Heads by Tandem Affinity Purification TAP

Drosophila is famous for its powerful genetic manipulation, but not for its suitability of in-depth biochemical analysis. Here we present a TAP-based procedure to identify interacting partners of any protein of interest from the fly brain. This procedure can potentially lead to new avenues of research.

Identificare proteina-proteina interazione in<em&gt; Drosophila</em&gt; Adult capi di Tandem Affinity Purification (TAP)

Genetic screens conducted using Drosophila melanogaster (fruit fly) have made numerous milestone discoveries in the advance of biological sciences. ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

Interazioni proteina-proteina visualizzati tramite bimolecular complementazione fluorescenza in protoplasti di tabacco e foglie

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

Mappatura Genome-wide di Drug-DNA interazioni nelle celle con COSMIC (reticolazione di piccole molecole per isolare cromatina)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID-seq: Genome-wide Mappatura delle interazioni proteina-DNA da High Throughput Sequencing di Adenina-metilato frammenti di DNA

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...