Poiché il polmone ospita un sistema immunitario molto complesso e unico, sono state sviluppate e riportate diverse strategie di gating per l'identificazione delle cellule immunitarie polmonari. L'esistenza di diversi approcci rende difficile confrontare i risultati generati da diversi laboratori. La nostra strategia di gating fornisce un modo completo e riproducibile per identificare fino a 12 diverse popolazioni immunitarie mieloidi polmonari e non mieloidi utilizzando nove marcatori.
Il presente protocollo descrive la caratterizzazione e l'identificazione di popolazioni immunitarie polmonari in condizioni di stato stazionario. Tuttavia, questo protocollo può essere impiegato per identificare i cambiamenti di queste popolazioni cellulari in vari modelli di malattia, dove può aiutare a identificare i cambiamenti specifici della malattia del panorama immunitario polmonare. I ricercatori che eseguono questa tecnica per la prima volta dovrebbero prestare attenzione alle condizioni di digestione e ai reagenti, poiché fanno una grande differenza nel rilascio di cellule immunitarie dal tessuto polmonare.
Inizia preparando l'animale eutanasizzato per l'intervento chirurgico. Stabilizzare il topo dorsalmente usando aghi o nastro adesivo sulle quattro estremità, quindi utilizzare il 70% di etanolo per disinfettare la pelle dell'area ventrale. Fai un'incisione dal collo all'addome.
Rimuovere la pelle dalla zona toracica, insieme alle costole e allo sterno. Lavare i polmoni iniettando 10 millilitri di PBS freddo nel ventricolo destro usando un ago da 18 a 21 calibri fino a quando non diventano completamente bianchi. Quindi, rimuovere il timo e il cuore senza toccare i polmoni.
Staccare i polmoni dai tessuti circostanti e trasferirli in un tubo contenente tampone BSA freddo. Trasferire il polmone in una capsula di Petri, tritarlo usando due bisturi fini e quindi posizionarlo in un tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere cinque millilitri di tampone di digestione per lavare il piatto.
Fissare il coperchio del tubo e digerire il polmone per 30 minuti su uno shaker orbitale ad una velocità di 150 rotazioni al minuto a 37 gradi Celsius. Interrompere la reazione aggiungendo 10 millilitri di tampone BSA freddo. Dopo la digestione, mescolare e sciogliere i pezzi polmonari usando un ago calibro 18.
Posizionare un filtro da 70 micrometri sopra un nuovo tubo conico da 50 millilitri e trasferire la miscela polmonare digerita nel colino. Utilizzare il lato in gomma di uno stantuffo a siringa da 10 millilitri per rompere i restanti pezzi polmonari sul filtro e lavarlo con tampone BSA. Centrifugare la sospensione monocellulare a 350 G per otto minuti a sette gradi Celsius.
Scartare il surnatante e risospese le cellule in un millilitro di tampone di lisi ACK. Mescolare la sospensione utilizzando una pipetta da un millilitro e incubarla per 90 secondi a temperatura ambiente. Aggiungere 10 millilitri di tampone BSA freddo alla miscela di reazione e centrifugarla a 350 G per sette minuti a quattro gradi Celsius.
Scartare il surnatante, risospesciare il pellet nel tampone di colorazione e contare le cellule usando un emocitometro. Risospese le cellule ad una concentrazione di 5 milioni di cellule per millilitro per la colorazione superficiale. Trasferire 1 milione di celle in 200 microlitri per pozzo in una piastra da 96 pozzetti e centrifugare la piastra a 350 G per sette minuti a quattro gradi Celsius.
Preparare una soluzione di blocco per citometria a flusso diluendo l'anticorpo anti-1632 nel tampone di colorazione. Risospesare le cellule in 50 microlitri della soluzione a blocchi di citometria a flusso. Incubare la sospensione per 15-20 minuti a quattro gradi Celsius o sul ghiaccio.
Quindi, aggiungere 150 microlitri di tampone di colorazione alla piastra e centrifugarla a 350 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Preparare la soluzione anticorpale di superficie diluendo gli anticorpi superficiali nel tampone di colorazione. Risospese le cellule in 50 microlitri della soluzione anticorpale di superficie e incubare la piastra a quattro gradi Celsius al buio.
Quindi, lavare le cellule due volte con tampone colorante. Preparare il tampone di fissazione e permeabilizzazione mescolando tre parti di diluente di fissazione e permeabilizzazione e una parte tampone di colorazione. Risospese le cellule in 50 microlitri del tampone pre-riparato per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e incubarle per 20-25 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Diluire il tampone di permeabilizzazione con acqua deionizzata purificata per preparare una volta il tampone di permeabilizzazione e utilizzarlo per lavare le cellule. Preparare una soluzione anticorpale intracellulare diluendo con un millilitro di tampone di permeabilizzazione. Risospesso le cellule in 50 microlitri della soluzione anticorpale intracellulare diluita per pozzetto della piastra a 96 pozzetti e incubare per 40 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Lavare le cellule con tampone di permeabilizzazione, quindi con tampone di colorazione. Dopo il lavaggio finale, risospese le cellule in 200 microlitri di tampone di colorazione. Acquisire un minimo di 1,5 milioni di cellule per campione sul citometro a flusso.
Dopo un intervento chirurgico di successo e un'appropriata procedura postoperatoria, i detriti e i doppietti sono stati esclusi attraverso una strategia di gating. Le cellule immunitarie sono state identificate utilizzando il marcatore ematopoietico CD45+ tramite citometria a flusso. Le cellule erano distinte come vive o morte.
Le cellule polmonari immunitarie sono state classificate in tre gruppi utilizzando anticorpi anti-GR-1 e anti-CD68. I neutrofili sono stati identificati e verificati utilizzando Ly6G come marcatore unico. La popolazione CD45+ contiene anche cellule natural killer, cellule T e cellule B.
Queste cellule sono state colorate e verificate dagli anticorpi natural killer 1.1, CD3 e B220. Il lavaggio broncoalveolare ha identificato eosinofili positivi per il marcatore CD11b e macrofagi alveolari che non esprimevano alti livelli di CD11b. Le cellule dendritiche CD45 + sono state trovate e confermate dall'espressione di CD24.
Queste cellule hanno mostrato una risposta positiva o negativa verso i marcatori CD103 e CD11b. Le cellule CD103 negative sono state classificate come cellule dendritiche convenzionali e derivate da monociti in base all'espressione di CD64. le cellule dendritiche derivate dai monociti erano basse positive per il marcatore dendritico CD24 e positive per il marcatore pan-macrofago CD64.
I macrofagi interstiziali con monociti classici e non classici sono stati distinti in base all'espressione di CD64 e GR-1. Queste cellule hanno mostrato un'espressione positiva per il recettore delle chemochine CX3C uno. I passaggi più importanti in questa procedura sono la corretta raccolta dei tessuti, la digestione e la preparazione della sospensione unicellulare e il gating su cellule vive e singoletti.
Oltre a caratterizzare le cellule immunitarie del polmone mediante citometria a flusso, è possibile eseguire la coltura cellulare e i saggi funzionali in popolazioni cellulari isolate. Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori per esplorare nuove domande nelle malattie del polmone, come infezioni, malattie autoimmuni e cancro.
