Ringraziamo Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard per l&#39;uso di una pompa peristaltica e vibratome, così come Karen L. Bentley e Gayle Schneider al Fondo Electron Microscope Nucleo di Ricerca dell&#39;Università di Rochester Medical Center di assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da finanziamenti del NIH (EY019277), Whitehall Fondazione, Burroughs Wellcome Fondo, e l&#39;Alfred P. Sloan Foundation per AKM. M.-È.T. è finanziato da un Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) premio di formazione post-dottorato.

1. Animal perfusione <ol><li> Il giorno prima di perfusione, preparare: - 2 L di tampone fosfato (PB, 100 mM, pH 7,4) e 1 l di sodio PBS (PBS, 0.9% NaCl nel PB 50 mM, pH 7,4) in acqua bidistillata. Conservare il PBS e 1L di PB a 4 ° C. Questi saranno utilizzati per la perfusione e pre-embedding immunocitochimica. - 1L del 4,0% paraformaldeide (PFA, pH 7,4) la soluzione fissativa, che consentirà la perfusione di 6 topi. A tal fine, riscaldare 1 litro di PB sotto una cappa aspirante. Pesare 40 g di granulare paraformaldeide (PFA) e versare la soluzione PB quando raggiunge i 60 ° C. Quando la soluzione è chiara, con la PFA completamente sciolto, raffreddare a temperatura ambiente (RT) e conservare a 4 ° C. </li><li> Il giorno della perfusione, preparare 500 ml di soluzione acroleina 3,5% in PB sotto una cappa aspirante. Poi, filtrare il 3,5% e 4,0% acroleina soluzioni PFA utilizzando carta da filtro. </li><li> Per l&#39;anestesia del mouse, iniettare sodio pentobarbital (80 mg / kg) nel peritoneo con un calibro 27 ½ &quot;ago. </li><li> Durante la perfusione, 50 ml di PBS, 75 ml di acroleina, e 150 mL di PFA in sequenza passare nella circolazione del mouse. Per impostare la pompa peristaltica, riempire il tubo con PBS e fissare un 23 gauge ¾ &quot;ago a farfalla ad una estremità. Immergere l&#39;altra estremità del tubo nella soluzione di perfusione (PBS, acroleina o PFA). Impostare la velocità del peristaltica Pompa a 20-25 ml / min per topi giovani e adulti. Durante la perfusione, accuratamente evitare qualsiasi formazione di bolle d&#39;aria nelle tubazioni. </li><li> Attendere fino a quando il mouse non risponde più anestetizzati agli stimoli dolorosi, come un pizzico di coda, prima di procedere. Giaceva l&#39;animale in un vassoio dissezione e fissare le zampe con del nastro. Con le pinzette e forbici, aprire la pelle e la cavità toracica per esporre il cuore. Per ridurre al minimo l&#39;ischemia cerebrale, la perfusione deve essere avviato rapidamente. Taglio aperto l&#39;atrio destro con piccole forbici e avviare la pompa peristaltica. Tenendo il cuore con le pinzette, inserire l&#39;ago a farfalla in all&#39;apice del ventricolo sinistro. </li><li> Quando si cambia la soluzione, fermare la pompa peristaltica, trasferire il tubo da una soluzione all&#39;altra, e riavviare la pompa immediatamente. </li><li> Quando 150 ml di PFA è passato, fermare la pompa peristaltica. Utilizzando piccole forbici, tagliare la testa, aprire la pelle, e rompere il cranio in mezzo agli occhi. Utilizzando una pinzetta piccola, con attenzione chip di fuori piccoli pezzi di cranio, fino a quando il cervello può essere facilmente rimosso. Post-fix il cervello per 2 ore a 4 ° C in PFA. Lavare 3 volte 10 minuti in PBS. </li><li> Immediatamente tagliato il cervello in trasversale (50 sezioni micron di spessore) in ghiaccio raffreddato PBS usando una vibratome. Con un pennello fine, il trasferimento di sezioni selezionate per immunocitochimica in un flaconcino di vetro contenente PBS. Conservare le restanti sezioni a -20 ° C in crioprotettore (30% glicole etilenico e il 30% glicerolo in PBS) fino a diversi anni. </li></ol> 2. Pre-embedding immunocitochimica <ol><li> Per immunocitochimica, le sezioni sono trattati liberamente fluttuanti in flaconcini di vetro. Nel corso della procedura, si ha la necessità di evitare con cura lasciando sezioni asciugarsi. </li><li> In primo luogo, rimuovere la PBS usando una pipetta trasferire e sostituire immediatamente con una soluzione fresca di boroidruro di sodio 0,1% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 3 volte 10 minuti, eliminando tutte le bolle, e incubare per 2 ore a temperatura ambiente in una soluzione bloccante di PBS contenente 0,5% di gelatina e il 5% di siero normale dell&#39;animale in cui l&#39;anticorpo secondario è stata generata (siero di capra normale l&#39;esempio attuale di Iba1-immunostaining). </li><li> Incubare per 48 ore con l&#39;anticorpo primario nel bloccare soluzione. Per Iba1-immunostaining, l&#39;uso di coniglio anti-Iba1 anticorpi (1:1000). </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 3 volte 10 minuti e incubare anticorpo secondario coniugato con biotina (1:1000) nel bloccare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente. Per Iba1-immunostaining, l&#39;uso di capra anti-IgG di coniglio. </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 3 volte 10 minuti e incubare streptavidina-perossidasi di rafano (1:1000) nel bloccare la soluzione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 10 minuti e con Tris / HCl soluzione salina tamponata (TBS, 50 mM, pH 7.4) 2 volte 10 minuti. Per rivelare l&#39;etichettatura, incubare sezioni con 0,05% DAB e perossido di idrogeno 0,01% in TBS (soluzione appena preparata). Quando la colorazione è marrone scuro (vedi esempio in Figura 1), arrestare la reazione da lavaggio in TBS. In ogni caso, terminare la reazione dopo un massimo di 5 minuti. Sciacquare le sezioni con TBS 10 minuti e con PB 2 volte 10 minuti. </li></ol> 3. Elaborazione per la microscopia elettronica <ol><li> Trasferimento sezioni in PB in una piastra di coltura pozzetti con un pennello sottile. Preparare una soluzione 1% tetrossido di osmio in PB sotto un cappuccio fumante. Rimuovere PB dai pozzetti della piastra e la cultura<html> diffondere i tratti pianeggianti, con un pennello fine. Sezioni immediatamente immersi in osmio 1% per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le sezioni in flaconi di vetro, sciacquare con PB 3 volte 10 minuti, e disidratare con 2 immersioni minuti di ascendente concentrazioni di etanolo: 2 volte 35%, 1 volta ogni 50%, 70%, 80%, 90%, e 95 %, 3 volte al 100%, seguita da 3 propilene ossido di volte. </li><li> Per preparare la resina Durcupan, unire 20 g di componente A, 20 g di componente B, 0,6 g di componente C, e 0,4 g di componente D in un bicchiere usa e getta, mescolare bene fino a quando il colore diventa uniforme, e versare in alluminio pesano piatto. Se necessario, blocchi di resina può essere preparato versando embedding stampi in resina e curare in un forno ° 55 C per 48-72 ore. </li><li> Utilizzando un pennello fine sciacquati con ossido di propilene, rimuovere le sezioni da ossido di propilene e immergere nella resina Durcupan per impregnazione durante la notte a temperatura ambiente. </li><li> Il giorno seguente, mettere il piatto in alluminio pesano in un forno ° 55 C per 10 minuti per ammorbidire la resina. Con un pennello sciacquati con ossido di propilene, cappotto un film embedding ACLAR con un sottile strato di resina, stabiliscono le sezioni, coprire con un altro film embedding, e distribuire uniformemente pesi leggeri (circa 2 g, per esempio i tappi di plastica di flaconi di vetro) sulla parte superiore per aiutare la diffusione di resina. Per la polimerizzazione della resina, incubare in forno per 48-72 ore (a 55 ° C). </li><li> Dopo la polimerizzazione, rimuovere i pesi leggeri e film incorporare sulla parte superiore delle sezioni. Sotto un microscopio binoculare, selezionare le aree di interesse quadrato (circa 2x2 millimetri) e attentamente accise del film utilizzando una lama di rasoio. </li><li> Incollare i settori di interesse sulla punta dei blocchi di resina utilizzando supercolla e la cura nel forno ° 55 C per 1 ora. </li><li> In preparazione di sezionamento, tagliare il blocco di resina a forma di trapezio isoscele con una lametta. </li><li> Utilizzando un ultramicrotomo e un coltello di vetro, rimuovere la colla e resina sulla superficie del tessuto. Riempire la barca del coltello di vetro con acqua bidistillata e tagliare un paio di semi-sottili sezioni (0.5-1 micron di spessore). </li><li> Trasferire le sezioni di una diapositiva SuperFrost con un ciclo perfetto. A secco le sezioni mettendo il vetrino su una piastra di riscaldamento a 80 ° C per 1 minuto. Coprire con qualche goccia di toluidina 0,1% macchia blu (2 g di borato di sodio e 0,2 g di blu di toluidina in 200 ml di acqua bidistillata) per 1 minuto. Sciacquare l&#39;eccesso macchia con acqua bidistillata. L&#39;esame delle sezioni con un microscopio ottico permetterà di distinguere il tessuto macchiato dalla resina (Figura 2). </li><li> Riprendi il taglio fino al confine tra il tessuto e resina raggiunge la metà delle sezioni. Si noti che la seguente procedura richiede una formazione. Sostituire il coltello di vetro con un coltello di diamante e riempire la barca con acqua bidistillata. Taglio argento per argento-oro sezioni ultrasottili (60-80 nm di spessore) e con cura la raccolta sulle reti mesh di rame utilizzando bene le pinzette invertita. Asciugare le griglie in una carta da filtro. </li><li> Per aumentare il contrasto, le sezioni ultrasottili possono essere colorate con citrato di piombo (0,03 g di citrato di piombo e 0,1 ml di idrossido di sodio 10N in 10 ml di acqua bidistillata 1). Usando bene le pinzette invertita, trasferire una griglia per una goccia di citrato di piombo per 2 minuti. Togliere la griglia e delicatamente lavare in 3 bagni successivi di acqua bidistillata. Infine, asciugare le reti su una carta da filtro e conservare in una scatola griglia fino a quando l&#39;esame al microscopio elettronico (Figure 3-6). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iba1 macchiato di sezione a livello microscopico luce. La distribuzione cellulare di Iba1 è limitato a microglia, che mostra la specificità del immunocolorazione. Barra di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Toluidine azzurro macchiato di semi-sottile sezione a livello microscopico luce. Nota al confine tra il tessuto e resina dove l&#39;immunocolorazione apparirà più intensi al microscopio elettronico. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ultrasottile sezione che mostra Iba1-immunopositive pericarion microglia e dei processi a livello al microscopio elettronico. Elementi strutturali Iba1-positivi sono riconosciuti dai loro immunoperossidasi-DAB elettrone-denso precipitato. Barra di scala = 2 micron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ultrasottile sezione di visualizzazione di processi microglia Iba1-immunopositive di diverse dimensioni e forme a livello al microscopio elettronico. Barra di scala = 2 micron. e 5 &quot;/&gt; Figura 5. Sezione ultrasottile mostrando a più alto ingrandimento uno Iba1-positivo processo di microglia dalla Figura 4, che consente l&#39;identificazione dei suoi organelli intracellulari. Barra di scala = 1 micron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Ultrasottile sezione rivelando a maggiore ingrandimento le relazioni ultrastrutturali tra un Iba1-positivo processo di microglia e gli elementi vicini di neuropilo tra sinapsi. Barra di scala = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui abbiamo descritto un protocollo per la preparazione del tessuto cerebrale di topo microscopia immunoelectron che offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica, quando le procedure sono rigorosamente eseguiti. In combinazione con TEM, questo metodo consente di distinguere elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione. In particolare, il immunoperossidasi-DAB colorazione dei Iba1 consente di identif...

* Si deve sempre lavorare sotto una cappa aspirante e indossare guanti di nitrile quando si maneggiano acroleina, paraformaldeide e osmio e deve anche smaltire i propri rifiuti in modo corretto.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è estremamente utile per la visualizzazione della microglia, scomparti oligodendrocytic, astrociti, neuroni e subcellulare (dendrite, spine dendritiche, assone, assone terminale, pericarion), così come i loro organelli intracellulari e citoscheletro, nel sistema nervoso centrale a ad alta risoluzione spaziale. In combinazione con TEM, pre-embedding immunocitochimica consente la discriminazione di elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione (ad esempio microglia perikarya e processi, quando si utilizza un anticorpo contro la microglia specifico marcatore Iba1 (ionizzato molecola adattatrice calcio vincolante 1; presentato qui)), che indicano il contenuto neurotrasmettitore degli elementi cellulari (ad esempio, serotoninergici) e la loro localizzazione ultrastrutturale di proteine ​​solubili o di membrana (ad esempio, 5 HT1A e EphA4 recettori). Qui, descriviamo un protocollo per la perfusione transcardiac di topi con acroleina fissativo, rimozione e sezionamento del cervello, così come immunoperossidasi-diaminobenzidina (DAB) colorazione, l&#39;incorporamento resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l&#39;esame con TEM. Quando rigorosamente eseguito, questa tecnica offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l&#39;esame con microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

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JoVE Journal

Neuroscience

36.7K Views.  University of Rochester. Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Ricerca

Neuroscienze

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in preparation for detailed downstream analysis such as flow cytometry or single-cell sequencing. Neural dissociation can be conducted via mechanical dissociation (such as using filters, chopping techniques, or pipette trituration), enzymatic digestion, or a combination thereof. The delicate nature of neuronal cells can complicate efforts to obtain the highly viable, true single-cell suspension with minimal cellular debris that is required for single-cell analysis. The data demonstrate that this combination of automated mechanical dissociation and enzymatic digestion consistently yields a highly viable (&gt;90%) single-cell suspension, overcoming the aforementioned difficulties. While a few of the steps require manual dexterity, these steps lessen sample handling and potential cell loss. This manuscript details each step of the process to equip other laboratories to successfully dissociate small quantities of neural tissue in preparation for downstream analysis.

This neural cell dissociation protocol is intended for samples with a low amount of starting material and yields a highly viable single-cell suspension for downstream analysis, with optional fixation and staining steps.

Dissociazione meccanica ed enzimatica combinata del tessuto ippocampale cerebrale del topo

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Deep-Tissue Three-Photon Fluorescence Microscopy in Intact Mouse and Zebrafish Brain

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo imaging with subcellular resolution. 3PM has two major advantages for deep-tissue imaging over 2PM that has been widely used in biology laboratories: (i) longer attenuation length in scattering tissues by employing ~1,300 nm or ~1,700 nm excitation laser; (ii) less background fluorescence generation due to higher-order nonlinear excitation. As a result, 3PM allows high-contrast structural and functional imaging deep within scattering tissues such as intact mouse brain from the cortical layers to the hippocampus and the entire forebrain of adult zebrafish.
Today, laser sources suitable for 3PM are commercially available, enabling the conversion of an existing two-photon (2P) imaging system to a three-photon (3P) system. Additionally, multiple commercial 3P microscopes are available, which makes this technique readily available to biology research laboratories. This paper shows the optimization of a typical 3PM setup, particularly targeting biology groups that already have a 2P setup, and demonstrates intravital 3D imaging in intact mouse and adult zebrafish brains. This protocol covers the full experimental procedure of 3P imaging, including microscope alignment, prechirping of ~1,300 and ~1,700 nm laser pulses, animal preparation, and intravital 3P fluorescence imaging deep in adult zebrafish and mouse brains.

Three-photon microscopy enables high-contrast fluorescence imaging deep in living biological tissues, such as mouse and zebrafish brains, with high spatiotemporal resolution.

Microscopia a fluorescenza a tre fotoni nei tessuti profondi nel cervello intatto di topo e zebrafish

Multiphoton microscopy techniques, such as two-photon microscopy (2PM) and three-photon microscopy (3PM), are powerful tools for deep-tissue in vivo ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Imaging a singola cellula dell'intero cervello e analisi di cervelli di topo neonatale intatti mediante risonanza magnetica, pulizia dei tessuti e microscopia a foglio luminoso

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Imaging a due fotoni e calcio ad ampio campo nel collicolo superiore

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Autore in primo piano: Svelare la codifica neurale e i meccanismi di elaborazione visiva nel collicolo superiore 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...