Ringraziamo Shao-Ming Lu e Harris A. Gelbard per l&#39;uso di una pompa peristaltica e vibratome, così come Karen L. Bentley e Gayle Schneider al Fondo Electron Microscope Nucleo di Ricerca dell&#39;Università di Rochester Medical Center di assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da finanziamenti del NIH (EY019277), Whitehall Fondazione, Burroughs Wellcome Fondo, e l&#39;Alfred P. Sloan Foundation per AKM. M.-È.T. è finanziato da un Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) premio di formazione post-dottorato.

1. Animal perfusione <ol><li> Il giorno prima di perfusione, preparare: - 2 L di tampone fosfato (PB, 100 mM, pH 7,4) e 1 l di sodio PBS (PBS, 0.9% NaCl nel PB 50 mM, pH 7,4) in acqua bidistillata. Conservare il PBS e 1L di PB a 4 ° C. Questi saranno utilizzati per la perfusione e pre-embedding immunocitochimica. - 1L del 4,0% paraformaldeide (PFA, pH 7,4) la soluzione fissativa, che consentirà la perfusione di 6 topi. A tal fine, riscaldare 1 litro di PB sotto una cappa aspirante. Pesare 40 g di granulare paraformaldeide (PFA) e versare la soluzione PB quando raggiunge i 60 ° C. Quando la soluzione è chiara, con la PFA completamente sciolto, raffreddare a temperatura ambiente (RT) e conservare a 4 ° C. </li><li> Il giorno della perfusione, preparare 500 ml di soluzione acroleina 3,5% in PB sotto una cappa aspirante. Poi, filtrare il 3,5% e 4,0% acroleina soluzioni PFA utilizzando carta da filtro. </li><li> Per l&#39;anestesia del mouse, iniettare sodio pentobarbital (80 mg / kg) nel peritoneo con un calibro 27 ½ &quot;ago. </li><li> Durante la perfusione, 50 ml di PBS, 75 ml di acroleina, e 150 mL di PFA in sequenza passare nella circolazione del mouse. Per impostare la pompa peristaltica, riempire il tubo con PBS e fissare un 23 gauge ¾ &quot;ago a farfalla ad una estremità. Immergere l&#39;altra estremità del tubo nella soluzione di perfusione (PBS, acroleina o PFA). Impostare la velocità del peristaltica Pompa a 20-25 ml / min per topi giovani e adulti. Durante la perfusione, accuratamente evitare qualsiasi formazione di bolle d&#39;aria nelle tubazioni. </li><li> Attendere fino a quando il mouse non risponde più anestetizzati agli stimoli dolorosi, come un pizzico di coda, prima di procedere. Giaceva l&#39;animale in un vassoio dissezione e fissare le zampe con del nastro. Con le pinzette e forbici, aprire la pelle e la cavità toracica per esporre il cuore. Per ridurre al minimo l&#39;ischemia cerebrale, la perfusione deve essere avviato rapidamente. Taglio aperto l&#39;atrio destro con piccole forbici e avviare la pompa peristaltica. Tenendo il cuore con le pinzette, inserire l&#39;ago a farfalla in all&#39;apice del ventricolo sinistro. </li><li> Quando si cambia la soluzione, fermare la pompa peristaltica, trasferire il tubo da una soluzione all&#39;altra, e riavviare la pompa immediatamente. </li><li> Quando 150 ml di PFA è passato, fermare la pompa peristaltica. Utilizzando piccole forbici, tagliare la testa, aprire la pelle, e rompere il cranio in mezzo agli occhi. Utilizzando una pinzetta piccola, con attenzione chip di fuori piccoli pezzi di cranio, fino a quando il cervello può essere facilmente rimosso. Post-fix il cervello per 2 ore a 4 ° C in PFA. Lavare 3 volte 10 minuti in PBS. </li><li> Immediatamente tagliato il cervello in trasversale (50 sezioni micron di spessore) in ghiaccio raffreddato PBS usando una vibratome. Con un pennello fine, il trasferimento di sezioni selezionate per immunocitochimica in un flaconcino di vetro contenente PBS. Conservare le restanti sezioni a -20 ° C in crioprotettore (30% glicole etilenico e il 30% glicerolo in PBS) fino a diversi anni. </li></ol> 2. Pre-embedding immunocitochimica <ol><li> Per immunocitochimica, le sezioni sono trattati liberamente fluttuanti in flaconcini di vetro. Nel corso della procedura, si ha la necessità di evitare con cura lasciando sezioni asciugarsi. </li><li> In primo luogo, rimuovere la PBS usando una pipetta trasferire e sostituire immediatamente con una soluzione fresca di boroidruro di sodio 0,1% in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 3 volte 10 minuti, eliminando tutte le bolle, e incubare per 2 ore a temperatura ambiente in una soluzione bloccante di PBS contenente 0,5% di gelatina e il 5% di siero normale dell&#39;animale in cui l&#39;anticorpo secondario è stata generata (siero di capra normale l&#39;esempio attuale di Iba1-immunostaining). </li><li> Incubare per 48 ore con l&#39;anticorpo primario nel bloccare soluzione. Per Iba1-immunostaining, l&#39;uso di coniglio anti-Iba1 anticorpi (1:1000). </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 3 volte 10 minuti e incubare anticorpo secondario coniugato con biotina (1:1000) nel bloccare la soluzione per 2 ore a temperatura ambiente. Per Iba1-immunostaining, l&#39;uso di capra anti-IgG di coniglio. </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 3 volte 10 minuti e incubare streptavidina-perossidasi di rafano (1:1000) nel bloccare la soluzione per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Sciacquare le sezioni con PBS 10 minuti e con Tris / HCl soluzione salina tamponata (TBS, 50 mM, pH 7.4) 2 volte 10 minuti. Per rivelare l&#39;etichettatura, incubare sezioni con 0,05% DAB e perossido di idrogeno 0,01% in TBS (soluzione appena preparata). Quando la colorazione è marrone scuro (vedi esempio in Figura 1), arrestare la reazione da lavaggio in TBS. In ogni caso, terminare la reazione dopo un massimo di 5 minuti. Sciacquare le sezioni con TBS 10 minuti e con PB 2 volte 10 minuti. </li></ol> 3. Elaborazione per la microscopia elettronica <ol><li> Trasferimento sezioni in PB in una piastra di coltura pozzetti con un pennello sottile. Preparare una soluzione 1% tetrossido di osmio in PB sotto un cappuccio fumante. Rimuovere PB dai pozzetti della piastra e la cultura<html> diffondere i tratti pianeggianti, con un pennello fine. Sezioni immediatamente immersi in osmio 1% per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Trasferire le sezioni in flaconi di vetro, sciacquare con PB 3 volte 10 minuti, e disidratare con 2 immersioni minuti di ascendente concentrazioni di etanolo: 2 volte 35%, 1 volta ogni 50%, 70%, 80%, 90%, e 95 %, 3 volte al 100%, seguita da 3 propilene ossido di volte. </li><li> Per preparare la resina Durcupan, unire 20 g di componente A, 20 g di componente B, 0,6 g di componente C, e 0,4 g di componente D in un bicchiere usa e getta, mescolare bene fino a quando il colore diventa uniforme, e versare in alluminio pesano piatto. Se necessario, blocchi di resina può essere preparato versando embedding stampi in resina e curare in un forno ° 55 C per 48-72 ore. </li><li> Utilizzando un pennello fine sciacquati con ossido di propilene, rimuovere le sezioni da ossido di propilene e immergere nella resina Durcupan per impregnazione durante la notte a temperatura ambiente. </li><li> Il giorno seguente, mettere il piatto in alluminio pesano in un forno ° 55 C per 10 minuti per ammorbidire la resina. Con un pennello sciacquati con ossido di propilene, cappotto un film embedding ACLAR con un sottile strato di resina, stabiliscono le sezioni, coprire con un altro film embedding, e distribuire uniformemente pesi leggeri (circa 2 g, per esempio i tappi di plastica di flaconi di vetro) sulla parte superiore per aiutare la diffusione di resina. Per la polimerizzazione della resina, incubare in forno per 48-72 ore (a 55 ° C). </li><li> Dopo la polimerizzazione, rimuovere i pesi leggeri e film incorporare sulla parte superiore delle sezioni. Sotto un microscopio binoculare, selezionare le aree di interesse quadrato (circa 2x2 millimetri) e attentamente accise del film utilizzando una lama di rasoio. </li><li> Incollare i settori di interesse sulla punta dei blocchi di resina utilizzando supercolla e la cura nel forno ° 55 C per 1 ora. </li><li> In preparazione di sezionamento, tagliare il blocco di resina a forma di trapezio isoscele con una lametta. </li><li> Utilizzando un ultramicrotomo e un coltello di vetro, rimuovere la colla e resina sulla superficie del tessuto. Riempire la barca del coltello di vetro con acqua bidistillata e tagliare un paio di semi-sottili sezioni (0.5-1 micron di spessore). </li><li> Trasferire le sezioni di una diapositiva SuperFrost con un ciclo perfetto. A secco le sezioni mettendo il vetrino su una piastra di riscaldamento a 80 ° C per 1 minuto. Coprire con qualche goccia di toluidina 0,1% macchia blu (2 g di borato di sodio e 0,2 g di blu di toluidina in 200 ml di acqua bidistillata) per 1 minuto. Sciacquare l&#39;eccesso macchia con acqua bidistillata. L&#39;esame delle sezioni con un microscopio ottico permetterà di distinguere il tessuto macchiato dalla resina (Figura 2). </li><li> Riprendi il taglio fino al confine tra il tessuto e resina raggiunge la metà delle sezioni. Si noti che la seguente procedura richiede una formazione. Sostituire il coltello di vetro con un coltello di diamante e riempire la barca con acqua bidistillata. Taglio argento per argento-oro sezioni ultrasottili (60-80 nm di spessore) e con cura la raccolta sulle reti mesh di rame utilizzando bene le pinzette invertita. Asciugare le griglie in una carta da filtro. </li><li> Per aumentare il contrasto, le sezioni ultrasottili possono essere colorate con citrato di piombo (0,03 g di citrato di piombo e 0,1 ml di idrossido di sodio 10N in 10 ml di acqua bidistillata 1). Usando bene le pinzette invertita, trasferire una griglia per una goccia di citrato di piombo per 2 minuti. Togliere la griglia e delicatamente lavare in 3 bagni successivi di acqua bidistillata. Infine, asciugare le reti su una carta da filtro e conservare in una scatola griglia fino a quando l&#39;esame al microscopio elettronico (Figure 3-6). </li></ol> 4. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iba1 macchiato di sezione a livello microscopico luce. La distribuzione cellulare di Iba1 è limitato a microglia, che mostra la specificità del immunocolorazione. Barra di scala = 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Toluidine azzurro macchiato di semi-sottile sezione a livello microscopico luce. Nota al confine tra il tessuto e resina dove l&#39;immunocolorazione apparirà più intensi al microscopio elettronico. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Ultrasottile sezione che mostra Iba1-immunopositive pericarion microglia e dei processi a livello al microscopio elettronico. Elementi strutturali Iba1-positivi sono riconosciuti dai loro immunoperossidasi-DAB elettrone-denso precipitato. Barra di scala = 2 micron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Ultrasottile sezione di visualizzazione di processi microglia Iba1-immunopositive di diverse dimensioni e forme a livello al microscopio elettronico. Barra di scala = 2 micron. e 5 &quot;/&gt; Figura 5. Sezione ultrasottile mostrando a più alto ingrandimento uno Iba1-positivo processo di microglia dalla Figura 4, che consente l&#39;identificazione dei suoi organelli intracellulari. Barra di scala = 1 micron. <img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Ultrasottile sezione rivelando a maggiore ingrandimento le relazioni ultrastrutturali tra un Iba1-positivo processo di microglia e gli elementi vicini di neuropilo tra sinapsi. Barra di scala = 1μm.

<ol>
	<li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy.">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li><li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain.">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus.">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li><li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus.">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain.">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li><li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain.">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Qui abbiamo descritto un protocollo per la preparazione del tessuto cerebrale di topo microscopia immunoelectron che offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica, quando le procedure sono rigorosamente eseguiti. In combinazione con TEM, questo metodo consente di distinguere elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione. In particolare, il immunoperossidasi-DAB colorazione dei Iba1 consente di identif...

* Si deve sempre lavorare sotto una cappa aspirante e indossare guanti di nitrile quando si maneggiano acroleina, paraformaldeide e osmio e deve anche smaltire i propri rifiuti in modo corretto.

preparation of mouse brain tissue for immunoelectron microscopy

Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è estremamente utile per la visualizzazione della microglia, scomparti oligodendrocytic, astrociti, neuroni e subcellulare (dendrite, spine dendritiche, assone, assone terminale, pericarion), così come i loro organelli intracellulari e citoscheletro, nel sistema nervoso centrale a ad alta risoluzione spaziale. In combinazione con TEM, pre-embedding immunocitochimica consente la discriminazione di elementi cellulari con pochi tratti distintivi e dei criteri di identificazione (ad esempio microglia perikarya e processi, quando si utilizza un anticorpo contro la microglia specifico marcatore Iba1 (ionizzato molecola adattatrice calcio vincolante 1; presentato qui)), che indicano il contenuto neurotrasmettitore degli elementi cellulari (ad esempio, serotoninergici) e la loro localizzazione ultrastrutturale di proteine ​​solubili o di membrana (ad esempio, 5 HT1A e EphA4 recettori). Qui, descriviamo un protocollo per la perfusione transcardiac di topi con acroleina fissativo, rimozione e sezionamento del cervello, così come immunoperossidasi-diaminobenzidina (DAB) colorazione, l&#39;incorporamento resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l&#39;esame con TEM. Quando rigorosamente eseguito, questa tecnica offre un ottimo compromesso tra ottimale conservazione ultrastrutturali e rilevamento immunocitochimica.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l&#39;esame con microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

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JoVE Journal

Neuroscience

36.8K Views.  University of Rochester. Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Ricerca

Neuroscienze

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia Multiphoton di cervello di topo Cancellato Esprimere YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.

Preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per l'analisi Morfolometrica ultrastrutturale della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered tissue samples. Traditional immunolabeling procedures require cutting the sample into thin sections, which restricts the ability to label and examine intact structures. However, if brain tissue can remain intact during processing, structures and circuits can remain intact for the analysis. Previously established clearing methods take significant time to completely clear the tissue, and the harsh chemicals can often damage sensitive antibodies. The iDISCO method quickly and completely clears tissue, is compatible with many antibodies, and requires no special lab equipment. This technique was initially validated for the use in mice tissue, but the current protocol adapts this method to image hemispheres of control and transgenic rat brains. In addition to this, the present protocol also makes several adjustments to preexisting protocol to provide clearer images with less background staining. Antibodies for Iba-1 and tyrosine hydroxylase were validated in the HIV-1 transgenic rat and in F344/N control rats using the present hydrophobic tissue clearing method. The brain is an interwoven network, where structures work together more often than separately of one another. Analyzing the brain as a whole system as opposed to a combination of individual pieces is the greatest benefit of this whole brain clearing method.

Here we present a hydrophobic tissue clearing method that allows for the viewing of target molecules as part of intact brain structures. This technique has now been validated for F344/N control and HIV-1 transgenic rats of both sexes.

Un metodo di compensazione del tessuto idrofobico per il tessuto cerebrale del ratto

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...