Gli autori riconoscono Ryan Chaplin e il dottor Gregg Rentfrow della University of Kentucky Carni Lab e Dipartimento di Scienze degli Alimenti animali e per fornire opportunità di raccogliere i tessuti sperimentali utilizzati nel presente documento.

Le procedure utilizzate in questo studio non hanno richiesto l&#39;approvazione presso l&#39;Università del Kentucky Animal Care and Use Committee, perché non sono stati utilizzati animali vivi. Prima di raccolta di ogni campione utilizzato nel presente documento, tutti gli animali sono stati storditi con un proiettile captivo e dissanguato. Questo è stato condotto in una struttura federale mattatoio ispezionato presso l&#39;Università del Kentucky. Un rappresentante ufficiale della sicurezza alimentare e Inspection Servizio USDA ha osservato tutte le attività che si sono occupati con il live degli animali e la manipolazione della carcassa. 1 Preparazione di Strumentazione <ol><li> Per ridurre al minimo la quantità di tempo tra le collezioni di campioni di tessuto per l&#39;inizio di un esperimento, impostare attrezzature e preparare i buffer prima di raccogliere il tessuto sperimentale (o se sono disponibili personale supplementare, queste attività possono verificarsi simultaneamente). NOTA: Questo non solo fornisce la maggior quantità di tempo che il tessuto rimane vitale per condurre esperimenti, ma alcuniesperimenti possono funzionare per lunghi periodi di tempo (o vi è il desiderio di completare più esperimenti in un giorno), quindi di solito è opportuno iniziare il più presto possibile. </li><li> Accendere il computer associato, attrezzature acquisizioni di dati, bagnomaria (per il buffer (s)) e myograph unità (s). Posizionare l&#39;apparecchiatura di calibrazione sull&#39;unità myograph (s) e accendere il calore myograph (preimpostato a 37,5 ° C) e lasciare le unità e le apparecchiature di taratura a caldo per preimpostare le temperature. <ol><li> Aprire un file di impostazioni del software Grafico creato in precedenza sul computer e avviare una corsa (ma non l&#39;acquisizione di dati). </li></ol></li><li> Riscaldare l&#39;apparecchio per 10 min. <ol><li> Avviare l&#39;acquisizione dei dati. </li><li> Zero tutti i canali. </li><li> Vedi, e condurre calibrazione (se necessario) su ciascun canale (4 canali per multimyograph) per standardizzare il segnale elettrico fornito dal rispettivo trasduttore di forza associata a quel canale a 2 g forza fornita da un peso certificata. </li><li> Dopo la calibrazione e una conversione unità sono completate, memorizzare tutti i dati successivi come grammi. Cambia di conseguenza sulla base di desideri di ogni laboratorio separato; l&#39;apparecchiatura e il software consentono l&#39;uso di altre unità, come millinewton e volt. </li></ol></li><li> Assicurarsi che le linee del gas sono chiare di blocchi e accendere fornitura di gas (95% O 2/5% di CO 2) per myograph (s) unità. Continuamente gas tutti i buffer (nelle camere myograph) durante l&#39;intera procedura. </li><li> Riempire tutte le camere myograph con il 70% di etanolo e ammollo per 10 minuti, rimuovere l&#39;etanolo, e ripetere per un secondo 10 min ammollo. <ol><li> Dopo aver rimosso l&#39;etanolo, lavare tre volte con acqua deionizzata, seguita da tre lavaggi con tampone preparato (vedi Sezione 2 per la preparazione di buffer), lasciando la terza aggiunta di tampone nelle camere. NOTA: A questo punto l&#39;apparecchio può rimanere inattiva in questo stato fino a quando sono preparati tampone e il tessuto e il personale è pronto a procedere con le sperit. </li></ol></li></ol> 2 Preparazione del buffer <ol><li> Preparare una soluzione tampone 1 L Krebs-Henseleit per l&#39;uso nel trasporto e lavorazione di campioni di tessuto per ottenere concentrazioni finali di 11.1 mm D-glucosio; 1.2 mM MgSO4; 1,2 mm KH 2 PO 4; 4.7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3.4 mM CaCl 2; 24.9 NaHCO mm 3. <ol><li> Mescolare 9,6 g di sali Krebs in circa 900 ml di acqua deionizzata su un piatto mescolare. </li><li> Mescolare in 0,373 g di cloruro di calcio diidrato seguita da 2,1 g di bicarbonato di sodio per L di tampone desiderato. </li><li> Soluzione tampone a gas per 20 minuti con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Dopo la gasazione, aggiustare il pH a 7.05 (filtrazione di tampone aumenta il pH; obiettivo finale pH dovrebbe essere 7.4) e regolare il volume di 1 L. </li><li> Filtro sterilizzare tampone in un autoclave 1 L bottiglia e serbatoio tampone mezzi puliti a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare a parte Krebs-Hsoluzione tampone enseleit per l&#39;uso negli esperimenti myograph come descritto al punto 2.1 per il trasporto tampone Krebs-Henseleit con composti aggiuntivi che riguardano gli esperimenti contrattilità. NOTA: in genere 2 L sarà sufficiente per esperimenti descritti in questo articolo, ma questo volume potrebbe dover essere aumentato o diminuito in base alla lunghezza dell&#39;esperimento, numero di camere myograph, e sostituzioni tampone numero (relativi a integrazioni di trattamento). <ol><li> Prima della fase di gassificazione (punto 2.1.3), aggiungere 9,1 mg (per L di tampone in preparazione) di desipramina-HCl buffer. </li><li> Preparare una soluzione di propranololo-HCl 1,0 micron e aggiungere 1 ml (per L di tampone in preparazione) di questa soluzione alla soluzione tampone Krebs-Henseleit. Rendere questo buffer nel giorno di utilizzo e mantenerlo a temperature myograph operativo (una temperatura che produce una temperatura di 37,5 ° nella myograph). NOTA: La desipramina viene aggiunto per inibire i meccanismi selettivi della ricaptazione delle ammine biogenee permettere compensazione di aggiunte sperimentali dal buffer di balneazione i vasi sanguigni a verificarsi più rapidamente. L&#39;aggiunta di propranololo previene il legame di composti di trattamento di β-adrenergici recettori non specifico. </li></ol></li></ol> 3 Raccolta e preparazione dei vasi <ol><li> Non appena possibile, rimuovere il tratto gastrointestinale dalla carcassa. Una volta che l&#39;animale non presenta alcun riflesso involontario, togliere la testa e nascondere e poi sollevare la carcassa in senso verticale. La rimozione dei visceri gastrointestinale (esofago all&#39;ano) dalla carcassa dovrebbe essere completata da personale macelli riconosciuti (&lt;20 min dal momento di stordimento). NOTA: quanto tempo, è generalmente limitata dalla posizione / struttura in cui il tratto intestinale viene raccolto da e procedure operative standard o procedure mandato federale seguite da personale dell&#39;impianto. <ol><li> Nella maggior parte delle strutture, effettuare manipolazioni del tratto gastrointestinalein una posizione separata dalla trasformazione della carcassa che è destinata ad entrare nella alimentare. Utilizzare una zona comoda dove il tratto gastrointestinale può essere preso e sparsi per l&#39;esame. </li></ol></li><li> Una volta che il tratto gastrointestinale è sparso, identificare l&#39;intestino tenue, la piega ileocecale collega il piccolo intestino per cieco, e la flangia ileale estende prossimalmente alla piega ileocecale (Figura 1A). <ol><li> Usando un bisturi o un coltello, molto leggermente fare un&#39;incisione nella membrana mesenterica nel centro della flangia ileale. Utilizzando due dita indice, senza mezzi termini sezionare via il tessuto adiposo e connettivo, esponendo il sistema vascolare mesenterica (Figura 1B). </li></ol></li><li> Da questa flangia o rigonfiamento nel mesentere intestinale, sezionare i rami multipli (~ 2 cm di lunghezza) delle arteria e vena mesenterica fasci esposti che supportano questa porzione dell&#39;ileo (Figura 1C). <ol><li> Se ucantare pinze per afferrare il tessuto, fare attenzione a non afferrare o tirare direttamente sui vasi sanguigni a tutti durante la rimozione come qualsiasi tipo di stretching può danneggiare e effetto negativamente sulle prestazioni dei tessuti 14. Rimozione dei vasi sanguigni è fatto meglio, tagliando attraverso ciascuna estremità della sezione da rimuovere e poi tagliando a fianco o parallela alla sezione ora isolato. Per facilità, rimuovere alcuni del tessuto circostante con vasi di fornire alcuni tessuti di cogliere con un paio di pinze. </li><li> Con un paio di pinze, sommergere campione di tessuto in una provetta contenente ghiaccio freddo tampone Krebs-Henseleit e memorizzare in ghiaccio fino al trattamento può avvenire in laboratorio. </li></ol></li><li> Mettere campione di tessuto su una superficie di taglio o in una scatola di Petri e parzialmente immergere in ghiaccio freddo Krebs-Henseleit. <ol><li> Utilizzando # 5 gioiellerie pinze, Noyes iris forbici, e la lampada di ingrandimento o dissezione portata (da 2,5 a 5.0X ingrandimento è sufficiente), sezionare con attenzione via il connecti grasso e dintornive tessuti e separare l&#39;arteria e vena. Identificare l&#39;apertura nave ad una estremità della sezione e afferrare con cura la fascia che circonda il vaso con le pinze. </li><li> Effettuare un taglio con le forbici parallele alla nave facendo scorrere la punta della forbice sotto la fascia in rilievo. Dopo l&#39;incisione iniziale, il grasso e tessuti connettivi possono essere ulteriormente staccati dal vaso riducendo entrambi i lati con le forbici. Assicurarsi che i vasi siano il più pulito possibile, riducendo al minimo la quantità di tempo che le navi passano in panchina. </li><li> Ritorna vasi sanguigni per tubi di fresco tampone Krebs-Henseleit e conservare a 4 ° C (campioni rimangono memorizzati fino a 24 ore dopo la raccolta e ancora produrre dati contrattilità validi). </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, nave slice da utilizzare in myograph in numero desiderato di sezioni da 2 mm (è utile usare una affettatrice tessuto per ottenere sezioni coerenti). </li><li> Esaminare ogni sezione sotto una sco dissezionepe (12,5X ingrandimento) per garantire che ogni sezione ha anomalie, rami, valvole, o danni superficiali inavvertitamente fatto durante la dissezione e la pulizia. Sostituire la sezione di nave se c&#39;è qualche anomalia, ramo, valvola, o danni superficiali. </li></ol></li><li> Conservare accettabili sezioni fette di navi (sommersi in tampone Krebs-Henseleit) su ghiaccio o a 4 ° C fino al momento per il montaggio in camere myograph (di solito &lt;30 min). </li><li> Montare delicatamente il vaso sul myograph inserendo i supporti attraverso il lume e aumentare la tensione (utilizzando il micropositioner sul myograph) facendo attenzione a non allungare i vasi sopra una lettura da 2 a 3 g. </li><li> Una volta che tutte le camere sono coperte, aspirare il buffer da tutte le camere e riempire con 5,0 ml di tampone e avviare un timer di 15 minuti per iniziare il periodo di equilibrio e l&#39;esperimento. </li></ol> 4 Experiment <ol><li> Equilibrare tutte le sezioni delle navi per 1,5 ore per ottenere una res stabileting tensione di 1,0 g. <ol><li> Sostituire il tampone di incubazione Krebs-Henseleit ogni 15 min. </li><li> Durante l&#39;equilibrio, costantemente regolare la tensione sulle sezioni dei vasi sanguigni fino a 2 g e quindi consentire di rilassarsi fino a circa 0,80 g. Cercate di non consentire alle navi di rilassarsi troppo (potrebbero scivolare i supporti). Cercate di ottenere una tensione di riferimento costante, dove la nave detiene 1 g tensione senza necessità di regolazione. </li></ol></li><li> Durante l&#39;equilibrazione, preparare una soluzione acquosa 1,32 M di KCl da utilizzare come riferimento. </li><li> A seguito del completamento di una equilibrazione soddisfacente, aggiungere 500 ml di soluzione 1,32 M KCl comportare una soluzione 0,12 M in soluzione 5,5 ml balneazione nave. <ol><li> Dopo l&#39;aggiunta di 1,32 M KCl, non regolare manualmente la tensione come la risposta massima di tale aggiunta viene utilizzato per valutare la vitalità del tessuto e può essere utilizzato per normalizzare i dati di trattamento (ad esempio risposte di concentrazione di un agonist). </li><li> Sostituire il buffer in intervalli di 15 minuti fino a quando la tensione è tornato al valore basale di 1,0 g. </li></ol></li><li> Una volta raggiunto basale, modificare il buffer e contemporaneamente iniziare un 1 min timer. Fate questo per tutte le camere simultaneamente per evitare un impressionante di orari di inizio. <ol><li> Agitare la norma da aggiungere e preparare un commento per camera 1 durante il conto alla rovescia 1 min. </li><li> Aggiungere le norme in 25 aliquote microlitri di ciascuna camera come i dettami esperimento (questo mantiene il trattamento al di sotto dello 0,5% del volume totale). </li><li> Una volta aggiunto l&#39;ultimo livello, avviare un 9 min timer. </li><li> Alla fine del 9 min di incubazione standard rimuovere il tampone di trattamento contenenti dalle camere e aggiungere 5,0 ml di tampone fresco, e avviare il timer 2,5 min. </li><li> Ripetere il punto 4.4.4. </li><li> Alla fine del secondo 2,5 min risciacquo, aspirare sezioni e aggiungere tampone fresco, e avviare un 1 min timer per conto alla rovescia l&#39;inizio della secondad aggiunta standard. </li></ol></li><li> Continuare con questo ciclo per tutte le aggiunte standard della giornata. </li><li> Durante l&#39;aggiunta dello standard finale e la successiva 9 min di incubazione preparare il composto di riferimento M KCl 1,32 per un fine dose aggiunta di riferimento run di 500 microlitri. </li><li> Dopo l&#39;intervallo di 1 min dopo l&#39;aggiunta del trattamento finale, aggiungere il KCl e avviare un 9 min timer. NOTA: L&#39;aggiunta KCl è quello di confermare la vitalità del tessuto a conclusione dell&#39;esperimento ed è utile se la somministrazione di un trattamento che si traduce in risposta trascurabile. </li><li> Al termine della finale 9 min composto di riferimento di incubazione, aspirare o rimuovere il tampone da tutte le camere. Non aggiungere tampone fresco. Concludere l&#39;esperimento. </li><li> Salvare il file grafico, rimuovere le sezioni dei vasi sanguigni e smaltire correttamente e seguire il protocollo pulizia (fornito dal costruttore e possono essere specifiche di laboratorio) per le apparecchiature myograph. </li></ol>

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Menzione del nome commerciale, prodotto proprietario, o equipaggiamenti specificati non costituisce una garanzia o garanzia da parte del USDA e non comporta l&#39;approvazione ad esclusione di altri prodotti che possono essere disponibili.

La sfida iniziale per lo sviluppo di questo saggio biologico è stato la creazione di un centro di raccolta ripetibile per vascolarizzazione mesenterica. Consistenza sito campione è critica, in quanto alcune delle funzioni del piccolo intestino cambiamento durante la progressione del digiuno attraverso l&#39;ileo e conseguentemente il mesentere variano in un modello simile. I rami ileali di mesenterica e vena sono stati i più facilmente identificabili attraverso punti di riferimento anatomici. Collocando il cieco e se...

Le alterazioni del flusso sanguigno in un letto di tessuto può avere un grande impatto sulla funzione d&#39;organo. Una funzione primaria del piccolo intestino è l&#39;assorbimento dei nutrienti. Arteriosa flusso di sangue verso la superficie di assorbimento dell&#39;intestino è necessario per l&#39;assorbimento dei nutrienti e aumenta il flusso sanguigno per aiutare l&#39;assorbimento dei nutrienti come Digesto si muove lungo la superficie 1. Una diminuzione del flusso sanguigno può causare una riduzione dell&#39;assorbimento dei nutrienti a causa di una diminuzione del gradiente transepiteliale 2. Oltre ai nutrienti, il piccolo intestino può essere esposto a metaboliti secondari, farmaci o tossine che esercitano un effetto sul flusso sanguigno localizzato nel mesentere. Nel caso di animali ruminanti, composti possono essere liberati da un mangime (ad esempio, sostanze nutritive, quali aminoacidi, o tossine come ad esempio alcaloidi della segale cornuta) attraverso processi fermentativi del foregut. Se questi composti sopravvivono il metabolismo microbico di fermentazione ruminale, sono ora disponibili per l&#39;assorbimentoo interazione mentre viaggiano attraverso il tratto gastrointestinale dell&#39;animale. Ci sono un certo numero di metodi diversi a disposizione per misurare il flusso di sangue in vivo (ad esempio, Doppler, insito flussometri sangue, microsfere radioattivi, e le tecniche di indicatore-diluizione) che permettono la valutazione dei vari scenari sperimentali o trattamenti. Tuttavia, per ottenere informazioni riguardanti le proprietà meccaniche o farmacologiche di muscolatura liscia vascolare, i metodi sono rimasti limitati alle imbarcazioni più grandi fino Mulvany e Halpern 3 ha pubblicato un articolo che descrive una tecnica con filo montato preparati anello vascolare in un miografo. Poiché lo sviluppo di questa tecnica, modifiche continuano ad essere apportata ai sistemi miografo associate che permettono una varietà di applicazioni differenti per la valutazione di strutture tubolari. Il sistema è stato anche adattato per utilizzare barre fissi per il montaggio di navi più grandi 4 dove perfusionetecniche non sono desiderati. A causa delle differenze nei vasi di diverse origini anatomiche e distinzioni nelle stesse navi di diverse specie di animali, i dati da nave e tipo di animale non può essere facilmente estrapolati in diversi recipienti o sulla stessa nave in diversi tipi di animali 5. Di conseguenza, test biologici separati devono essere sviluppati e convalidati in qualsiasi momento questi aspetti sono cambiati. Recentemente diversi test biologici sono stati sviluppati con queste tecnologie per l&#39;uso in bovini laterali vena safena e destra arteria e vena ruminale 6,7. Questo saggio biologico è stato sviluppato specificamente per indagare gli effetti che alcaloidi dell&#39;ergot hanno sul sistema vascolare sostegno tenue. E &#39;stato riferito che il 50-60% di alcaloidi alimentati appaiono in contenuti abomasali, ma solo il 5% viene recuperato nelle feci 8. Strickland et al. 9 ha dichiarato in una recensione di alcaloidi della segale cornuta, che i dati Sugg disponibiliest che l&#39;intestino tenue può essere il sito più importante per l&#39;assorbimento ergopeptine. Eckert et al. 10 aspetti biofarmaceutici recensione di alcaloidi della segale cornuta e ha dichiarato che una volta che attraversano la barriera epiteliale, alcaloidi della segale cornuta sono trasportati dal sistema linfatico alla vena succlavia o via vena mesenterica e in sangue portale. Rhodes et al. 11 ha registrato una diminuzione del flusso di sangue al duodeno e colon in manzi che consumano un (alto alcaloide della segale cornuta) dieta ad alto endophyte-infettati. Utilizzando il diritto ruminale arteria e vena biotest, Foote et al. 12 hanno dimostrato che gli alcaloidi dell&#39;ergot sono vasoattivi in vasi ruminale. Foote et al. 13 successivamente dimostrato in vivo che l&#39;esposizione agli alcaloidi dell&#39;ergot ruminale risultati in una diminuzione del rumine flusso di sangue epiteliale. Questa diminuzione del flusso di sangue alla superficie di assorbimento del rumine contemporaneamente ha provocato una riduzione dei nutrienti (acidi grassi volatili) flusso. Data la quantity di alcaloidi della segale cornuta che passano al piccolo intestino dal foregut; è stato ipotizzato che un effetto simile sulla piccola vascolare intestinale e l&#39;assorbimento dei nutrienti si sarebbe verificato. Ciò ha richiesto lo sviluppo dei bovini prossimale dell&#39;ileo mesenterica arteria e vena biotest.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="611">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:120px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:259px;">Comment/Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Multi Myograph</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">610M</td>
			<td style="width:259px;">A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">Powerlab 8/sp</td>
			<td style="width:127px;">ADIntruments</td>
			<td style="width:120px;">ML785</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">LabChart 7</td>
			<td style="width:127px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:120px;">Version 7</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Force Calibration Kit</td>
			<td style="width:127px;">Danish Myo Technologies</td>
			<td style="width:120px;">100055</td>
			<td style="width:259px;">Specific to DMT myographs</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Bottle-top Filter</td>
			<td style="width:127px;">Nalgene</td>
			<td style="width:120px;">595-4520</td>
			<td style="width:259px;">0.22 um pore size; 45 mm neck size</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">#5 Jewler&#8217;s Forceps</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">555008FT</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of forceps can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Noyes Iris Scissors</td>
			<td style="width:127px;">Miltex</td>
			<td style="width:120px;">18-1510</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of scissors can be used</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Dissecting Scope</td>
			<td style="width:127px;">Zeiss</td>
			<td style="width:120px;">Stemi 2000-C</td>
			<td style="width:259px;">Any brand of dissecting light microscope will suffice</td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:105px;">Adjustable Tissue Matrice</td>
			<td style="width:127px;">Braintree Scientific</td>
			<td style="width:120px;">TM C12</td>
			<td style="width:259px;">This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Krebs-Hensleit Buffer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">K3753-10x1L</td>
			<td style="width:259px;">It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:105px;">Calcium chloride dehydrate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">C7902-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Sodium bicarbonate</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">S5761-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Desipramine-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">D3900-5G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:105px;">Propranolol-HCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P0884-1G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:105px;">KCl</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:120px;">P9333-500G</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:105px;">95% O2/5% CO2</td>
			<td style="width:127px;">Scott Gross</td>
			<td style="width:120px;">UN3156</td>
			<td style="width:259px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Sistemi gastrointestinale dei mammiferi sono costantemente esposti a composti (desiderabili e indesiderabili) che possono avere un effetto sul flusso di sangue da e verso quel sistema. Le variazioni di flusso di sangue al piccolo intestino può provocare effetti sulle funzioni di assorbimento dell&#39;organo. Particolare interesse per le tossine liberate dai mangimi attraverso processi fermentativi e digestivi si è sviluppata nei ruminanti come un settore in cui le efficienze produttive potrebbero essere migliorati. Il video associato a questo articolo viene descritto un test biologico in vitro sviluppati per i composti dello schermo per vasoactivity in isolate sezioni di bovini mesenterica arteria e vena con un multimyograph. Una volta che i vasi sanguigni sono montati ed equilibrati nel myograph, il saggio biologico in sé può essere utilizzata: come strumento di screening per valutare la risposta contrattile o vasoactivity di composti di interesse; determinare la presenza di tipi di recettori da parte farmacologicamente mira recettori con agonisti specificis; determinare il ruolo di un recettore con la presenza di uno o più antagonisti; o determinare potenziali interazioni di composti di interesse con antagonisti. Attraverso tutto questo, i dati vengono raccolti in tempo reale, il tessuto prelevato da un singolo animale può essere esposto a un gran numero di diversi trattamenti sperimentali (un vantaggio in vitro), e rappresenta vascolare su entrambi i lati del letto capillare per fornire un accurato immagine di ciò che potrebbe accadere nel afferenti ed efferenti apporto di sangue sostenere il piccolo intestino.

I vasi sanguigni utilizzati per generare i risultati inclusi sono stati raccolti da 6 manzi Holstein (425 ± 8 kg) all&#39;interno di un intervallo di 3 settimane. Un esempio di una tipica mesenterica risposta contrattile vena di KCl e aggiunte di trattamento in aumento in concentrazione è presentato in Figura 2. L&#39;entità della risposta varierà alcuni con le dimensioni del vaso (correlata alla dimensione dell&#39;animale donatore), ma può anche essere influenzato (negativamente) da un uso improp...

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

L&#39;intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l&#39;assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity.

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

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Medicine

9.6K Views.  USDA-Agricultural Research Service.  L'intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l'assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity. 

Video: Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, the de novo mutation rate in humans is relatively high, so new mutations are generated at a high frequency in the population. However, de novo mutations have not been reported in most common diseases. Mutations in genes leading to severe diseases where there is a strong negative selection against the phenotype, such as lethality in embryonic stages or reduced reproductive fitness, will not be transmitted to multiple family members, and therefore will not be detected by linkage gene mapping or association studies. The observation of very high concordance in monozygotic twins and very low concordance in dizygotic twins also strongly supports the hypothesis that a significant fraction of cases may result from new mutations. Such is the case for diseases such as autism and schizophrenia. Second, despite reduced reproductive fitness1 and extremely variable environmental factors, the incidence of some diseases is maintained worldwide at a relatively high and constant rate. This is the case for autism and schizophrenia, with an incidence of approximately 1% worldwide. Mutational load can be thought of as a balance between selection for or against a deleterious mutation and its production by de novo mutation. Lower rates of reproduction constitute a negative selection factor that should reduce the number of mutant alleles in the population, ultimately leading to decreased disease prevalence. These selective pressures tend to be of different intensity in different environments. Nonetheless, these severe mental disorders have been maintained at a constant relatively high prevalence in the worldwide population across a wide range of cultures and countries despite a strong negative selection against them2. This is not what one would predict in diseases with reduced reproductive fitness, unless there was a high new mutation rate. Finally, the effects of paternal age: there is a significantly increased risk of the disease with increasing paternal age, which could result from the age related increase in paternal de novo mutations. This is the case for autism and schizophrenia3. The male-to-female ratio of mutation rate is estimated at about 4&#x2013;6:1, presumably due to a higher number of germ-cell divisions with age in males. Therefore, one would predict that de novo mutations would more frequently come from males, particularly older males4. A high rate of new mutations may in part explain why genetic studies have so far failed to identify many genes predisposing to complexes diseases genes, such as autism and schizophrenia, and why diseases have been identified for a mere 3% of genes in the human genome. Identification for de novo mutations as a cause of a disease requires a targeted molecular approach, which includes studying parents and affected subjects. The process for determining if the genetic basis of a disease may result in part from de novo mutations and the molecular approach to establish this link will be illustrated, using autism and schizophrenia as examples.

Molecular genetic strategy for finding de novo mutations causing common disorders such as autism and schizophrenia.

Una strategia per identificare le mutazioni de novo nei disturbi comuni come autismo e schizofrenia

There are several lines of evidence supporting the role of de novo mutations as a mechanism for common disorders, such as autism and schizophrenia. First, ...

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Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

Adult Mouse Venous Hypertension Model: Common Carotid Artery to External Jugular Vein Anastomosis.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model creating an artificial fistula between the common carotid artery (CCA) and the external jugular vein (EJV) has been widely described and proved technically feasible. This construct provokes a consistent cerebral venous hypertension (CVH), and therefore has helped studying the contribution of venous hypertension to formation, clinical symptoms, and prognosis of brain AVMs and dural AVFs. Equivalent mice models have been only scarcely described and have shown trouble with stenosis of the fistula. An established murine model would allow the study of not only pathophysiology but also potential genetic therapies for these cerebrovascular diseases.
We present a model of arteriovenous fistula that produces a durable intracranial venous hypertension in the mouse. Microsurgical anastomosis of the murine CCA and EJV can be difficult due to diminutive anatomy and frequently result in a non-patent fistula. In this step-by-step protocol we address all the important challenges encountered during this procedure. Avoiding excessive retraction of the vein during the exposure, using 11-0 sutures instead of 10-0, and making a carefully planned end-to-side anastomosis are some of the critical steps. Although this method requires advanced microsurgical skills and a longer learning curve that the equivalent in the rat, it can be consistently developed.
This novel model has been designed to integrate transgenic mouse techniques with a previously well-established experimental system that has proved useful to study brain AVMs and dural AVFs. By opening the possibility of using transgenic mice, a broader spectrum of valid models can be achieved and genetic treatments can also be tested. The experimental construct could also be further adapted to the study of other cerebrovascular diseases related with venous hypertension such as migraine, transient global amnesia, transient monocular blindness, etc.

We describe a method for creating a reliable model of cerebral venous hypertension in the adult mouse. This model has been widely described and tested in the rat. This new counterpart in the mice opens the possibility of using genetic modified animals and thereby broadens the applications of the model.

Topo adulto venosa Ipertensione Modello: carotide comune di External Vena giugulare anastomosi.

The understanding of the pathophysiology of brain arteriovenous malformations and arteriovenous fistulas has improved thanks to animal models. A rat model ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Catheterization of the Carotid Artery and Jugular Vein to Perform Hemodynamic Measures, Infusions and Blood Sampling in a Conscious Rat Model

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. Intra-tracheal inoculation of a known amount of bacteria has been successfully used to reproduce the pathogenesis of pneumonia which then develops into sepsis. Monitoring hemodynamic parameters and providing standard clinical treatment including infusion of antibiotics, fluids and drugs to maintain blood pressure is critical to simulate routine supportive care in this model but to do so requires both arterial and venous vascular access. The video details the surgical technique for implanting carotid artery and common jugular vein catheters in an anesthetized rat. Following a 72 hr recovery period, the animals will be re-anesthetized and connected to a tether and swivel setup attached to the rodent housing which connects the implanted catheters to the hemodynamic monitoring system. This setup allows free movement of the rat during the study while continuously monitoring pressures, infusing fluids and drugs (antibiotics, vasopressors) and performing blood sampling.

Vascular accesses to measure hemodynamics, provide fluids and perform blood sampling are important to any small animal model study. We present a technique for implanting catheters into the carotid artery and the common jugular vein in an anesthetized rat for connecting to a system to perform monitoring, infusions and sampling.

Cateterismo dell&#39;arteria carotide e giugulare Vena di eseguire misure emodinamiche, Infusi e campionamento del sangue in un modello di ratto cosciente

The success of a small animal model to study critical illness is, in part, dependent on the ability of the model to simulate the human condition. ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusi carotide di farmacocinetica e di farmacodinamica Analisi dei taxani nei topi

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe the use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations of superior and uniform quality to that which can be achieved by hand. The device comprises a base that holds 4 stainless steel rods and a top, which acts a cutting guide. The rods are inserted into the lumen of the small intestine [divided into thirds] and the colon. The rods and samples are then placed over a piece of filter paper or card into the holding slots in the base of the device. The top of the device is then positioned and serves as a cutting guide. The two angled sections in the center of the top piece are used to guide a knife or scalpel and cut the intestines longitudinally on the top of the rods. Once the intestinal sections have been cut, the top is removed and the card,&#160;tissue and rods gently removed from the device and placed on the bench. The rods are then gently rolled sideways to flatten and stick the intestinal segments onto the underlying piece of filter paper or card. The final preparation can then be examined or fixed and stored for later analysis. The preparations are invaluable for the study of intestinal changes in normal or genetically modified mouse models. The preparations have been used for the study and quantification of the effects of inflammation (colitis), damage, pre-cancerous lesions (aberrant crypt foci (ACFs) and mucin depleted foci (MDFs)) and polyps or tumors.

The use of a simple device to cut and &#8216;roll&#8217; mouse intestines to rapidly prepare whole mount preparations is described.

Un dispositivo semplice da preparare rapidamente intere Monti della Intestino mouse

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Meccanismi di secrezione dell'ormone intestinale utilizzando l'isolato irrorati intestino tenue del ratto

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a promising therapeutic target in many disorders, such as autoimmune diseases, atherosclerosis, and cancer. RNAi-mediated gene silencing is a valuable approach of choice to probe and manipulate macrophage function; however, the transfection of macrophages with siRNA is often considered to be technically challenging, and, at present, few methodologies dedicated to the siRNA transfer to macrophages are available. Here, we present a protocol of using polyethyleneimine-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles (PEI-SPIONs) as a vehicle for the targeted delivery of siRNA to macrophages. PEI-SPIONs are capable of binding and completely condensing siRNA when the Fe:siRNA weight ratio reaches 4 and above. In vitro, these nanoparticles can efficiently deliver siRNA into primary macrophages, as well as into the macrophage-like RAW 264.7 cell line, without compromising cell viability at the optimal dose for transfection, and, ultimately, they induce siRNA-mediated target gene silencing. Apart from being used for in vitro siRNA transfection, PEI-SPIONs are also a promising tool for delivering siRNA to macrophages in vivo. In view of its combined features of magnetic property and gene-silencing ability, systemically administered PEI-SPION/siRNA particles are expected not only to modulate macrophage function but also to enable macrophages to be imaged and tracked. In essence, PEI-SPIONs represent a simple, safe, and effective nonviral platform for siRNA delivery to macrophages both in vitro and in vivo.

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

We describe a method of using polyethyleneimine (PEI)-coated superparamagnetic iron oxide nanoparticles for transfecting macrophages with siRNA. These nanoparticles can efficiently deliver siRNA to macrophages in vitro and in vivo and silence target gene expression.

Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...