Questo protocollo può essere utilizzato per produrre filmati time-lapse di Pseudomonas aeruginosa brulicante e per catturare la repulsione dello sciame da batteriofago o antibiotici. I film time-lapse catturano la dinamica dettagliata della risposta brulicante agli antibiotici e ai batteriofagi e la tecnica richiede solo un deumidificatore, un computer, un incubatore e uno scanner di documenti. Per preparare piastre di agar brulicanti per l'imaging time-lapse di P.aeruginosa, utilizzare una pipetta da 25 millilitri per aggiungere 20 millilitri di soluzione di agar brulicante a ogni piastra di Petri sperimentale di 10 centimetri di diametro.
Posizionare le piastre in un'unica pila con coperchi per un'ora a temperatura ambiente. Accendere un deumidificatore per ridurre l'umidità relativa della stanza al 40-50%Quando l'agar si è solidificato, asciugare le piastre di agar brulicanti per altri 30 minuti in un cappuccio di flusso laminare con i coperchi spenti e affrontare a 300 piedi cubi al minuto con un'umidità relativa del 40-50% a temperatura ambiente. Quindi conservare le piastre di agar brulicanti essiccate a quattro gradi Celsius per un massimo di 24 ore.
Per sciamare la placcatura dell'agar, tenere una punta di pipetta P20 caricata con cinque microlitri da una coltura di P.aeruginosa durante la notte con un angolo di 10-45 gradi di 2-1/2 centimetri sopra il centro di una piastra brulicante e deprimere lo stantuffo alla prima fermata di toccare l'agar con solo la goccia liquida. Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente attraverso le diverse piastre di agar brulicanti. Per placcare un'infezione da fago, mescolare prima 30 microlitri di P.aeruginosa coltivata durante la notte con sei microlitri di uno per 10 alle 12 unità di formatura della placca per millilitro di fago DMS3 vir e aggiungere immediatamente sei microlitri della miscela di fago P.aeruginosa in sei posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico di raggio di 2,8 centimetri come dimostrato.
Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente su diverse piastre di agar brulicanti. Per placcare i trattamenti antibiotici, mescolare 30 microlitri di P.aeruginosa coltivata durante la notte con l'appropriata concentrazione e volume dell'antibiotico di interesse e aggiungere immediatamente sei microlitri dei batteri trattati con antibiotici in sei posizioni satellitari equidistanti su un cerchio concentrico del raggio di 2,8 centimetri attorno al centro del piatto. Utilizzare un modello per posizionare il punto in modo coerente attraverso le diverse piastre di agar brulicanti.
Quando tutte le colture sono state placcate, sostituire i coperchi chiari della piastra di Petri con coperchi neri su misura. Posizionare con cura le piastre di agar brulicanti su uno scanner in un incubatore impostato a 37 gradi Celsius con un bagno d'acqua da 10 litri per mantenere l'umidità al 75%Dopo aver posizionato le piastre nello scanner, aprire il file e salvare le impostazioni per impostare il percorso di salvataggio per le immagini e fare clic su scansione e OK a intervalli di 30 minuti. Per automatizzare l'acquisizione delle immagini, utilizzare il software di scripting.
Selezionare sia la scansione inattiva che la scansione singola e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scansione inattiva, quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse su abilitato. Alla fine dell'incubazione, importare tutte le immagini digitalizzate in ImageJ. Nella finestra delle opzioni di sequenza, il numero di immagini indicherà il numero di immagini selezionate.
Continua a iniziare l'immagine da una per iniziare dalla prima immagine nella cartella e ridimensiona le immagini al 100% per conservare le dimensioni originali delle immagini. Fare clic su Disartito su RGB per mantenere le immagini a colori. Lasciare l'opzione Usa stack virtuale deselezionata e fare clic su OK per caricare le immagini.
Fare clic su file, salva con nome e AVI per unire le immagini in un file AVI. Regola la compressione su JPEG e la frequenza fotogrammi a cinque fotogrammi al secondo. Quindi salvare il time-lapse AVI nella cartella di archiviazione appropriata.
L'imaging time-lapse di una singola colonia di P.aeruginosa di tipo selvatico da una piastra di agar LB in brodo LB durante la notte a 37 gradi Celsius e avvistata al centro di una piastra di agar brulicante rivela una crescita iniziale sotto forma di una colonia al centro della piastra che si diffonde nei viticci radialmente dalla colonia. Gli sciami si spostano dal centro delle placche di agar brulicanti alla periferia e vengono respinti da un segnale di stress emesso dai batteri infettati da fagi o trattati con Gentamicina. Fagi o Gentamicina avvistati da soli nelle posizioni satellitari non fanno sì che popolazioni brulicanti evitino queste aree.
Utilizzare una pipetta da 25 millilitri per assicurarsi che le piastre di agar brulicanti contengano esattamente 20 millilitri. È anche importante regolare il tempo di asciugatura della piastra in base all'ambiente di laboratorio. La nostra tecnica ci consente di visualizzare i modelli complessivi di sciame delle popolazioni di Pseudomonas aeruginosa.
Il prossimo obiettivo è monitorare la motilità delle singole cellule usando la microscopia Brightfield.
