Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Cuore e Polmone Istituto Nazionale (R01 HL086582) e la Stem Cell Science Fund di New York (NYSTEM, Contract # &#160; C024316) per STA e DDS illustrazioni utilizzate in video JoVE sono state completate da John Nyquist; Medical Illustrator dalla State University di New York a Buffalo.

NOTA: Questo protocollo è stato approvato dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato presso la State University di New York a Buffalo. Preparazione 1. Pre-chirurgica <ol><li> Utilizzare pecore (Dorset croce, femmina, circa 1-3 anni con un peso di 40-60 kg) per il seguente studio. Somministrare ciclosporina A (200 mg / die), aspirina (975 mg / die), e coumadin (20-30 mg / die) per via orale, iniziando 3 giorni prima chirurgia e continua per tutta la durata di tutti gli studi. </li><li> Assicurarsi che la pecora ha digiunato 12 ore prima dell&#39;intervento chirurgico (alimentazione normale = 1,8 kg e 0,4 kg di fieno grano). </li><li> Sterilizzare tutte le forniture chirurgiche in autoclave a vapore a 121 ° C e 15 psi per 30 min. </li><li> Posizionare le seguenti voci di un paraformaldeide essiccatore 48 ore prima dell&#39;intervento chirurgico: 4 mm sonde flusso Doppler, 1 millimetro cristalli ultrasuoni, cateteri arteriosi, tubi di estensione, e 42 &quot;Tygon Tubing. NOTA: Una tabella di attrezzature mediche, necessarie perchirurgia e per la sterilizzazione sono elencati nella Tabella 1. Pre-posizionamento della strumentazione nel tubo Tygon in questo passaggio aiuterà risparmiare tempo durante l&#39;intervento chirurgico. <ol><li> Etichettare ogni estremità delle sonde, cateteri e cristalli come destra e sinistra, se applicabile. </li></ol></li></ol> 2. Operazione Chirurgica <ol><li> Indurre pecore per anestesia con diazepam (0,5 mg / kg) e ketamina (4 mg / kg) per via endovenosa (IV). In alternativa, utilizzare Telazol (4 mg / kg) IV. <ol><li> Eseguire intubazione oro-tracheale con diametro 8,5-10,0 mm interno ammanettato endotracheale tubo 7. </li><li> Somministrare anestesia inalatoria attraverso un circuito rirespirazione con un ventilatore marea di volume (7-10 ml / kg) o di un ventilatore regolata pressione (15-20 cm H 2 O). Utilizzare un vaporizzatore di precisione per amministrare isoflurano o sevoflurano ad una quantità adeguata (3% -4% inizialmente) per raggiungere un mezzo di profonda fase anestetico chirurgico. La concentrazione alveolare minima perpecora è di 1,4% o 1,9%, rispettivamente, 8. </li><li> Valutare profondità dell&#39;anestesia osservando risposta motoria agli stimoli, riflesso palpebrale, posizione degli occhi, e la frequenza cardiaca. Monitorare la saturazione di ossigeno nel sangue (95% -100%) con pulsossimetria, CO 2 concentrazione (45-55 mmHg) in gas espiratorio utilizzando capnografia e mantenere la temperatura corporea durante la procedura (38,5-39,5 ° C) con un auto regolata riscaldamento coperta. </li></ol></li><li> Shave lana tutto il collo della pecora, e più di un vena cefalica, con una lama # 40 su Clippers standard. Preparare la pelle di entrambi i siti per la chirurgia con il 70% di alcool isopropilico e il 7,5% betadine scrub garza saturi. Inizia con l&#39;alcol garza per facilitare la rimozione di oli per la pelle. Si alternano tra betadine garza e alcol garza tre volte. </li><li> Posizionare pecore sul tavolo operatorio in decubito dorsale sulla cima di una coperta riscaldamento. Passare un tubo orogastrico di medie dimensioni per consentire l&#39;espulsione passiva del contenuto dello stomaco. Estendere lacollo di pecora e utilizzare ammortizzazione di supporto secondo necessità per mantenere il posizionamento. <ol><li> Eseguire uno scrub asettica finale con il 7,5% betadine garza imbevuta e lasciar riposare per 5 minuti prima di un intervento chirurgico. </li></ol></li><li> Somministrare fluidi IV (Ringer lattato o 0,9% Saline) a 10 ml / kg / ora attraverso un catetere venoso posizionato nella vena cefalica. Somministrare antibiotici intraoperatorie e analgesia: la penicillina G procaina 6.600 U / kg per via intramuscolare (IM), gentamicina 1,6 mg / kg IM, e buprenorfina 0,005-0,01 mg IV o IM. </li><li> Fare un cm un&#39;incisione ~ 12 longitudinalmente sul collo linea mediana ventrale con cauterizzazione electro. Isolare sinistra e destra carotide arterie (~ 6 cm), rimuovendo il tessuto connettivo con una tecnica dissezione smussa. Legare e cauterizzare microvasi diramano dalle arterie carotidi per ridurre al minimo il sanguinamento. </li><li> Mantenere la sterilità utilizzando (un non-sterile) infermiera chirurgica per assistere con scavare tutto il cablaggio e tubazioni (sonda di mandata, fili di cristallo ad ultrasuonie il tubo del catetere) nello strato sottocutaneo della pelle. Utilizzare un trocar smussata, che esce attraverso l&#39;incisione chirurgica preparata al collo dorsolaterale. <ol><li> Reach sotto il telo sterile e girare la testa della pecora modo che il lato del collo può essere visualizzata sotto il telo. </li><li> Utilizzare un emostatico curvato da 8 cm a tunnel attraverso lo spazio sottocutaneo tra la linea mediana ventrale incisione del collo e il lato del collo. Aprire e chiudere il emostatico di sezionare senza mezzi termini uno spazio per i tubi ~ 1,5 centimetri di larghezza. Le punte della pinza emostatica dovrebbero risiedere a metà strada tra la testa e le spalle, circa 10 cm caudale verso destra o di sinistra. Girare il hemostat modo che le punte siano rivolte verso la pelle superficiale. </li><li> Reach sotto il telo sterile e fare un 1,5 centimetri incisione attraverso la pelle, sulle punte del emostato con una sterile # 11 lama. Visualizza le punte della pinza emostatica per confermare una chiara uscita attraverso la pelle. </li><li> Passare il tubo Tygon contenente unll cablaggio e il tubo attraverso il tunnel sottocutaneo. Tenere i cavi e tubi sopra il telo sterile. </li><li> Reach sotto il telo per rimuovere il tubo esterno Tygon dal collo, esponendo il cablaggio impiantato quando lascia il collo della pecora. Estrarre singole linee fuori per minimizzare il gioco nello spazio sottocutaneo. Lasciare una distanza sufficiente per fissare correttamente la strumentazione per l&#39;arteria. </li></ol></li><li> Inserire 4 millimetri sonde flusso Doppler su entrambe le arterie carotidi e ottenere una lettura iniziale (Figura 1). Somministrare 100 U / kg di eparina IV 30 min prima bloccaggio dell&#39;arteria. </li><li> Continuare somministrazione di eparina a 100 U / kg / ora fino alla fine dell&#39;intervento. Bloccare la carotide utilizzando non schiacciamento morsetti vascolari e asportare una porzione (circa 4 cm di lunghezza). La portata carotideo controlaterale aumenterà del 50% -100% per mantenere il flusso di sangue al cervello. NOTA: È possibile limitare tratto longitudinale rinculo del vaso nativo rimuovendosegmenti più brevi rispetto sostituiti e / o stiramento dell&#39;arteria nativa con vascolare morsetti per accorciare gap fino procedura anastomotica completo è completato. Questo aiuterà limitare la tensione sui singoli suture holding e l&#39;innesto impiantato. </li><li> Suturare la TEV in luogo utilizzando semplici punti interrotti con 7-0 prolina ethalloy doppia armato monofilamento sutura. Se necessario, applicare miorilassanti lisce vascolari quali papaverina (15 mg / ml) o nicardipina (1,25 mg / ml) per via topica alla vascolarizzazione nativa per evitare vasocostrizione che ostacolerebbe sutura anastomotica. NOTA: Iniziare suture con circa 1 mm di distanza. Questo può variare notevolmente da caso a caso. La composizione e lo spessore TEV influenzerà la distanza effettiva tra suture. Poiché lo spessore del tessuto nativo o TEV diminuisce, può essere necessario collocare le suture più vicini. <ol><li> Prima di ancoraggio quattro punti del TEV alla arteria nativa mettendo due s oppostetitches su entrambe estremità prossimale e distale (Figura 2 -Di). Tenere ogni ancoraggio insegnato usando emostatiche. NOTA: descrizioni prossimale e distale si riferiscono alla direzione del flusso di sangue attraverso il foglio. </li><li> Aggiungere 5-6 più suture sul lato superficiale sia l&#39;estremità prossimale e distale per iniziare l&#39;anastomosi. (Figura 2 -Pr). Contemporaneamente ruotare vascolare morsetti 180 gradi. </li><li> Ristabilire tensione sulle suture di ancoraggio. Aggiungi supplementare (5-6) interrotto suture di estremità prossimale e distale sul lato ruotato del TEV. </li></ol></li><li> Una volta che il TEV viene suturata saldamente in posizione, ruotarlo indietro alla posizione iniziale e rimuovere vascolare morsetti uno alla volta, morsetto distale. Lieve sanguinamento nei siti anastomosi è comune. Questo può naturalmente risolvere dopo alcuni minuti di rilascio morsetto e reclamping o richiedere il posizionamento di suture supplementari. Posizionare la sonda Doppler (Figura 3-FL) Sul nativa dell&#39;arteria prossimale al flusso di sangue che entra nel TEV e portata monitor. NOTA: Aspettatevi le portate della carotide sinistra e destra per equilibrare dopo circa 15 min. Se la portata sulla carotide con impiantato TEV costante gocce, è possibile che il TEV è coagulazione. Altre anomalie possibili per quanto riguarda il flusso possono essere attribuiti alla costrizione della prossimale arterie nativo o distale al TEV. In questo caso, l&#39;uso di ulteriori rilassante della muscolatura liscia vascolare può essere applicato, e il vaso nativo deve ritornare ad un tono basale dopo 30-60 min a seguito della chiusura del tessuto sul sito dell&#39;innesto. <ol><li> Se lo si desidera, asportare la carotide controlaterale e suturare nuovamente in sede come controllo &quot;Sham&quot;. Questo è più clinicamente rilevante che lasciare la carotide destra solo e soltanto di collegare la sonda flusso, cristalli ultrasonici, e il catetere. Se un controllo sham è voluto, fare questo prima di passare al punto 2.11. </li></ol></li><li> Suturare 1 millimetro cristalli ultrasuoni (Figura 3 -cr1 CR2) a lati opposti del TEV con 7-0 Proline. Filo di sutura attraverso la testa cristallo ultrasuoni e cucite solo allo strato superficiale del TEV. </li><li> Cateterizzare l&#39;arteria con una versione modificata 18 G catetere con una abbottonatura Teflon tessuto (Figura 3- Ca &amp; Figure 4A). Posizionare il distale del catetere per il TEV in tessuto arterioso nativo. <ol><li> Suturare la abbottonatura alla parete arteriosa con 5/0 Ethibond per controllare qualsiasi emorragia. Utilizzare cicloesanone aderire il tubo microbore al catetere che è stata lavata con soluzione salina. Utilizzare il tubo come una linea di estensione. </li><li> Utilizzare un G Luer stub adattatore 20 con una spina iniezione Surflo per sigillare l&#39;estremità del tubo esteriorizzato (Figura 4B). Per mantenere la pervietà del catetere, ottenere il volume di adescamento della linea e lavare con 10 ml di soluzione salina e poi 5.000 U / ml di eparina sodica iniettabile ogni 2-3 giorni. </li></ol></li><li> Registrare la distanza tra la sonda di flusso ei cristalli ultrasonici, così come la distanza tra la sonda di flusso e il catetere. Questa velocità dell&#39;onda di polso permetterà di calcolare in combinazione con il software. Se non sono necessari calcoli, non impiantare un catetere. </li><li> Ottenere una lettura intraoperatoria se lo si desidera per garantire tutto l&#39;hardware è impiantato funzionale (vedi sezione 3). </li><li> Fissare le linee impiantati e fili alla vicina muscolatura con 2/0 seta e un ago cono (Figura 3). <ol><li> Posizionare la sonda di flusso vascolare filo parallelamente alla nave, con la caudale sonda e il filo che si estende cranialmente, e poi fare una &quot;U-Turn&quot; verso la muscolatura laterale. Fissare il filo muscolatura adiacente, utilizzando 2-0 seta su un ago conico a due posizioni, in modo che la sonda filo o flusso non è in grado di provocare sollecitazioni sulla nave. Assicurarsi suture sono aderente ma non stringere troppo e strangulate musculature (Figura 3). </li><li> Suturare la linea di fili di cristallo e arteriosa catetere alla muscolatura laterale, consentendo ~ 1,5 cm slack, simile a passaggi precedenti per il fissaggio della sonda di flusso (Figura 3). </li><li> Gruppo tutti i cavi e le linee insieme e ancorare al muscolatura poco prima di uscire fuori attraverso tunnel sottocutaneo, simile a fasi precedenti. </li></ol></li><li> Chiudere il sito chirurgico con un Vicryl sutura 2-0 in livelli utilizzando un modello di sutura in esecuzione su plancia e sottocutaneo, in esecuzione materasso punto sulla pelle (plancia, ago non tagliare, la pelle, il taglio ago). Chiudere l&#39;1,5 centimetri un&#39;incisione al collo dorsale attorno i fili esteriorizzato e le linee con 2/0 Vicryl e un ago di taglio. </li><li> Inserire fili sonda flusso, linee, cateteri e fili di cristallo ultrasuoni in un sacchetto (10 cm x 10 cm) che viene suturata saldamente alla pelle della pecora (Figura 5 - dopo il recupero). </li><li> Gradualmente svezzare anestesia pecore offe il volume del ventilatore di marea quindi estubare le pecore quando respiro spontaneo è ripreso. Rimuovere il catetere venoso inserito nella vena cefalica e benda, se necessario. </li><li> Fasciatura al collo con tripla pomata antibiotica sulle incisioni, un pad Telfa, tratto rotolo di garza, e elasticon. </li><li> Amministrare analgesia postoperatoria: meglumina flunixin 2,2 mg / kg IM una volta durante il recupero, poi 1,1 mg / kg IM una volta al giorno per due giorni, buprenorfina 0,005-0,01 mg IV o IM due volte al giorno per un giorno. </li></ol> 3. In Vivo Monitoring <ol><li> Mettere le pecore nel carrello mobile per garantire una corretta moderazione. In questo modo le pecore a mantenere la calma e consapevole, senza compromettere l&#39;hardware. Potrebbe essere necessario per ambientarsi pecore al carrello 2 o 3 volte per 30 minuti prima di ottenere registrazioni di strumentazione. </li><li> Rimuovere tutti i cavi e le linee dalla busta e la connessione a dispositivi di monitoraggio. Collegare la sonda del flusso di un misuratore di portata, cristalli 1 millimetro ultrasuoni collegato a TRBBox -USB, e cateteri linee a trasduttori di pressione. Un diagramma di flusso di questa configurazione è fornito (Figura 6). </li><li> Calibrare le sonde di flusso e trasduttori di pressione prima di acquisizione dati. NOTA: A causa della variabilità potenziale tra le versioni del software e le differenze nelle apparecchiature utilizzate, le tarature e le impostazioni varieranno da caso a caso. </li><li> Utilizzare un oscilloscopio per mettere a punto la misura di cristallo Sonometrics, secondo il protocollo del produttore. </li><li> Registrare i dati utilizzando il software del computer (Figura 7). Tracce nella metà superiore della figura 7 in colore bianco corrisponde al TEV impiantato, mentre tracce nella metà inferiore di colore rosso corrisponde al Sham / nativo. Sia per il TEV e Sham la portata (ml / min), la pressione sanguigna arteriosa (mmHg) e il diametro (mm) vengono registrate vivo. </li><li> Record per almeno 1 minuto, senza disturbi. Esportare questi dati per un&#39;analisi più dettagliata. Dopo la registrazione, disconnect tutti i cavi e posto nuovamente dentro il sacchetto suturato sul collo della pecora. </li></ol>

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Lo scopo di questo rapporto è quello di fornire una procedura affidabile e riproducibile di TEV impianto di interesse nella carotide ovine. Le arterie carotidi native degli animali utilizzati in questo modello sono stati 0,5-0,75 mm di spessore e 4,5-5 mm di diametro esterno. La tecnica chirurgica qui descritta ha avuto successo per l&#39;impianto di TEV di varie geometrie di misura 0,25-1 mm di spessore, 4-5 mm di diametro esterno e 4 cm di lunghezza con grande successo dimostrando efficace fino a 3 mesi di durata, il...

L&#39;obiettivo principale per lo sviluppo di TEV è stato quello di fornire un sostituto per la sostituzione del trapianto autologo quando vasi autologhi non sono disponibili e limitare donatori di vista morbilità. Ad esempio, il numero di interventi di bypass coronarico all&#39;anno ha superato 350.000 negli Stati Uniti, e la fonte ideale di opportuni innesti rimane fianco arteria mammaria interna, discendente anteriore dell&#39;arteria coronaria e safena 1. Dal momento che molte persone che soffrono di malattie vascolari non possono avere le arterie e le vene adatte per la sostituzione del trapianto autologo, lo sviluppo di TEV è così diventato un campo di intensa ricerca da decenni 1-6. Mentre la progettazione e l&#39;ottimizzazione di nuovi TEV hanno subito molti progressi, relazioni sulle tecniche chirurgiche impiegate per impiantare i TEV stessi non è stato un argomento di tale discussione intensa. Piuttosto, i protocolli per quanto riguarda l&#39;impianto di TEV in modelli animali sono in gran parte lasciatifino alla ricerca investigatori. Il seguente manoscritto illustrato come impiantare TEV utilizzando un approccio anastomosi end-to-end. Questa procedura è stata ottimizzata utilizzando uno specifico modello di sutura anastomotica, stabilizzante tecnica di sutura, ottimizzando tensione longitudinale e l&#39;aggiunta di monitoraggio in vivo strumentazione. Questo metodo è in contrasto con alcune delle molte varianti che sono state usate in precedenza. Inoltre, questa procedura viene descritto come acquisire i parametri come la pressione arteriosa, TEV diametro / conformità e portata attraverso il TEV dopo l&#39;intervento fino espianto. Questa raccolta di dati fornisce un&#39;analisi indispensabile del TEV mentre è in fase di rimodellamento.

<table><tbody><tr><td>Pressure Transducer</td><td>Becton Dickinson</td><td>P23XL-1</td><td>Quantity: 1+ (1 for each artery).&lt;br/&gt;Used with water-filled diaphragm domes.</td></tr><tr><td>Amplifier and transducer box</td><td>Gould</td><td>5900 Signal Conditioner Cage</td><td>Quantity: 1.&lt;br/&gt;Two transducers and amplifiers should be included in cage. While this specific unit may be discontinued, other commercially available pressure transducers with a BNC/analog output will communicate with the Sonometrics equipment.</td></tr><tr><td>T403 Console with TS420 perivascular flowmeter module (x2)</td><td>Transonic Systems</td><td>T403 module and TS420 (x2)</td><td>Quantity: 1.&lt;br/&gt;Flow probes measuring flow through each of the carotid arteries will connect to each of the TS420 units.</td></tr><tr><td>Digital ultrasonic measurement unit</td><td>Sonometrics</td><td>TR-USB</td><td>Quantity: 1</td></tr><tr><td>Flow Probe Precision S-Series 4&amp;nbsp;mm</td><td>Transonic Systems Inc.</td><td>MC4PSS-LS-WC100-CM4B-GA</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>1&amp;nbsp;mm Sonometrics Crystals</td><td>Sonometrics Systems</td><td>1R-38S-20-NC-SH</td><td>Quantity: 2-4 (2 for each artery)</td></tr><tr><td>Catheter for implantation</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>&amp;nbsp;381447</td><td>Quantity: 1+ (1 for each artery).&lt;br/&gt;Catheter is cut and secured to microbore tubing, stylette is utilized for insertion.</td></tr><tr><td>Tygon Microbore Tubing</td><td>Norton Performance Plastics</td><td>(AAQ04127) Formulation S-54-HL</td><td>Cut to length for an extension set</td></tr><tr><td>Luer Stub Adapter</td><td>BD (Becton Dickinson)</td><td>427564 (20 gauge)</td><td>Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter)</td></tr><tr><td>Surflo Injection Plug</td><td>Terumo</td><td>SR-IP2</td><td>Quantity: 1+ (1 for each arterial catheter)</td></tr><tr><td>Meadox</td><td>PTFE (Teflon) Felt</td><td>19306</td><td>Cut to size.&lt;br/&gt;The PTFE felt used in our studies was discontinued. However, comparable companies such as &amp;ldquo;Surgical Mesh&amp;rdquo; offer products which are equivalent.</td></tr></tbody></table>

surgical technique for the implantation of tissue engineered vascular grafts and subsequent in vivo monitoring

Lo sviluppo di ingegneria tessutale Vessels (TEV) è avanzata dalla capacità di di routine ed efficace TEV impianto (4-5 mm di diametro) in un grande modello animale. Un protocollo passo-passo per il posizionamento tra posizionale della valutazione TEV digitale in tempo reale del TEV e arterie carotidi native è descritto qui. In vivo monitoraggio è reso possibile dal impiantazione di sonde di flusso, cateteri e cristalli ultrasonici (grado di registrare i cambiamenti di diametro dinamici di TEV impiantati e delle arterie carotidi native) al momento della chirurgia. Una volta impiantato, i ricercatori possono calcolare i modelli flusso di sangue arterioso, invasiva della pressione arteriosa e del diametro dell&#39;arteria che producono parametri come la velocità dell&#39;onda di polso, indice di aumento, le pressioni di impulsi e la conformità. L&#39;acquisizione dei dati viene eseguita utilizzando un singolo programma per computer per l&#39;analisi per tutta la durata dell&#39;esperimento. Tali dati inestimabile permette di comprendere meglio TEV rimodellamento della matrice, la sua resemblanCé a controlli nativi / sham e prestazioni TEV generale in vivo.

Più di 30 pecore sono stati sottoposti alla tecnica chirurgica descritta nella presente relazione per l&#39;impianto di TEV (in corso di stampa) 9. Una tabella che riassume le più recenti operazioni di ovini dopo l&#39;ottimizzazione del protocollo sono riportati nella tabella 2. Tutte le pecore recuperati dopo TEV l&#39;impianto senza pericolo di vita complicazioni. In alcuni animali, la fibrosi è stata osservata in arteria nativa vicino alla punta del catetere arterioso. Non è stato oss...

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Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

Un protocollo step-by-step per il collocamento inter-posizionale di ingegneria tessutale Vessels (TEV) nella carotide di una pecora con anastomosi end-to-end e di valutazione digitale in tempo reale in vivo fino al sacrificio degli animali.

Tecnica chirurgica per l&#39;impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive<em&gt; In Vivo</em&gt; Monitoraggio

The development of Tissue Engineered Vessels (TEVs) is advanced by the ability to routinely and effectively implant TEVs (4-5 mm in diameter) into a large ...

surgical-technique-for-implantation-tissue-engineered-vascular-grafts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Surgical Technique for the Implantation of Tissue Engineered Vascular Grafts and Subsequent In Vivo Monitoring

11.7K Views.  State University of New York Buffalo School of Medicine.  Un protocollo step-by-step per il collocamento inter-posizionale di ingegneria tessutale Vessels (TEV) nella carotide di una pecora con anastomosi end-to-end e di valutazione digitale in tempo reale in vivo fino al sacrificio degli animali. 

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Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological environment, both mechanical and chemical stimulation are required to maintain the proper development and functionality of arterial vessels1,2.
Bioreactor culture systems developed by our group are designed to support vessel regeneration within a precisely controlled chemo-mechanical environment mimicking that of native vessels. Our bioreactor assembly and maintenance procedures are fairly simple and highly repeatable3,4. Smooth muscle cells (SMCs) are seeded onto a tubular polyglycolic acid (PGA) mesh that is threaded over compliant silicone tubing and cultured in the bioreactor with or without pulsatile stimulation for up to 12 weeks. There are four main attributes that distinguish our bioreactor from some predecessors. 1) Unlike other culture systems that simulate only the biochemical surrounding of native blood vessels, our bioreactor also creates a physiological pulsatile environment by applying cyclic radial strain to the vessels in culture. 2) Multiple engineered vessels can be cultured simultaneously under different mechanical conditions within a controlled chemical environment. 3) The bioreactor allows a mono layer of endothelial cells (EC) to be easily coated onto the luminal side of engineered vessels for animal implantation models. 4) Our bioreactor can also culture engineered vessels with different diameter size ranged from 1 mm to 3 mm, saving the effort to tailor each individual bioreactor to fit a specific diameter size. 
The engineered vessels cultured in our bioreactor resemble native blood vessels histologically to some degree. Cells in the vessel walls express mature SMC contractile markers such as smooth muscle myosin heavy chain (SMMHC)3. A substantial amount of collagen is deposited within the extracellular matrix, which is responsible for ultimate mechanical strength of the engineered vessels5. Biochemical analysis also indicates that collagen content of engineered vessels is comparable to that of native arteries6. Importantly, the pulsatile bioreactor has consistently regenerated vessels that exhibit mechanical properties that permit successful implantation experiments in animal models3,7. Additionally, this bioreactor can be further modified to allow real-time assessment and tracking of collagen remodeling over time, non-invasively, using a non-linear optical microscopy (NLOM)8. To conclude, this bioreactor should serve as an excellent platform to study the fundamental mechanisms that regulate the regeneration of functional small-diameter vascular grafts.

Our group has developed a bioreactor culture system that mimics the physiological pulsatile stresses of the cardiovascular system to regenerate implantable small-diameter vascular grafts.

Ingegneria biologica basata innesti vascolari Utilizzando un bioreattore pulsatile

Much effort has been devoted to develop and advance the methodology to regenerate functional small-diameter arterial bypasses. In the physiological ...

Ricerca

Bioingegneria

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation and Grafting of Tissue-engineered Vessels in a Mouse Model

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. The current protocol presents an efficient and reproducible strategy in which functional tissue engineered vessel grafts can be generated using partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) from human fibroblasts. We designed a decellularized vessel scaffold bioreactor, which closely mimics the matrix protein structure and blood flow that exists within a native vessel, for seeding of PiPSC-endothelial cells or smooth muscle cells prior to grafting into mice. This approach was demonstrated to be advantageous because immune-deficient mice engrafted with the PiPSC-derived grafts presented with markedly increased survival rate 3 weeks after surgery. This protocol represents a valuable tool for regenerative medicine, tissue engineering and potentially patient-specific cell-therapy in the near future.

Here, we present a protocol to generate tissue engineered vessel grafts that are functional for grafting into mice by double seeding partially induced pluripotent stem cell (PiPSC) - derived smooth muscle cells and PiPSC - derived endothelial cells on a decellularized vessel scaffold bioreactor.

Generazione e innesto delle navi tissutale in un modello di topo

The construction of vascular conduits is a fundamental strategy for surgical repair of damaged and injured vessels resulting from cardiovascular diseases. ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Progettato Vascolarizzato muscolare Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Medicina

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingegneria dei tessuti da parte intrinseca Vascolarizzazione in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Camera ingegneria dei tessuti

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Il arterovenosa (AV) loop in un modello di Piccoli Animali per studiare Angiogenesi e ingegneria dei tessuti vascolarizzati

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Scaling of Engineered Vascular Grafts Using 3D Printed Guides and the Ring Stacking Method

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, engineered grafts offer great potential for patient treatment. However, engineered vascular grafts are generally not easily scalable, requiring manufacture of custom molds or polymer tubes in order to customize to different sizes, constituting a time-consuming and costly practice. Human arteries range in lumen diameter from about 2.0-38 mm and in wall thickness from about 0.5-2.5 mm. We have created a method, termed the "Ring Stacking Method," in which variable size rings of tissue of the desired cell type, demonstrated here with vascular smooth muscle cells (SMCs), can be created using guides of center posts to control lumen diameter and outer shells to dictate vessel wall thickness. These tissue rings are then stacked to create a tubular construct, mimicking the natural form of a blood vessel. The vessel length can be tailored by simply stacking the number of rings required to constitute the length needed. With our technique, tissues of tubular forms, similar to a blood vessel, can be readily manufactured in a variety of dimensions and lengths to meet the needs of the clinic and patient.

Scalable engineered blood vessels would improve clinical applicability. Using easily sizable 3D-printed guides, rings of vascular smooth muscle were created and stacked into a tubular form, forming a vascular graft. Grafts can be sized to meet the range of human coronary artery dimensions by simply changing the 3D-printed guide size.

Scaling di Engineered vascolari innesti Usando 3D Stampato Guide e il metodo di impilamento Anello

Coronary artery disease remains a leading cause of death, affecting millions of Americans. With the lack of autologous vascular grafts available, ...

Nondestructive Monitoring of Degradable Scaffold-Based Tissue-Engineered Blood Vessel Development Using Optical Coherence Tomography

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial bypass. Characterization of the growth dynamics and remodeling process of degradable polymer scaffold-based tissue-engineered blood vessels (TEBVs) with pulsatile stimulation is crucial for vascular tissue engineering. Optical imaging techniques stand out as powerful tools for monitoring vascularization of engineered tissue enabling high-resolution imaging in real-time culture. This paper demonstrates a nondestructive and fast real-time imaging strategy to monitor the growth and remodeling of TEBVs in long-term culture by using optical coherence tomography (OCT). Geometric morphology is evaluated, including vascular remodeling process, wall thickness, and comparison of TEBV thickness in different culture time points and presence of pulsatile stimulation. Finally, OCT provides practical possibilities for real-time observation of the degradation of polymer in the reconstructing tissues under pulsatile stimulation or not and in each vessel segment, by compared with the assessment of polymer degradation using scanning electron microscopic(SEM) and polarized microscope.

A step by step protocol for nondestructive and long-period monitoring the process of vascular remodeling and scaffold degradation in real-time culture of biodegradable polymeric scaffold-based tissue-engineered blood vessels with pulsatile stimulation using optical coherence tomography is described here.

Non distruttive monitoraggio dello sviluppo del vaso sanguigno tessutale basati su Scaffold degradabile usando la tomografia a coerenza ottica

Engineered vascular grafts with structural and mechanical properties similar to natural blood vessels are expected to meet the growing demand for arterial ...

A Novel Approach to Monitoring Graft Neovascularization in the Human Gingiva

Laser speckle contrast imaging (LSCI) is a novel method for measuring superficial blood perfusion over large areas. Since it is non-invasive and avoids direct contact with the measured area, it is suitable for monitoring blood flow changes during wound healing in human patients. Vestibuloplasty is periodontal surgery to the oral vestibule, aiming to restore vestibular depth with simultaneous enlargement of the keratinized gingiva. In this special clinical case, a split thickness flap was elevated at the first upper premolar and a xenogenic collagen matrix was adapted to the resulting recipient bed. LSCI was used to monitor the re- and neovascularization of the graft and the surrounding mucosa for one year. A protocol is introduced for the correct adjustment of microcirculation measurement in the oral mucosa, highlighting difficulties and possible failures.
The clinical case study presented demonstrated that &#8212; following the appropriate protocol &#8212; LSCI is a suitable and reliable method for following up microcirculation in a healing wound in the human oral mucosa and gives useful information on graft integration.

This study introduces a protocol for measuring microcirculation in human oral mucosa by laser speckle contrast imaging. The monitoring of wound healing after vestibuloplasty combined with a xenogenic collagen graft is presented on a clinical case.

Un nuovo approccio al monitoraggio dell'innesto neovascolarizzazione nella gengiva umana

Laser speckle contrast imaging (LSCI) is a novel method for measuring superficial blood perfusion over large areas. Since it is non-invasive and avoids ...

Tecnica chirurgica per l'impianto di ingegneria tessutale vascolari Innesti e successive

Riepilogo

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