La barriera emato-spinale è strettamente legata e ha una permeabilità limitata. Questo protocollo consente ai ricercatori di aprire in modo sicuro e transitorio la barriera emato-spinale, utilizzando microbolle e ultrasuoni focalizzati. Questa tecnica consente di localizzare l'apertura della barriera emato-spinale al segmento del midollo spinale mirato.
Inoltre, l'interruzione può essere facilmente confermata tramite osservazione visiva o microscopia a fluorescenza. Questo protocollo può essere esplorato per il suo potenziale nel migliorare la somministrazione di terapie geniche o farmaci al midollo spinale per il trattamento di tumori, atrofie o lesioni. A dimostrare la procedura sarà Meghana Bhimreddy.
Uno studente di medicina stellare del mio laboratorio, che ogni giorno colma il divario tra ingegneria e medicina. Per iniziare, acquisire un sistema di trasduttori a ultrasuoni focalizzati con specifiche sufficienti per ottenere la barriera emato-spinale o le aperture BSCB nei ratti. Fissare il supporto della sonda stampato in 3D e il cono d'acqua sul trasduttore.
Assicurarsi che vi sia una tenuta stagna tra il cono e il trasduttore. Fissare la membrana in poliestere sterilizzata, spessa 50 micron, acusticamente trasparente, sul fondo del cono d'acqua utilizzando un elastico. Riempire il cono d'acqua con acqua degassata e deionizzata utilizzando i tubi di ingresso e di uscita.
Evitare le bolle d'aria all'interno del cono, in quanto possono interrompere l'accoppiamento acustico tra il trasduttore e il target. In questa fase, la membrana in Mylar dovrebbe essere leggermente gonfiata. Collegare l'apparecchiatura di pilotaggio contenente il generatore di onde e l'amplificatore di azionamento a radiofrequenza al trasduttore.
Fissare il braccio stereotassico alla piastra di fissaggio e fissare il supporto della sonda al braccio. Registrare il peso di una femmina di ratto Sprague-Dawley anestetizzata ed eseguire un test di pizzicamento delle dita dei piedi e della coda, per confermare l'anestesia. Posizionare un termoforo e un tampone assorbente sterile sulla piastra di fissaggio.
Posizionare il ratto sul tampone assorbente. Applicare un unguento per gli occhi e posizionare un termometro rettale per monitorare la temperatura corporea. Palpare l'ultima costola del ratto, che è attaccata alla colonna vertebrale in corrispondenza della tredicesima vertebra toracica.
Usa un rasoio elettrico per radere il pelo dalla superficie dorsale tra l'ultima costola e il collo. Pulire la pelle esposta con una garza imbevuta di iodopovidone al 10%. Crea un'incisione sulla linea mediana usando le forbici per iride e seziona la fascia fino a quando i processi spinosi e la lamina non sono esposti.
Rimuovere l'osso con tronchesi sfalsati e forbici per iride a lama angolata, fino a quando il midollo spinale non è esposto. Fissare il ratto alla piastra di fissaggio bloccando i processi spinosi adiacenti alla laminectomia. Quindi tirare leggermente i morsetti per tendere la colonna vertebrale.
Regolare la posizione del trasduttore con il braccio stereotassico fino a quando non si trova esattamente sopra la laminectomia. Fissare l'apparecchio laser sul fondo del cono d'acqua e abbassarlo fino a quando il punto laser non è visibile. Quindi regolare la posizione laterale del trasduttore fino a quando il punto laser non si trova al di sopra della posizione target per l'interruzione del BSCB.
Rimuovere l'apparecchio laser e riempire lo spazio tra il cono e il midollo spinale con gel per ultrasuoni degassato, senza introdurre bolle d'aria. Impostare i parametri per la sonicazione sull'uscita di potenza del trasduttore. Preparare una soluzione di microbolle secondo le istruzioni del produttore.
Per aumentare le possibilità di successo del cateterismo della vena caudale, immergere la coda in acqua tiepida e posizionare un laccio emostatico alla base della coda per allargare il diametro delle vene. Quindi inserire un catetere della vena caudale calibro 22 e sciacquare con 0,2 millilitri di soluzione fisiologica eparinizzata. Iniettare un millilitro per chilogrammo di colorante blu Evans al 3% o EBD nel catetere.
Quindi lavare il catetere con 0,2 millilitri di soluzione fisiologica eparinizzata. Confermare l'esito positivo del cateterismo della vena caudale controllando il cambiamento di colore blu nella pelle, negli occhi o nella vena spinale dorsale del ratto. Iniettare 0,2 millilitri di bolo di microbolle nel catetere e sciacquare con soluzione fisiologica eparinizzata prima di iniziare la sonicazione.
Dopo aver soppresso il ratto, rimuovere il midollo spinale e metterlo in paraformaldeide al 4% a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente sostituire la paraformaldeide con PBS. Per visualizzare l'interruzione del BSCB, isolare una sezione di due centimetri che circonda la posizione della sonicazione, usando una lama di rasoio.
Dividere la sezione in sezioni spesse 10 micron utilizzando un microtomo e colorare con colorazione di ematossilina eosina. Per la microscopia a fluorescenza, deparaffinizzare il vetrino contenente la sezione del midollo spinale e controcolorare con 25 microlitri di DAPI disciolti nel mezzo di montaggio. Incubare le sezioni a quattro gradi Celsius per 10 minuti al buio per evitare lo sbiancamento.
Dopo l'incubazione, utilizzare un microscopio a fluorescenza per visualizzare tutti i vetrini. Immagine del vetrino colorato con ematossilina ed eosina utilizzando un microscopio ottico. La vascolarizzazione del midollo spinale è visibile dopo la laminectomia e mostra la vena spinale posteriore, con più vasi più piccoli che si irradiano lateralmente.
Dopo l'iniezione endovenosa di EBD, il tessuto circostante e la vascolarizzazione del midollo spinale apparivano blu. Dopo la sonicazione, una macchia blu diventa visibile sulla posizione bersaglio, indicando lo stravaso di EBD nel parenchima bianco, a causa dell'interruzione del BSCB. L'asportazione del midollo spinale dai ratti con ultrasuoni focalizzati a bassa intensità, o sonicazione LIFU, ha confermato l'apparente stravaso di EBD nel midollo spinale.
Mentre i ratti controllati negativamente senza trattamento LIFU non hanno mostrato stravaso di EBD. I cavi spinali con sonicazione LIFU hanno mostrato un'intensità significativamente maggiore di autofluorescenza EBD, rispetto ai cordoni che non hanno ricevuto sonicazione. Con intensità simili di DAPI presenti in entrambi.
L'analisi dell'ematossilina e dell'eosina non ha rivelato danni neuronali, emorragie o lesioni della cavità nelle posizioni sonicate. Esempi di cavi danneggiati a causa di una cattiva manipolazione chirurgica e di una sonicazione ad alta potenza sono mostrati come confronto. Nei ratti che hanno ricevuto microbolle e trattamento LIFU, non è stato osservato alcun cambiamento nei punteggi motori, pre-sonicazione, post-sonicazione e durante un periodo di sopravvivenza di cinque giorni.
Variazioni minime della temperatura del midollo spinale sono state osservate prima, durante e dopo l'analisi della sonicazione. È importante limitare i danni chirurgici al midollo durante la laminectomia. Visualizzando le sezioni colorate H ed E con la microscopia, indicherà se si è verificato un danno.
A seguito dell'interruzione della barriera emato-midollo spinale, utilizzando gli ultrasuoni focalizzati, agli animali possono essere iniettati agenti antineoplastici o terapie geniche. L'esito determinerà se questa tecnica può migliorare la somministrazione di terapie e prolungare la sopravvivenza nel contesto della patologia del midollo spinale.
