Questo protocollo fornisce una base per l'espansione delle cellule tumorali che, a sua volta, consente uno studio approfondito della funzione delle cellule tumorali e degli stati genomici. Inoltre, fornisce un sistema modello in vitro per valutare l'impatto del tumore sulla risposta immunitaria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un protocollo basato per stabilire linee tumorali mesoteliali dal tessuto del paziente.
Attualmente non esiste un protocollo standardizzato per questo sistema modello. L'aspetto più difficile di questa tecnica è la presenza di contaminazione da fibroblasti nelle colture di passaggio precoce. È fondamentale avere una solida comprensione dei fibroblasti rispetto alla morfologia delle cellule tumorali per determinare se i tentativi di fame dei fibroblasti stanno funzionando.
Inizia trasferendo 10 millilitri di cocktail enzimatico di digestione del tumore in un tubo di dissociazione. Trasferire il pezzo di tessuto tumorale in un coperchio sterile a sei pozzetti usando un bisturi sterile. Rimuovere tutti i tessuti necrotici grassi e coaguli di sangue utilizzando un nuovo bisturi sterile e una pinza.
Tagliare l'intero tessuto tumorale in piccoli frammenti di un millimetro cubo. Per garantire che il tessuto non si secchi, aggiungere 500 microlitri di soluzione sterile hank's balanced salt, o HBSS, al tessuto tumorale. Trasferire frammenti tumorali nel tubo di dissociazione contenente 10 millilitri di cocktail enzimatico di digestione del tumore.
Chiudere saldamente il tubo. Posizionare il cappuccio rivolto verso il basso sul dissociatore tissutale e fornire calore al dissociatore. Selezionare l'impostazione pre-programmata sul dissociatore per l'impostazione 1 del kit di dissociazione del tumore umano a 37 gradi Celsius e controllare lo stato dopo 10 minuti per assicurarsi che nessun errore di intasamento sia indicato dalla luce rossa lampeggiante.
Dopo un'ora, rimuovere il tubo di dissociazione e metterlo in una cappa a flusso laminare. Filtrare il tumore digerito posizionando un filtro cellulare da 70 micrometri su un tubo conico da 50 millilitri e pipettando il tumore digerito usando una pipetta da 10 millilitri sul filtro. Se il filtro si intasa, passare a un nuovo filtro.
Risciacquare il tubo di dissociazione con 10 millilitri di mezzi di digestione tumorale freschi e lavare attraverso il filtro. Rimuovere e scartare il filtro. Portare il volume totale a 40 millilitri con il mezzo di digestione del tumore.
Centrifugare a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta aspirante da due millilitri collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet e risospescere le cellule usando 10 millilitri di mezzo tumorale sterile. Quindi, di nuovo, centrifugare i tubi e aspirare il surnatante come dimostrato.
Successivamente, risospese le cellule in tre millilitri di terreno tumorale sterile e trasferire la sospensione cellulare in un pozzo di una piastra sterile a sei pozzetti. Tenere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, trasferire il mezzo usato dal tumore digerito in un pozzo uno a un nuovo pozzo nella stessa piastra a sei pozzetti, quindi aggiungere tre millilitri di mezzo tumorale sterile a uno bene.
Utilizzando un microscopio a fase invertita, determinare la percentuale di contaminazione da fibroblasti nella coltura di passaggio precoce. Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 20% delle cellule nella coltura di passaggio precoce, continuare la coltura dopo aver sostituito il mezzo tumorale con il mezzo sierico ridotto. Se la popolazione di fibroblasti non è ridotta al 10% o meno, sciacquare delicatamente il pozzetto con PBS per rimuovere il siero contenente il mezzo.
Aggiungere un millilitro di tripsina per pozzetto in un piatto a sei pozzetti. Posizionare la piastra o il pallone a sei pozzetti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un minuto. Rimuovere la piastra o il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito.
Quando le cellule sono parzialmente sollevate o galleggianti, rimuovere delicatamente le cellule sospese e solo la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo. Ripetere la tripsinizzazione fino a quando non vengono rimosse tre o quattro frazioni.
Centrifugare tutte le frazioni indipendenti a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta aspirante da due millilitri collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospese le cellule utilizzando cinque millilitri di mezzo sierico sterile ridotto.
Placcare le celle in un matraccio T-25 per ogni frazione e posizionare i palloni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Per la crioconservazione delle cellule di passaggio precoce, scongelare un tubo di terreno di congelamento aliquotato. Raccogliere le cellule per tripsinizzazione lavando prima la piastra con PBS e aggiungendo tripsina come dimostrato in precedenza.
Mettere il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre minuti. Rimuovere il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule si sollevano o galleggiano, rimuovere delicatamente le cellule sospese e la tripsina.
Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo. Mescolare il contenuto del tubo pipettando delicatamente. Rimuovere 20 microlitri di sospensione cellulare per il conteggio.
Quindi centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quando le cellule girano, contare utilizzando un protocollo di conteggio specifico di laboratorio, come il tripano blu o l'acridina arancione / ioduro di propidio. Risospese le cellule dopo centrifugazione in mezzo di congelamento con un minimo di 5 x 10 alla sesta cella per millilitro di mezzo di congelamento e trasferire un millilitro di questa sospensione cellulare a 1,5 millilitri pre-marcati di crioviali.
Posizionare i crioviali in una camera di congelamento a velocità controllata e trasferirli immediatamente a meno 80 gradi Celsius. La figura mostra un aumento della contaminazione da fibroblasti dell'80%50% e del 30% rispetto a una coltura senza contaminazione da fibroblasti. Questa figura mostra la colorazione rappresentativa della superficie della citometria a flusso di quattro linee tumorali primarie del mesotelioma, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H e una linea tumorale del melanoma, MEL526 come controllo negativo.
Queste linee cellulari possono esprimere sia mesotelina che N-caderina. L'importanza di testare l'impatto del distacco enzimatico sull'espressione dei marcatori proteici di superficie è anche dimostrata in quanto sia la tripsina che la miscela di proteasi collagenasi hanno provocato la perdita dell'espressione superficiale di N-caderina, mentre CD90 non è stato influenzato. I passaggi importanti includono la corretta elaborazione del tumore, compresa la rimozione di sangue e grassi prima della digestione, l'identificazione della contaminazione dei fibroblasti e la determinazione di come limitare la crescita eccessiva dei fibroblasti è vitale.
Un metodo importante che segue questa procedura include saggi citotossici dei linfociti per testare la capacità delle cellule T autologhe di riconoscere le cellule tumorali derivate dal paziente. Questa tecnica identificherà nuovi recettori delle cellule T antitumorali specifici che potrebbero essere di importanza terapeutica. Inoltre, ci permetterà di studiare l'interazione tra tumore e tumore accoppiato che infiltra i linfociti e la disfunzione immunitaria.
