Questa ricerca è stata finanziata dal Canada Genomics di Ricerca e Sviluppo Health Initiative (GRDI) e la strategia di regolamentazione canadese per la biotecnologia (CRSB). Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

<ol>
	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li><li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., M&#248;ller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA.">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li><li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+(8-oxo-dGuo)+by+PAH+o-quinones:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper(ii)/copper(i)+redox+cycling.">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li><li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress.">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li><li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection:+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay.">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Anche se a 8-oxo-dGuo &#39;stato segnalato come un utile biomarcatore di ossidazione del DNA, la sua quantificazione affidabile può rappresentare una sfida. Anche se esistono diversi metodi pubblicati, vi è la necessità di un approccio globale, panoramica descrittiva di protocollo per consentire ai ricercatori di implementare il metodo nei loro laboratori. Qui vi presentiamo una panoramica dettagliata di un protocollo basato su HPLC che permetterà ai nuovi utenti di stabilire un metodo efficace per il rilevamento a 8-oxo-dGuo e la quantificazione. Tre principali metodi che sono stati descritti per la quantificazione di 8-oxo-dGuo. Questi includono immunoenzimatico (ELISA) a base di kit commerciali 19, cromatografia liquida spettrometria / massa (MS) metodi (ad esempio, come descritto altrove 9 e metodi HPLC-ED, come quello qui descritti. Metodi ELISA possono soffrire di disturbi con alcuni composti in campioni biologici 19. In generale, i risultati ottenuti utilizzando Chromatogrtecniche aphic sono considerati più affidabile per 8-oxo-dGuo quantificazione in confronto con metodi ELISA-20. Confrontando i metodi HPLC-DE con i metodi basati su MS, il vantaggio del primo è relativamente poco costosa apparecchiatura (cioè, circa un ordine di grandezza meno costosa apparecchiatura per i metodi basati-MS). Inoltre, HPLC-MS sono superiori ai metodi HPLC-ED quanto le prime non sono inclini a potenziali interferenze con composti elettroattivi e fornire misurazioni quantitative, non ambigue ed isotopi 21. Sono state sollevate preoccupazioni riguardo l&#39;uso di metodi di estrazione fenolo tradizionali per l&#39;estrazione di DNA genomico da utilizzare per 8-oxo-dGuo quantificazione 22. Diversi ricercatori hanno notato che le condizioni associate con l&#39;estrazione con fenolo norma possono introdurre indesiderati dGuo ossidazione, aumentando così i livelli di base 1,9. Per risolvere questo problema, cellulare e animal DNA genomico può essere estratto e purificato usando un protocollo DNAzol modificata 22. DNAzol contiene alte concentrazioni di guanidina tiocianato, e studi precedenti 9 hanno notato più basso livello di base a 8-oxo-dGuo formazione quando DNAzol viene utilizzato rispetto al fenolo tradizionali e metodi di estrazione basati NaI. Il composto chelante del ferro deferoxamina è stato utilizzato per ridurre al minimo la produzione di ROS e l&#39;ossidazione del DNA durante la preparazione del campione. Come indicato in precedenza, i livelli di 8-oxo-dGuo nelle cellule A549 atone (Figura 7A) sono stati molto simili a ciò che è stato misurato mediante un metodo basato su MS 13. Questo suggerisce che l&#39;incorporazione di precauzioni descritte per i metodi basati su MS 13 consentito minimizzazione indesiderabile ossidazione DNA durante la preparazione e l&#39;analisi del campione per ottenere accurata quantificazione 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED. Tempistica delle cellule di coltura della necroscopia o di raccolta dopo il trattamento pro-ossidante può essere un altro fattore importante, come si vede qui in calo di 8-oxo-dGuo livellinella milza a 24 ore contro 4 ore dopo l&#39;ultimo trattamento (Figura 7B). Ciò può essere dovuto all&#39;attivazione della riparazione escissione base per eliminare i danni DNA. I due ovvie limitazioni del metodo descritto sono: (1) la necessità di quantità relativamente grandi di DNA (circa 80 g per campione per ottenere tre repliche tecnici), e (2) il potenziale interferenza da composti co-eluizione. Si è riscontrato che solo una piccola (cioè, circa 15 mg) pezzo di milza (circa il 15% del peso totale del tessuto) era sufficiente per ottenere 80 mg di DNA, lasciando una quantità sufficiente di tessuto per altri (ad esempio, l&#39;espressione genica) analisi. La quantità di DNA estratto è un altro parametro importante che influenza l&#39;ossidazione del DNA artefatta 23,24,25. Pertanto, in collaborazione con piuttosto grande (~ 80 mg / campione), che vi proponiamo qui è coerente con le precedenti raccomandazioni di usare&gt; 30 mg per ridurre al minimo artefatta ossidazione del DNA 25.Per i tessuti più piccoli (ad esempio, l&#39;ippocampo), si potrebbe ridurre la portata del protocollo di iniziare con 20-30 mg di DNA, in quanto questo dovrebbe essere sufficiente per 2-3 corse. Grandi quantità di DNA presumibilmente facilitano la risoluzione dei picchi sopra il rumore di fondo, ma questo resta da essere verificata sperimentalmente la presenza di sostanze potenzialmente interferenti può essere affrontato caso per caso, ed è essenziale includere sempre campione di DNA da simultanea in vitro o in vivo trattamenti con un controllo positivo che è nota causare danno ossidativo del DNA (vedi Figura 7). Sebbene il fosfato nel tamponi fosfato è stato segnalato per ridurre l&#39;attività di fosfatasi alcalina, esperimenti di ottimizzazione metodo (Figura 5) ha confermato tampone fosfato potrebbe agevolmente utilizzabile. Poiché tampone fosfato è contenuto nella fase mobile, il suo uso nella preparazione dei campioni ridotto rumore rivelatore dovuta a solvent miscelazione. , La composizione del buffer, l&#39;estrazione del DNA Così la tensione e la digestione sono stati ottimizzati e sono stati inclusi controlli positivi. Inoltre, è prevista una sintesi che illustra come queste variabili possono essere ulteriormente ottimizzati dai singoli laboratori. Il nostro obiettivo era quello di produrre un metodo che potrebbe essere utile per i laboratori specializzati volti a sviluppare un test per il rilevamento a 8-oxo-dGuo e la quantificazione. Tuttavia, notiamo che è necessaria la convalida formale del metodo, come descritto sotto i gradini convalide raccomandate dalla Conferenza internazionale sull&#39;armonizzazione dei requisiti tecnici per la registrazione dei prodotti farmaceutici per uso umano (ICH) per la validazione delle procedure analitiche (ad esempio, ICH Q2 ( R1) 26). In breve, gli elementi di validazione quantitativa dovrebbero esaminare il dosaggio: 1) la precisione (che può essere compiuto includendo campioni con diverse quantità di 8-oxo-dGuo spillo-in; 2) gamma e linearità (risposta lineare attraverso extconcentrazione dell&#39;analita ended; 3) la precisione (ripetibilità e riproducibilità); 4) limite di rilevazione (generalmente, il punto in cui il rapporto segnale-rumore è maggiore o uguale 2-3; questo può essere matrice-dipendente); 5) limite di quantificazione (concentrazione alla quale la risposta soddisfa alcuni livelli predeterminati come 2 x deviazione standard di controllo; può essere matrice-dipendente); 6) selettività / specificità (capacità di rilevare il analizzare nei campioni complessi rispetto a soluzioni pulite); 7) riproducibilità (la possibilità di ottenere lo stesso risultato in diversi laboratori con diversi operatori); e 8) robustezza e sistema di idoneità. Poiché lo scopo della convalida raccomandato dal ICH è quello di dimostrare che è &quot;adatto per gli scopi previsti&quot; e molti laboratori probabilmente avrà scopi diversi, i potenziali utenti di questo test dovrebbero convalidare questo nella misura ritenuta necessaria. Quantificazione accurata di 8-oxo-dGuo è auspicabile in tossicologia e medicina molecolare del peccatoCe può aumentare la comprensione dello stress ossidativo come, e più in particolare l&#39;ossidazione del DNA, è meccanicamente ed empiricamente legata a effetti negativi sulla salute.

Specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), i cui livelli di stato stazionario può aumentare durante molte condizioni patologiche e metabolismo xenotoxic, contribuiscono ad una maggiore frequenza di danno ossidativo al DNA. Tra diverse possibili basi azotate prodotti di ossidazione, danno ossidativo del DNA può essere facilmente misurata utilizzando il marcatore stabile 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina (8-oxo-dGuo), che è una delle forme ossidate di 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo è il più abbondante lesione DNA 2 e, di conseguenza, è stato studiato per maggiore dettaglio come biomarker di ossidazione DNA nonostante l&#39;esistenza di DNA multiple prodotti di ossidazione 3. Negli esseri umani, questo danno può essere riparato con la base di riparazione per escissione dell&#39;8-oxoguanine glicosilasi 1 (hOGG1) 4. Se lasciato non riparata, 8-oxo-dGuo può contribuire alla formazione di base di mutazioni coppia-di sostituzione (cioè, G a T trasversioni) 4. È importante sottolineare che, a 8-oxo-dGuo è un marcatore consolidata for danni al DNA in relazione alla iniziazione e promozione di carcinogenesi 2. Pertanto, la quantificazione precisa di 8-oxo-dGuo è un biomarker utile e desiderabile di danno ossidativo del DNA 5. C&#39;è confusione diffusa nella letteratura per quanto riguarda i nomi corretti per i moduli ossidativamente-danneggiati di 2-deossiguanosina e, inoltre, il nome corretto del composto (s) di routine misurato come biomarker di danno ossidativo del DNA 6. I 6,8-dicheto e 6-enolica, 8-cheto forme tautomere di 8-oxo-dGuo (illustrata nella figura 1) sono i due tautomeri più importanti discussi in letteratura 5,7. La forma 6,8-dicheto è la forma più prominente a pH fisiologico di 7,4, ed è il più importante prodotto di ossidazione DNA 7. Pertanto, 8-oxo-dGuo, piuttosto che a 8-idrossi-dGuo è il nome più appropriato per questo prodotto di ossidazione 6. E &#39;anche importante notare che il 2-deossiguanosina (dGuo), piuttosto che nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleosidi (Guo), rispettivamente, viene rilevato dalla maggior parte dei metodi di 6. La rilevazione accurata e la quantificazione di 8-oxo-dGuo è difficile a causa: i) la variabilità nella digestione del campione di DNA, ii) ossidazione accidentale di dGuo a 8-oxo-dGuo che può verificarsi durante la preparazione del campione, e iii) la necessità per la convalida efficace del metodo HPLC-ED analitica 8. In questo protocollo, abbiamo puntato a raggiungere i) offrendo condizioni favorevoli, per la completa digestione del DNA e ii) da parte del chelante inclusione metallo e soluzioni ferrochelanti trattati e un DNA di isolamento speciale reagente, mentre iii) solo parzialmente affrontati dalla inclusione di controlli positivi e fornendo in tal modo che il metodo è in grado di rilevare 8-oxo-dGuo in campioni biologici. Ulteriore convalida va oltre lo scopo di questo articolo. Tuttavia, siamo fiduciosi che questo protocollo aiuterà il futuroutenti di determinare la misura in cui essi devono convalidare formalmente il protocollo, a seconda dei loro fini. Un elenco di passi necessari per la validazione formale del metodo è fornito ulteriormente. Durante lo sviluppo e la diffusione di un metodo di rilevazione a 8-oxo-dGuo, metodi pubblicati sono stati rivisti e consolidati. Così, questo metodo elimina la necessità di raccogliere informazioni da diverse fonti pubblicati che spesso mancano di importanti dettagli sperimentali fornendo allo stesso tempo mezzi rapidi e semplici di test, se è stato adottato il metodo per l&#39;individuazione e la quantificazione di 8-oxo-dGuo con successo. Questo metodo adatto è stato impiegato con successo per analizzare campioni di DNA da cellule in coltura e tessuti murino. Questo articolo video aiuterà altri gruppi a stabilire un metodo efficace per un rilevamento affidabile e quantificazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-oxo-dGuo standard</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>89320</td>
			<td>Inappropriately referred to as &#34;8-hydroxy-2&#39;-deoxy Guanosine&#34; - see Fig. 1 and text for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5931</td>
			<td>From E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Chelates heavy metals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desferoxamine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGuo standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>Sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>TypeII, from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10503-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-K media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guard column</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 0204GC</td>
			<td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphodiesterase I enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3243</td>
			<td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td>
			<td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 1546WT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

Lo stress ossidativo è associato con molti processi fisiologici e patologici, nonché metabolismo xenobiotico, porta alla ossidazione di Biomacromolecules, compreso il DNA. Pertanto, la rilevazione efficiente di ossidazione del DNA è importante per una varietà di discipline di ricerca, tra cui la medicina e tossicologia. Un biomarcatore comune di DNA ossidativo danneggiato è di 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina (8-oxo-dGuo; spesso erroneamente indicato come 8-idrossi-2&#39;-deossiguanosina (8-OH-dGuo o 8 -oxo-dG)). Sono stati descritti diversi protocolli per 8-oxo-dGuo misurazione ad alta pressione cromatografia liquida con rivelazione elettrochimica (HPLC-ED). Tuttavia, questi sono stati applicati principalmente DNA purificato trattati con pro-ossidanti. Inoltre, a causa delle differenze metodologiche tra laboratori, principalmente a causa delle differenze di allestimento di analisi, l&#39;adozione di metodi pubblicati per il rilevamento di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE richiede un&#39;attenta ottimizzazione da ciascun laboratorio. Laprotocollo, descrivendo un tale processo di ottimizzazione, è carente. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per la rilevazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali. Esso illustra come preparazione del campione di DNA può essere facilmente e rapidamente ottimizzato per minimizzare indesiderabile ossidazione DNA che può verificarsi durante la loro preparazione. Questo protocollo mostra come rilevare 8-oxo-dGuo in cellule coltivate umane adenocarcinoma alveolare (cioè cellule A549) trattati con l&#39;agente ossidante KBrO 3, e dalla milza di topi esposti al dibenzo idrocarburi aromatici policiclici (DEF, p) crisene (DBC, precedentemente noto come dibenzo (a, l) pirene, Dalp). Nel complesso, questo lavoro illustra come un metodo HPLC-ED può essere facilmente ottimizzato per il rilevamento di 8-oxo-dGuo in campioni biologici.

dGuo stato osservato per avere un tempo di ritenzione di 4,7 min, mentre 8-oxo-dGuo aveva un tempo di ritenzione di circa 6,4 min (Figura 2A e B). Vi è circa 1.000 volte differenza nelle altezze tra i due analiti, come si vede nella Figura 2C. Voltammograms per 8-oxo-dGuo e dGuo stati ottenuti per gli standard che funzionano a potenziale lavorativo nell&#39;intervallo 0,2-1,1 V. Il potenziale di lavoro ottimale per 8-oxo-dGuo è risultata di +0,5 V e +0,9 V per dGuo (Figura 3). Questi potenziali sono in accordo con altri elettrodi di carbonio vetroso descritti in letteratura 14,15. Il limite di rilevazione e la gamma dinamica di 8-oxo-dGuo e dGuo rivelazione elettrochimica è segnalato per essere nel range femtomole e nanomole rispettivamente 8,9. Le curve standard per dGuo e 8-oxo-dGuo devono essere eseguiti quotidianamente per garantire il rilevamento lineare attraverso un range di concentrazione adeguata e corretta eseguirezione dello strumento (Figura 4). Le curve standard sono costruite tracciando l&#39;area del picco in funzione della concentrazione dell&#39;analita nota (Figura integrativa 2) che permette di calcolare la concentrazione dell&#39;analita nel campione dall&#39;equazione generata dalle curve standard. È richiesta completa digestione del DNA per misurazioni accurate di frequenza a 8-oxo-Dgua e diversi metodi di digestione del DNA genomico sono state suggerite 8,15,16. Se necessario, l&#39;efficacia di estrazione del DNA e la digestione può essere verificata mediante elettroforesi in gel di agarosio (Figura 5A) e HPLC-ED (Figura 5B). Lanes con evidente striscio DNA nella Figura 5A (ad esempio, corsie 2, 4, 6, 9, 11, e 13) indicano la presenza di DNA non digerito, mentre campioni con frammenti di DNA digeriti scappare il gel ed erano quindi inosservato. L&#39;altopiano di Figura 5B indica che ulteriori incubatisu DNA con enzimi digestivi oltre 1,5 ore non determina una maggiore quantità di dGuo rilevato, suggerendo quasi completa digestione dopo 1,5 ore. Inoltre, sia elettroforesi su gel di agarosio e HPLC-ED sono stati usati per testare l&#39;utilità del buffer di digestione del DNA a base di fosfato impiegato qui. Questo tampone è ben abbinato alla fase mobile HPLC e non dà luogo a indesiderati rumore del rivelatore attribuibile alla miscelazione di soluzioni differenti (dati non mostrati). Pertanto, il passaggio dal buffer suggerito in letteratura (ad esempio, Tris-HCl 8) al tampone di fosfato di sodio è raccomandato per questo protocollo (sinistra contro lato destro della Figura 5A). Si prega di notare che le ipotesi di base per l&#39;ottimizzazione della digestione DNA erano che l&#39;inibizione dell&#39;enzima e campione disomogeneità erano trascurabili e tempo di digestione era l&#39;unico fattore limitante, come sopra indicato. Una possibilità che la digestione del DNA incompleta provocato frammenti che sono troppo piccole per essere deteCTED sui resti di gel agarosio. Anche se un tale errore sistematico interesserebbe tutti i campioni allo stesso modo, ulteriori esperimenti (ad esempio, il trattamento delle cellule in coltura con radiomarcato pro-ossidante 10) potrebbero essere condotte per escludere del tutto tale possibilità. A differenza di soluzioni standard, il DNA digerito, sia da cellule isolate o tessuti di topo, ha prodotto diversi picchi aggiuntivi (Figura 6a e 6b). Questi erano distanti dai picchi 8-oxo-dGuo e dGuo, ma esperimenti di arricchimento come una parte di esercizi di convalida descritte nella discussione sono necessari per valutare se i picchi addizionali (cioè, campione impurità dovuta agli effetti della matrice, per esempio) interferiscono con quantificazione . Il dGuo-8-oxo picco è stato confermato dalla corrispondenza del tempo di ritenzione con lo standard; ed inoltre, aumento del 8-oxo-dGuo picco per campioni di cellule o animali sottoposti a trattamento pro-ossidante (Figura 7). Pro-ossidante KBrO 3 partecipa a un elettrone astrazione dalla guanina che conduce a 8-oxo-dGuo formazione 17. È da notare che, in assenza di stress pro-ossidante, 2,4 molecole di 8-oxo-dGuo per 10 7 dGuo sono stati rilevati in cellule A549 (Figura 7A). Questo è paragonabile a 4,5 molecole di 8-oxo-dGuo / 10 7 dGuo rilevati nelle cellule A549 osservate con una alternativa, approccio basato spettrometria di massa progettato per affrontare eventuali lacune del metodo HPLC-ED 9. Trattamento DBC (cioè, ogni giorno 20,0 mg DBC / kg di peso corporeo al giorno per tre giorni) ha aumentato i livelli-dGuo 8-oxo in topo milza DNA. Questo è anche un risultato atteso, poiché ROS è noto per essere prodotte durante il metabolismo di idrocarburi aromatici policiclici in vivo 8. I livelli relativi di 8-oxo-dGuo nella milza di animali atono erano 8,3-9,4 8-oxo-dGuo / 10 6 dGuo (Figura 7B), che è in eccellenti ad act con valori pubblicati di quattro molecole 8-oxo-dG / 10 6 dGuo misurati in cellule spleniche murine in condizioni standard per HPLC-ED 18. Le figure 6 e 7 mostrano che i livelli di 8-oxo-dGuo sopra la linea di base sono molto piccole . Così se il DNA viene ossidato a livelli più bassi di quelli osservati qui, i livelli di 8-oxo-dGuo possono essere indistinguibile dal basale, che deve essere tenuto presente dagli utenti potenziali protocollo. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig1.jpg" /> Figura 1. Struttura di 8-oxo-dGuo e il suo tautomero 8-OH-dGuo. Si noti che l&#39;8-oxo-dGuo invece di 8-OH-dGuo è la principale tautomero a pH 7,4. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig2.jpg" /> Figura 2. I tempi di ritenzione per dGuo (A) e 8-oxo-dGuo (B). HPLC-ED<html> cromatogrammi sono stati ottenuti da una iniezione di 10,0 ml di una dGuo, (1,0 nmol totale) o 8-oxo-dGuo (1.000 fmol totale) e rilevati in 0,9 V (A) o 0,5 V (B). Il picco di ritenzione per dGuo era circa 4,7 min (A) e che per 8-oxo-dGuo era approssimativamente 6,4 min (B). L&#39;ampio picco a 2-3 min è probabilmente causato da disturbi di iniezione e non è influenzato (cioè, sempre presente in intensità simile) e la concentrazione di 8-oxo dGuo. (C) cromatogrammi sovrapposti da due iniezioni separate descritti in (A) e (B) rilevata da UV (260 nm). Gli standard sono stati eseguiti nello stesso giorno con le condizioni di esecuzione identiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52697/52697fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> es / ftp_upload / 52697 / 52697fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. tensione rivelatore Ottimizzazione. (A) voltammogramma di dGuo (concentrazione finale 1 nmol) rilevata mediante analisi HPLC-DE in un intervallo di 0,7-1,1 V. (B) voltammogramma di 8-oxo-dGuo (concentrazione finale 500 fmol) rilevata mediante analisi HPLC-ED in un intervallo di 0,3-0,7 V. Mezzi di tre esperimenti indipendenti (N = 3) ± deviazione standard mostrato. In alcuni casi le barre di errore sono inferiori ai simboli stampa. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig4.jpg" /> Figura 4. curva standard per dGuo (A) e 8-oxo-dGuo (B). Dieci microlitri di entrambi dGuo o 8-oxo-dGuo stato iniettato e misurate mediante HPLC-ED a 0.9 V (A) o 0,6 V (B ). Mezzi di tre esperimenti indipendenti (N = 3) ± deviazione standard mostrato. In alcuni casi le barre di errore sono smaller che i simboli complotto. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig5.jpg" /> Figura 5. Ottimizzazione della digestione del DNA. (A) Ottanta microgrammo di testicoli salmone DNA è stato digerito come descritto 8 in Tris-HCl, tampone glicina-acetato (sinistra) o tampone fosfato di sodio (destra). Elettroforesi su gel di agarosio (1,0%) è stato eseguito a 150 V per 45 min. Corsia 1 e 8: scala di DNA; corsie 2, 4, e 6: il DNA non digerito; corsie 3, 5, e 7: DNA digerito; corsie 9, 11 e 13: DNA digerito (tampone fosfato); Lanes 10, 12 e 14:. digerito DNA (tampone fosfato) (B) testicoli Salmon DNA (80 mg) è stato digerito qui incubando con DNasi I, PDE io, e AP per 0,5-2,5 ore per ogni passo, in 50 tampone fosfato mM contenente cloruro di magnesio e DFO. Cinquanta microlitri di ciascun campione, contenente 7,3 mg di DNA digerito, è stato analizzato mediante HPLC (cioè 0,9 V e 1 ml / min flow) per rilevare dGuo. La figura mostra attraverso tre esperimenti indipendenti (n = 3) ± errore standard della media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52697/52697fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6A" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig6A.jpg" /> <img alt="Figura 6B" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig6B.jpg" /> Figura 6. cromatogrammi per 8-oxo-dGuo rilevamento in cellule in coltura (A) o tessuto animale (B). (A) Digerito DNA dalle cellule A549, trattate o non trattate con KBrO 3. (B) DNA digerito dalla milza di DBC topi -treated. Picchi spostati verso sinistra a causa della rimozione della colonna di guardia (a causa di accumulo di pressione nel dispositivo, la loro posizione è stata confermata con standard). Norme e campioni sono stati analizzati lo stesso giorno con condizioni di esecuzione identicis e 10 ml di iniezione volumi, a velocità di flusso 1 ml / min e 0,5 e 0,9 V per dGuo e 8-oxo-dGuo rispettivamente. Cliccate <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52697/52697fig6Ahighres.jpg" target="_blank">qui</a> per una versione più grande del pannello A, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52697/52697fig6Bhighres.jpg" target="_blank">qui</a> per il pannello B. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig7.jpg" /> Figura 7. La quantificazione di 8-oxo-dGuo in campioni biologici. Peaks sono stati integrati e confrontati con curve standard (vedi Figura integrativa 2 per maggiori dettagli) per produrre i livelli di 8-oxo-dGuo nel DNA dalle cellule A549, trattate con KBrO 3 ( A), livelli o 8-oxo-dGuo nel DNA dalla milza di topi trattati DBC (B). Stelle (*) indicano significatività statistica (p &lt;0.05, Analisi a senso unico della varianza (ANOVA) (A), test t (B)). Mezzi di tre (A) o cinque (B) esperimenti indipendenti ± errore standard della media sono mostrati. I campioni sono stati raccolti 4 o 24 ore dopo il trattamento di 3 giorni. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fase mobile </td><td> Tampone fosfato Na 50,0 mM, pH 6,2, contenente il 6% MeOH e KCl 2,0 mM </td></tr><tr><td> Portata Fase mobile </td><td> 1,0 ml / min </td></tr><tr><td> Tipo di colonna </td><td> YMC-BASIC con legante silice sferica </td></tr><tr><td> Lunghezza Colonna </td><td> 15 centimetri </td></tr><tr><td> Diametro interno della colonna </td><td> 3,5 millimetri </td></tr><tr><td> Temperatura della colonna </td><td> 35 ° C </td></tr><tr><td> Temperatura Detector </td><td> 29 ° C </td></tr><tr><td> Impostazione della tensione per l&#39;8-oxo-dGuo </td><td> +0,5 V </td></tr><tr><td> Impostazione della tensione per dGuo </td><td> +0,9 V </td></tr><tr><td> Volume di iniezione </td><td> 10,0 ml </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Parametri di strumenti per il rilevamento e la quantificazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> mmoli </td><td> 100 di serie nM, ul </td><td> Fase mobile per HPLC, ul </td><td> Diluizione, piega </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 300 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2.5 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 60 </td><td> 240 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 0.5 </td><td> 30 </td><td> 270 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 0.25 </td><td> 15 </td><td> 285 </td><td> 20 </td></tr><tr><td> 0.1 </td><td> 6 </td><td> 294 </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> Tabella 2. &lt;/ Strong&gt; Preparazione della curva standard per dGuo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> fmoles </td><td> 250 di serie nM, ul </td><td> Fase mobile per HPLC, ul </td><td> Diluizione, piega </td></tr><tr><td> 2.500 </td><td> 300 </td><td> 0 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 1.000 </td><td> 120 </td><td> 180 </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> 500 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> 250 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 100 </td><td> 120 </td><td> 180 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 150 </td><td> 150 </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> Tabella 3. Preparazione della curva standard per 8-oxo-dGuo. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig8.jpg" /> Cenare<html> complementare Figura 1. Confronto di elettrochimica (CE) e la rilevazione a base di raggi UV di dGuo. Curva standard è stato creato per dGuo il rilevamento da parte di rilevamento elettrochimica (CE) o il rilevamento UV (260 nm). Aree di picco sono state integrate per dGuo picco a circa 4,7 minuti con entrambi i metodi. N = 3, significa ± deviazione standard sono mostrati. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52697/52697fig9.jpg" /> Figura complementare 2. Quantificazione di dGuo dalla curva standard. Un esempio dell&#39;uso di curva standard per determinare è indicata la concentrazione di dGuo. (A) dell&#39;area di picco può essere determinata mediante integrazione con software standard. (B) viene utilizzato Questa informazione per costruire una curva standard per utilizzare l&#39;equazione della linea per calcolare la concentrazione dell&#39;analita nel campione sconosciuto.52697 / 52697fig9large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

L&#39;obiettivo di questo protocollo è il rilevamento del marker dell&#39;ossidazione DNA, 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina (8-oxo-dGuo) mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali.

HPLC Misurazione del DNA ossidazione Biomarker, 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina, in colture cellulari e tessuti animali

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

26.2K Views.  Health Canada.  L'obiettivo di questo protocollo è il rilevamento del marker dell'ossidazione DNA, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo) mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali. 

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Steady-state, Pre-steady-state, and Single-turnover Kinetic Measurement for DNA Glycosylase Activity

Human 8-oxoguanine DNA glycosylase (OGG1) excises the mutagenic oxidative DNA lesion 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoG) from DNA. Kinetic characterization of OGG1 is undertaken to measure the rates of 8-oxoG excision and product release. When the OGG1 concentration is lower than substrate DNA, time courses of product formation are biphasic; a rapid exponential phase (i.e. burst) of product formation is followed by a linear steady-state phase. The initial burst of product formation corresponds to the concentration of enzyme properly engaged on the substrate, and the burst amplitude depends on the concentration of enzyme. The first-order rate constant of the burst corresponds to the intrinsic rate of 8-oxoG excision and the slower steady-state rate measures the rate of product release (product DNA dissociation rate constant, koff). Here, we describe steady-state, pre-steady-state, and single-turnover approaches to isolate and measure specific steps during OGG1 catalytic cycling. A fluorescent labeled lesion-containing oligonucleotide and purified OGG1 are used to facilitate precise kinetic measurements. Since low enzyme concentrations are used to make steady-state measurements, manual mixing of reagents and quenching of the reaction can be performed to ascertain the steady-state rate (koff). Additionally, extrapolation of the steady-state rate to a point on the ordinate at zero time indicates that a burst of product formation occurred during the first turnover (i.e. y-intercept is positive). The first-order rate constant of the exponential burst phase can be measured using a rapid mixing and quenching technique that examines the amount of product formed at short time intervals (&lt;1 sec) before the steady-state phase and corresponds to the rate of 8-oxoG excision (i.e. chemistry). The chemical step can also be measured using a single-turnover approach where catalytic cycling is prevented by saturating substrate DNA with enzyme (E&gt;S). These approaches can measure elementary rate constants that influence the efficiency of removal of a DNA lesion.

Time courses for the glycosylase activity of 8-oxoguanine DNA glycosylase are biphasic exhibiting a burst of product formation and a linear steady-state phase. Utilizing quench-flow techniques, the burst and the steady-state rates can be measured, which correspond to excision of 8-oxoguanine and release of the glycosylase from the product DNA, respectively.

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

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DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

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We present here a protocol to construct and validate models for nondestructive prediction of total sugar, total organic acid, and total anthocyanin content in individual blueberries by near-infrared spectroscopy.

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Fabbricazione e collaudo di termometri fotonici

In recent years, a push for developing novel silicon photonic devices for telecommunications has generated a vast knowledge base that is now being ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

Districante fibre di aramide copolimero ad alta resistenza per consentire la determinazione delle loro proprietà meccaniche

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

HPLC Misurazione del DNA ossidazione Biomarker, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina, in colture cellulari e tessuti animali

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

Costruzione di modelli per la previsione non distruttivo di principio Contenuti di mirtilli mediante spettroscopia nel vicino infrarosso Sulla base di HPLC Misure

HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Sintesi di proteine bioconiugati

Determinare la composizione chimica di inibitore di corrosione Interfacce / metallo con XPS: Minimizzare post immersione Ossidazione

Fabbricazione e collaudo di termometri fotonici

Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Districante fibre di aramide copolimero ad alta resistenza per consentire la determinazione delle loro proprietà meccaniche

HPLC Misurazione del DNA ossidazione Biomarker, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina, in colture cellulari e tessuti animali

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Allo steady-state, Pre-steady-state, e Single-fatturato di misura cinetica per il DNA Glycosylase Activity

Pieghevole e caratterizzazione di un robot bio-reattiva da origami di DNA

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HPLC-based test per monitorare extracellulare Nucleotide / nucleosidici metabolismo in cronica cellule umane leucemia linfocitica

Sintesi di proteine ​​bioconiugati

Determinare la composizione chimica di inibitore di corrosione Interfacce / metallo con XPS: Minimizzare post immersione Ossidazione

Fabbricazione e collaudo di termometri fotonici

Misura simultanea di HDAC1 e HDAC6 attività in HeLa Cells utilizzando UHPLC-MS

DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Districante fibre di aramide copolimero ad alta resistenza per consentire la determinazione delle loro proprietà meccaniche

Sintesi di proteine bioconiugati