Questa ricerca è stata finanziata dal Canada Genomics di Ricerca e Sviluppo Health Initiative (GRDI) e la strategia di regolamentazione canadese per la biotecnologia (CRSB). Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi.

<ol>
	<li>Helbock, H. J., Beckman, K. B., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+oxidation+matters:+The+HPLC-electrochemical+assay+of+8-oxo-deoxyguianosine+and+8-oxo-guanine.">DNA oxidation matters: The HPLC-electrochemical assay of 8-oxo-deoxyguianosine and 8-oxo-guanine.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (1), 288-293 (1998).</li><li>Valavanidis, A., Vlachogianni, T., Fiotakis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=8-hydroxy-2'+-deoxyguanosine+(8-OHdG):+A+critical+biomarker+of+oxidative+stress+and+carcinogenesis.">8-hydroxy-2' -deoxyguanosine (8-OHdG): A critical biomarker of oxidative stress and carcinogenesis.</a> J. Environ. Sci Health C Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 27 (2), 120-139 (2009).</li><li>Cadet, J., Bellon, S., Douki, T., Frelon, S., Gasparutto, D., Muller, E., Pouget, J. P., Ravanat, J. L., Romieu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage:+formation,+measurement,+and+biochemical+features.">Radiation-induced DNA damage: formation, measurement, and biochemical features.</a> J Environ Pathol Toxicol Oncol. 23 (1), 23-23 (2004).</li><li>Weiss, J. M., Goode, E. L., Ladiges, W. C., Ulrich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphic+variation+in+hOGG1+and+risk+of+cancer:+a+review+of+the+functional+and+epidemiologic+literature.">Polymorphic variation in hOGG1 and risk of cancer: a review of the functional and epidemiologic literature.</a> Mol. Carcinog. 42 (3), 127-141 (2005).</li><li>Culp, S. J., Cho, B. P., Kadlubar, F. F., Evans, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+Conformational+Analyses+of+8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.">Structural and Conformational Analyses of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine.</a> Chem. Res. Toxicol. 2 (6), 416-422 (1989).</li><li>Cooke, M. S., Loft, S., Olinski, R., Evans, M. D., Bialkowski, K., Wagner, J. R., Dedon, P. C., M&#248;ller, P., Greenberg, M. M., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+standardized+description+of+and+nomenclature+concerning+oxidatively+damaged+nucleobases+in+DNA.">Recommendations for standardized description of and nomenclature concerning oxidatively damaged nucleobases in DNA.</a> Chem. Res. Toxicol. 23 (4), 705-707 (2010).</li><li>Jang, Y. H., Goddard, W. A. 3. r. d., Noyes, K. T., Sowers, L. C., Hwang, S., Chung, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+principles+calculations+of+the+tautomers+and+pKa+values+of+8-oxoguanine:+implications+for+mutagenicity+and+repair.">First principles calculations of the tautomers and pKa values of 8-oxoguanine: implications for mutagenicity and repair.</a> Chem. Res. Toxicol. 15 (8), 1023-1035 (2002).</li><li>Park, J. -. H., Gopishetty, S., Szewczuk, L. M., Troxel, A. B., Harvey, R. G., Penning, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+(8-oxo-dGuo)+by+PAH+o-quinones:+involvement+of+reactive+oxygen+species+and+copper(ii)/copper(i)+redox+cycling.">Formation of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo) by PAH o-quinones: involvement of reactive oxygen species and copper(ii)/copper(i) redox cycling.</a> Chem. Res. Toxicol. 18 (6), 1026-1037 (2005).</li><li>Mangal, D., Vudathala, D., Park, J. H., Lee, S. H., Penning, T. M., Blair, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+during+oxidative+stress.">Analysis of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine in cellular DNA during oxidative stress.</a> Chem. Res. Toxicol. 22 (5), 788-797 (2009).</li><li>Ravanat, J. L., Douki, T., Duez, P., Gremaud, E., Herbert, K., Hofer, T., Lasserre, L., Saint-Pierre, C., Favier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+background+level+of+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine:+an+isotope+based+method+to+evaluate+artefactual+oxidation+of+DNA+during+its+extraction+and+subsequent+work-up.">Cellular background level of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine: an isotope based method to evaluate artefactual oxidation of DNA during its extraction and subsequent work-up.</a> Carcinogenesis. 23 (11), 1911-1918 (2002).</li><li>Gossen, J. A., De Leeuw, W. J. F., Tan, C. H. T., Zwarthoff, E. C., Berends, F., Lohman, P. H. M., Knook, D. L., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+rescue+of+integrated+shuttle+vectors+from+transgenic+mice:+A+model+for+studying+mutations+in+vivo.">Efficient rescue of integrated shuttle vectors from transgenic mice: A model for studying mutations in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (20), 7971-7975 (1989).</li><li>Van Campen, L. E., Murphy, W. J., Franks, J. R., Mathias, P. I., Toraason, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+DNA+damage+is+associated+with+intense+noise+exposure+in+the+rat.">Oxidative DNA damage is associated with intense noise exposure in the rat.</a> Hear Res. 164 (1-2), 164-161 (2002).</li><li>European Standards Committee on Oxidative DNA Damage (ESCODD). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+DNA+oxidation+in+human+cells+by+chromatographic+and+enzymic+methods.">Measurement of DNA oxidation in human cells by chromatographic and enzymic methods.</a> Free Radic. Biol. Med. 34 (8), 1089-1099 (2003).</li><li>Rebelo, I. A., Piedade, J. A., Oliveira-Brett, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+HPLC+method+with+electrochemical+detection+of+femtomoles+of+8-oxo-7,8-dihydroguanine+and+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+in+the+presence+of+uric+acid.">Development of an HPLC method with electrochemical detection of femtomoles of 8-oxo-7,8-dihydroguanine and 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in the presence of uric acid.</a> Talanta. 63 (2), 323-331 (2004).</li><li>Ravanat, J. -. L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J., Stadler, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+8-oxoguanine+in+DNA+by+gas+chromatography-mass+spectrometry+and+HPLC-electrochemical+detection:+overestimation+of+the+background+level+of+the+oxidized+base+by+the+gas+chromatography-mass+spectrometry+assay.">Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography-mass spectrometry and HPLC-electrochemical detection: overestimation of the background level of the oxidized base by the gas chromatography-mass spectrometry assay.</a> Chem. Res. Toxicol. 8 (8), 1039-1045 (1995).</li><li>Kawanishi, S., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+DNA+damage+induced+by+bromate+differs+from+general+types+of+oxidative+stress.">Mechanism of DNA damage induced by bromate differs from general types of oxidative stress.</a> Toxicology. 221 (2-3), 172-178 (2006).</li><li>Tahara, S., Kaneko, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+mouse+splenic+cells+to+oxidative+DNA+damage+by+x-ray+irradiation.">Susceptibility of mouse splenic cells to oxidative DNA damage by x-ray irradiation.</a> Biol. Pharm. Bull. 27 (1), 105-108 (2004).</li><li>Garratt, L. W., Mistry, V., Singh, R., Sandhu, J. K., Sheil, B., Cooke, M. S., Sly, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+urinary+8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine+is+adversely+affected+by+methodological+inaccuracies+when+using+a+commercial+ELISA.">Interpretation of urinary 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine is adversely affected by methodological inaccuracies when using a commercial ELISA.</a> Free Radic. Biol. Med. 48 (11), 1460-1464 (2012).</li><li>Cooke, M. S., Collins, A., Olinski, R., Rozalski, R., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harmonising+measurements+of+8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine+in+cellular+DNA+and+urine.">Harmonising measurements of 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8242;-deoxyguanosine in cellular DNA and urine.</a> Free Radic. Res. 46 (4), 541-553 (2012).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+oxidatively+generated+base+damage+in+cellular+DNA.">Measurement of oxidatively generated base damage in cellular DNA.</a> Mutat Res. 711 (1-2), 3-12 (2011).</li><li>Chomczynski, P., Mackey, K., Drews, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAzol:+a+reagent+for+the+rapid+isolation+of+genomic+DNA.">DNAzol: a reagent for the rapid isolation of genomic DNA.</a> Biotechniques. 22 (3), 550-553 (1997).</li><li>Collins, A. R., Cadet, J., M&#246;ller, L., Poulsen, H. E., Vi&#241;a, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+sure+we+know+how+to+measure+8-oxo-7,8-dihydroguanine+in+DNA+from+human+cells.">Are we sure we know how to measure 8-oxo-7,8-dihydroguanine in DNA from human cells.</a> Arch Biochem Biophys. 423 (1), 57-65 (2004).</li><li>Badouard, C., M&#233;n&#233;zo, Y., Panteix, G., Ravanat, J. L., Douki, T., Cadet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+new+types+of+DNA+lesions+in+human+sperm.">Determination of new types of DNA lesions in human sperm.</a> Zygote. 16 (1), 9-13 (2008).</li><li>Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Ravanat, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+damage+to+DNA:+formation,+measurement+and+biochemical+features.">Oxidative damage to DNA: formation, measurement and biochemical features.</a> Mutat Res. 531 (1-2), 1-2 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Validation of analytical procedures: text and methodology Q2(R1). , (2015).</li></ol>

No conflict of interest or competing financial interests declared.

Anche se a 8-oxo-dGuo &#39;stato segnalato come un utile biomarcatore di ossidazione del DNA, la sua quantificazione affidabile può rappresentare una sfida. Anche se esistono diversi metodi pubblicati, vi è la necessità di un approccio globale, panoramica descrittiva di protocollo per consentire ai ricercatori di implementare il metodo nei loro laboratori. Qui vi presentiamo una panoramica dettagliata di un protocollo basato su HPLC che permetterà ai nuovi utenti di stabilire un metodo efficace per il rilevamento a ...

Specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), i cui livelli di stato stazionario può aumentare durante molte condizioni patologiche e metabolismo xenotoxic, contribuiscono ad una maggiore frequenza di danno ossidativo al DNA. Tra diverse possibili basi azotate prodotti di ossidazione, danno ossidativo del DNA può essere facilmente misurata utilizzando il marcatore stabile 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina (8-oxo-dGuo), che è una delle forme ossidate di 2 &#39; -deoxyguanosine (dGuo) 1. 8-oxo-dGuo è il più abbondante lesione DNA 2 e, di conseguenza, è stato studiato per maggiore dettaglio come biomarker di ossidazione DNA nonostante l&#39;esistenza di DNA multiple prodotti di ossidazione 3. Negli esseri umani, questo danno può essere riparato con la base di riparazione per escissione dell&#39;8-oxoguanine glicosilasi 1 (hOGG1) 4. Se lasciato non riparata, 8-oxo-dGuo può contribuire alla formazione di base di mutazioni coppia-di sostituzione (cioè, G a T trasversioni) 4. È importante sottolineare che, a 8-oxo-dGuo è un marcatore consolidata for danni al DNA in relazione alla iniziazione e promozione di carcinogenesi 2. Pertanto, la quantificazione precisa di 8-oxo-dGuo è un biomarker utile e desiderabile di danno ossidativo del DNA 5. C&#39;è confusione diffusa nella letteratura per quanto riguarda i nomi corretti per i moduli ossidativamente-danneggiati di 2-deossiguanosina e, inoltre, il nome corretto del composto (s) di routine misurato come biomarker di danno ossidativo del DNA 6. I 6,8-dicheto e 6-enolica, 8-cheto forme tautomere di 8-oxo-dGuo (illustrata nella figura 1) sono i due tautomeri più importanti discussi in letteratura 5,7. La forma 6,8-dicheto è la forma più prominente a pH fisiologico di 7,4, ed è il più importante prodotto di ossidazione DNA 7. Pertanto, 8-oxo-dGuo, piuttosto che a 8-idrossi-dGuo è il nome più appropriato per questo prodotto di ossidazione 6. E &#39;anche importante notare che il 2-deossiguanosina (dGuo), piuttosto che nucleobase guanina (Gua) o guanosina ribonucleosidi (Guo), rispettivamente, viene rilevato dalla maggior parte dei metodi di 6. La rilevazione accurata e la quantificazione di 8-oxo-dGuo è difficile a causa: i) la variabilità nella digestione del campione di DNA, ii) ossidazione accidentale di dGuo a 8-oxo-dGuo che può verificarsi durante la preparazione del campione, e iii) la necessità per la convalida efficace del metodo HPLC-ED analitica 8. In questo protocollo, abbiamo puntato a raggiungere i) offrendo condizioni favorevoli, per la completa digestione del DNA e ii) da parte del chelante inclusione metallo e soluzioni ferrochelanti trattati e un DNA di isolamento speciale reagente, mentre iii) solo parzialmente affrontati dalla inclusione di controlli positivi e fornendo in tal modo che il metodo è in grado di rilevare 8-oxo-dGuo in campioni biologici. Ulteriore convalida va oltre lo scopo di questo articolo. Tuttavia, siamo fiduciosi che questo protocollo aiuterà il futuroutenti di determinare la misura in cui essi devono convalidare formalmente il protocollo, a seconda dei loro fini. Un elenco di passi necessari per la validazione formale del metodo è fornito ulteriormente. Durante lo sviluppo e la diffusione di un metodo di rilevazione a 8-oxo-dGuo, metodi pubblicati sono stati rivisti e consolidati. Così, questo metodo elimina la necessità di raccogliere informazioni da diverse fonti pubblicati che spesso mancano di importanti dettagli sperimentali fornendo allo stesso tempo mezzi rapidi e semplici di test, se è stato adottato il metodo per l&#39;individuazione e la quantificazione di 8-oxo-dGuo con successo. Questo metodo adatto è stato impiegato con successo per analizzare campioni di DNA da cellule in coltura e tessuti murino. Questo articolo video aiuterà altri gruppi a stabilire un metodo efficace per un rilevamento affidabile e quantificazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-ED.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>8-oxo-dGuo standard</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>89320</td>
			<td>Inappropriately referred to as &#34;8-hydroxy-2&#39;-deoxy Guanosine&#34; - see Fig. 1 and text for details</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5931</td>
			<td>From E.coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Chelates heavy metals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desferoxamine mesylate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dGuo standard</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA from salmon sperm</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1626</td>
			<td>Sodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4527</td>
			<td>TypeII, from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAzol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10503-27</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4884</td>
			<td>The compound would not completely dissolve until solution pH is adjusted to 8.0 with e.g. NaOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12-K media</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal bovine serum</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guard column</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 0204GC</td>
			<td>Protects colum from contamination; may also lead to pressure build-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic sodium phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphodiesterase I enzyme&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3243</td>
			<td>Type II from Crotalus adamaneus venom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon homogenizer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>7724T-1 or 7724T-5 for 1 or 5 mL, respectively</td>
			<td>Volume (holding capacity) depends on the amount of sample to be processed.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15050-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YMC-BASIC column with bonded spherical silica</td>
			<td>Chromatographic Specialties</td>
			<td>YBA 99S03 1546WT</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hplc measurement of the dna oxidation biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in cultured cells and animal tissues

Lo stress ossidativo è associato con molti processi fisiologici e patologici, nonché metabolismo xenobiotico, porta alla ossidazione di Biomacromolecules, compreso il DNA. Pertanto, la rilevazione efficiente di ossidazione del DNA è importante per una varietà di discipline di ricerca, tra cui la medicina e tossicologia. Un biomarcatore comune di DNA ossidativo danneggiato è di 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina (8-oxo-dGuo; spesso erroneamente indicato come 8-idrossi-2&#39;-deossiguanosina (8-OH-dGuo o 8 -oxo-dG)). Sono stati descritti diversi protocolli per 8-oxo-dGuo misurazione ad alta pressione cromatografia liquida con rivelazione elettrochimica (HPLC-ED). Tuttavia, questi sono stati applicati principalmente DNA purificato trattati con pro-ossidanti. Inoltre, a causa delle differenze metodologiche tra laboratori, principalmente a causa delle differenze di allestimento di analisi, l&#39;adozione di metodi pubblicati per il rilevamento di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE richiede un&#39;attenta ottimizzazione da ciascun laboratorio. Laprotocollo, descrivendo un tale processo di ottimizzazione, è carente. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per la rilevazione di 8-oxo-dGuo mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali. Esso illustra come preparazione del campione di DNA può essere facilmente e rapidamente ottimizzato per minimizzare indesiderabile ossidazione DNA che può verificarsi durante la loro preparazione. Questo protocollo mostra come rilevare 8-oxo-dGuo in cellule coltivate umane adenocarcinoma alveolare (cioè cellule A549) trattati con l&#39;agente ossidante KBrO 3, e dalla milza di topi esposti al dibenzo idrocarburi aromatici policiclici (DEF, p) crisene (DBC, precedentemente noto come dibenzo (a, l) pirene, Dalp). Nel complesso, questo lavoro illustra come un metodo HPLC-ED può essere facilmente ottimizzato per il rilevamento di 8-oxo-dGuo in campioni biologici.

dGuo stato osservato per avere un tempo di ritenzione di 4,7 min, mentre 8-oxo-dGuo aveva un tempo di ritenzione di circa 6,4 min (Figura 2A e B). Vi è circa 1.000 volte differenza nelle altezze tra i due analiti, come si vede nella Figura 2C. Voltammograms per 8-oxo-dGuo e dGuo stati ottenuti per gli standard che funzionano a potenziale lavorativo nell&#39;intervallo 0,2-1,1 V. Il potenziale di lavoro ottimale per 8-oxo-dGuo è risultata di +0,5 V e +0,9 V per dGuo <s...

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HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&amp;#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

L&#39;obiettivo di questo protocollo è il rilevamento del marker dell&#39;ossidazione DNA, 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina (8-oxo-dGuo) mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali.

HPLC Misurazione del DNA ossidazione Biomarker, 8-oxo-7,8-diidro-2&#39;-deossiguanosina, in colture cellulari e tessuti animali

Oxidative stress is associated with many physiological and pathological processes, as well as xenobiotic metabolism, leading to the oxidation of ...

hplc-measurement-dna-oxidation-biomarker-8-oxo-78-dihydro-2

Research

JoVE Journal

Chemistry

HPLC Measurement of the DNA Oxidation Biomarker, 8-oxo-7,8-dihydro-2&#8217;-deoxyguanosine, in Cultured Cells and Animal Tissues

26.1K Views.  Health Canada.  L'obiettivo di questo protocollo è il rilevamento del marker dell'ossidazione DNA, 8-oxo-7,8-diidro-2'-deossiguanosina (8-oxo-dGuo) mediante HPLC-DE, DNA da cellule o tessuti animali. 