Name: isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes
Uploaded: 2017-10-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
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Gli autori ringraziano Nadine Woitasky e Peter Volk per assistenza tecnica. Inoltre, gli autori ringraziano la signora Claudia Lorenz (scrittore medico, ACCEDIS) per il suo aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo manoscritto è stato sostenuto finanziariamente da DFG (Schlu 324/7-1).

l'indagine è condotta secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato da la US National Institute of Health (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). In generale, ratti maschii di wistar invecchiati 3-4 mesi e con un peso medio di 250-350 g vengono utilizzati per questo protocollo. Un cuore di ratto è sufficiente per 20 piastre di coltura (1 mL per ogni piatto; diametro interno: 35 mm) con una densità approssimativa delle cellule di 1.5 x 10 4 cellule/1000 millimetri 2.
 1. preparazione dei terreni e reagenti <ol><li>Creatina-Carnitina-taurina medio (medio CCT) Nota: CCT medium è un mezzo complesso basato su medium 199 con l'aggiunta di creatina, carnitina e taurina.
	<ol><li>Preparare 1 L di medium 199: aggiungere 3,6 g Hepes e mescolare per 1 h. Quindi aggiungere 655,5 mg creatina (5 mM), carnitina 395,4 mg (2 mM) e taurina 625,5 mg (5 mM). Carnitina e taurina cambiare pH a &#60; 7. Al fine di inibire la crescita di cellule contaminanti, ad es. cellule endoteliali o fibroblasti, aggiungere 10 µM citosina β-D-arabinofuranoside al mezzo. Regolare il pH con NaOH (2 mM) per filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il mezzo CCT a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Medio di Powell <ol><li>per 1 medio L Powell, sciogliere 6,43 g NaCl (110 mM) con 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) e 1,98 g D (+ )-Glucosio monoidrato (10 mM) in Aqua sterile. Regolare il pH con NaOH (2 M) al filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il medium Powell a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Cloruro di calcio (CaCl 2) <ol><li>preparare una soluzione di 100 mM CaCl 2 (50 mL) e preparare aliquote contenente 500 µ l CaCl 2. Congelare aliquote a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione del terreno di coltura <ol><li>preparare tre cellule di coltura: pre-placcatura medie, medie di placcatura e lavaggio medio. Utilizzo medio CCT come base per tutti i tre Medium (tabella 1). Calcolare medie CCT con 1 mL / piastra di coltura. Quindi, preparare 20 mL di terreno di CCT per 20 piastre di coltura (diametro interno: 35 mm).</li>
		<li>Cella cultura piastre: cappotto ogni piastra di coltura delle cellule (diametro interno: 35 mm) con 1 mL pre-placcatura medio. Conservare le piastre a 37 ° C durante la notte o per almeno 2 h prima dell'uso.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isolamento di cardiomiociti adulti <ol><li>sistema di perfusione di preparazione di Langendorff <ol><li>di calore medio di placcatura e lavaggio medio a 37 ° C. scongelare un tubo di 500 µ l CaCl 2 e pesare 25 mg di collagenasi.</li>
		<li>A filo il sistema di perfusione di Langendorff con aqua sterile, lasciate in seguito medio di Powell circolare del sistema per 5 min.</li>
		<li>Riempire il sistema di perfusione di Langendorff con 80 mL di mezzo di Powell senza qualsiasi aria bolle e gas il mezzo con 95% di ossigeno.</li>
		<li>Preparare una provetta (50 mL) con 40 mL di mezzo di Powell, riscaldare fino a 37 ° C e gas con 95% di ossigeno.</li>
		<li>Preparare un filo di circa 25 cm di lunghezza per il collegamento di cuore rimosso alla cannula.</li>
		<li>Sgrassare una lama di rasoio con alcool (70% in volume) e fissarlo all'elicottero. Fissare un disco di plastica nel chopper.</li>
	</ol></li> <li>Estrazione del cuore <ol><li>anestetizzare un ratto wistar maschio con 4-5% isoflurane e sacrificalo con dislocazione cervicale. Aprire l'addome dietro l'arco costale con un taglio addominale e, con lo stesso paio di forbici, tagliare attraverso il diaframma per aprire la cassa toracica.</li>
		<li>Rimuovere il cuore, insieme con il polmone e timo, tagliando sopra il timo altamente cranico nella cavità toracica. Trasferire il materiale a soluzione salina ghiacciata immediatamente.</li>
		<li>Rimuovere il polmone e timo dal cuore con una forbice per dissezione (grande) e di fissazione del materiale con il forcipe capsula, trasferire a quest'ultimo a una nuova soluzione salina.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento <ol><li>rimuovere il tessuto in eccesso, come residui di timo, della trachea, grasso e tessuto connettivo dal cuore utilizzando capsule pinze e forbici per dissezione (grandi o piccole). Scoprire l'aorta e si divide con una forbice per dissezione (grande o piccola) tra il primo e in secondo luogo branchial Arch.</li>
		<li>Avviare il gocciolamento dell'apparato di aspersione di Langendorff. Posto nel cuore della cannula dell'apparato di aspersione di Langendorff e fissare lo sguardo in primo luogo con un morsetto a coccodrillo e successivamente con il thread pronto. Sciacquare il cuore fino a quando non è priva di sangue.</li>
		<li>Sciogliere 25 mg collagenasi in 5-6 mL di liquido caldo di Powell e aggiungere 12,5 µ l CaCl 2 (30 µM).</li>
		<li>Chiudere circolazione spostando un imbuto di vetro, che è collegato con il sistema di perfusione di Langendorff, sopra il cuore di gocciolamento e aggiungere la collagenosi risolto per il sistema di perfusione. Iniziare la perfusione per 25 min con una velocità di discesa di 1 goccia al secondo. 
		Nota: Durante l'aspersione, il cuore si gonfiano e ottenere un aspetto ceroso.</li>
		<li>Interrompere la perfusione dopo 25 min e togliere il cuore del sistema di aspersione di Langendorff. Rimuovere l'aorta, atrii e tessuto connettivo dal cuore e aprire i ventricoli destro e sinistro.</li>
		<li>Tritare il cuore due volte ad un angolo di 90° (larghezza di taglio: mm 0,7; velocità: 0,15 cm/s). Ripetere questo processo manualmente con due bisturi per 10 s ogni lato.</li>
		<li>Trasferire 12 mL di terreno di aspersione in una nuova provetta (50 mL). Versare i residui delle cellule in queste cellule medie e digest per altri cinque minuti a 37 ° C. Mix la soluzione ogni minuto.</li>
		<li>Filtrare la soluzione con il cuore digerito attraverso una rete di nylon (200 µm) in una nuova provetta (50ml).</li>
		<li>Centrifugare la soluzione filtrata a 29 x g per 3 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL di terreno caldo Powell cui 12,5 µ l CaCl 2 (250 µM) per il pellet cellulare. Risospendere il pellet attraverso movimenti di agitazione. Centrifugare nuovamente a 29 x g per 2 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL caldo medio Powell sostituito con 25 µ l CaCl 2 (500 µM). Sciogliere il pellet cellulare attraverso delicati movimenti di agitazione e aggiungere 12 mL caldo Powell media tra cui 120 µ l CaCl 2 (1 mM). Centrifuga per la terza volta a 16 x g per 1 min. Ancora una volta, rimuovere il sopranatante.</li>
		<li>Mescolare il pellet cellulare con il mezzo di placcatura preriscaldata.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di pre-placcatura da piastre di coltura. Trasferire 1 mL di mezzo, compresi i cardiomiociti isolati, per ogni piastra di coltura di placcatura. Incubare i cardiomiociti isolati freschi a 37 ° C per 1 h.</li>
		<li>Togliere la soluzione di placcatura da piastre di coltura. Aggiungere 1 mL di media per ogni piastra di coltura di lavaggio e memorizzare le piastre a 37 ° C fino a sei giorni senza cambiare mezzo.</li>
		<li>Per indagare l'influenza di diverse sostanze chimiche e trattamenti su ARVC, prima di aggiornare placcatura media media di lavaggio e successivamente aggiungendo diverse sostanze chimiche. 
		Nota: Valutazione con microscopia chiara: con ogni preparazione delle cellule, devono essere monitorati cardiomyocytes 150 a 300 al giorno da microscopia chiara. Suddividere tutti contati cardiomiociti in gruppi secondo il loro aspetto (ad es., &#34; asta-a forma di &#34;, &#34; arrotondare per difetto &#34;, &#34; diffusione &#34;, e &#34; apparenza insolita &#34;). La categoria &#34; diffusione &#34; include tutti i cardiomiociti con pseudopodi-come le strutture. &#34; Apparenza insolita &#34; comprende tutti i ARVC con una superficie irregolare e non rilevabile membrana cellulare intatta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Esempio Esperimenti <ol><li>fluorescenza/immunofluorescenza di cardiomiociti adulti <ol><li>analizza le conversioni morfologiche e strutturale di ARVC durante la coltivazione da microscopia laser confocale. Utilizzare falloidina-TRITC per indagare strutture di F-actina in &#34; asta-a forma di &#34;, &#34; arrotondare per difetto &#34;, e &#34; diffusione &#34; ARVC. Eseguire la colorazione secondo il produttore &#39; protocollo s. Un esempio per la colorazione falloidina-TRITC è dato in riferimento Nippert et al. 11. con fluorescenza/immunofluorescenza, differenze in differentiation de e re dell'apparato contrattile nei cardiomyocytes coltivati adulto tra trattamenti sperimentali (ad es., con Swiprosin-1, Ionomicina) possono essere investigate.</li>
	</ol></li> <li>Real-Time RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) <ol><li>eseguire qRT-PCR per studiare i cambiamenti nell'espressione di mRNA di geni diversi (ad es., OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante la coltivazione di ARVC. Per dimensione del campione sufficiente, utilizzare piastre di coltura più grandi (diametro interno: 60 mm) con 2 mL di volume. ARVC di cinque piatti di cultura produce un campione. Eseguire l'isolamento di mRNA e la trasformazione del cDNA secondo il produttore &#39; protocollo s.</li>
	</ol></li> <li>Tecniche Immunoblot <ol><li>eseguire Western Blots per studiare i cambiamenti nell'espressione della proteina (ad es., per Swiprosin-1) durante la coltivazione di ARVC. Utilizzare una piastra di coltura (1 mL) per esempio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. 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I risultati mostrati sono parte della tesi dottorale di Franziska Nippert.

Il comportamento di cardiomiociti adulti in vivo è influenzato da molte interazioni con altre cellule (ad es., neuroni, cellule endoteliali, fibroblasti, cellule infiammatorie) e il sincizio elettrico che formano1. Pertanto, studiare esclusivamente adattamento allo stress dei cardiomiociti adulti richiede l'isolamento e la coltura di ARVC. I principali effetti di isolare e coltivare ARVC sono: 1) disconnetterli dalla matrice extracellulare e contatti cellula-cellula; 2) eseguire...

Cardiomiociti adulti in vivo funziona come un sincizio elettrico basato su contatti cellula-cellula fra miociti. Inoltre, sono influenzati da celle adiacenti come fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali, neuroni e cellule infiammatorie1. Al fine di studiare la capacità dei cardiomiociti di adeguare la loro organizzazione intracellulare di alterate condizioni di carico, come si è visto durante l'ipertrofia cardiaca, che è un passo iniziale che porta a insufficienza cardiaca, l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC) sono necessario2,3,4. Storicamente, cardiomiociti in primo luogo sono stati isolati da pulcino embrionali cuori5,6. Pochi anni dopo, il primo isolamento di cardiomiociti terminalmente differenziati è stata descritta utilizzando calcio svuotamento7. Tuttavia, questi cardiomiociti adulti non erano calcio tollerante e non potevano essere usati per saggi funzionali. Infine, nel 1976 un nuovo protocollo abilitato Powell e Twist per indagare su cardiomiociti adulti ventricolari sotto condizioni fisiologiche8. Come primo passo, hanno isolato cardiomiociti adulti sotto le concentrazioni basse del calcio e calcio in seguito aumentato a concentrazioni fisiologiche in una procedura graduale. Oggi, maggior parte dei protocolli per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti lavoro con questo protocollo di calcio e utilizzare collagenasi per la digestione enzimatica della cellula-cellula densa contatti1.
Per una coltivazione di successo, è necessario il siero fetale di vitello (FCS) o oncostatin M (OSM). ARVC eseguire un de - e re - differentiation con vasti cambiamenti strutturali tra cui sarcomero smontaggio e riforma9,10,11,12. Questo processo è accompagnato da una ri-espressione dei geni di tipo fetale, come β-miosina catena pesante (β-MHC), come noto da ipertrofia e una formazione di pseudopodi-come le strutture, anche chiamato diffusione4,11, 13. Inoltre, swiprosin-1 (EFHD2), una proteina di recente identificazione, svolge un ruolo importante nel processo di re-differenziazione di coltivato ARVC11. Di conseguenza, ARVC nella cultura trasformare nelle cellule polimorfiche, diffuse, che spontaneamente mostrano contrazioni dopo due o tre settimane nella cultura2,4,14.
Recenti scoperte hanno rivelato che cardiaco re e de differentiation come si verifica in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il rimodellamento cardiaco10,15. Rimodellamento cardiaco è un processo chiave durante malattie cardiache16. Come le malattie cardiache sono ancora la principale causa di morte nelle società industrializzate, una migliore comprensione della biologia dei cardiomiociti adulti è importante (OMS; 2015). Isolamento e coltura di ARVC può aiutare a sviluppare nuove strategie e medicinali per il trattamento delle malattie cardiache. Con questo manoscritto, un protocollo per l'isolamento e la coltura di ARVC è fornito. Inoltre, alcune parti critiche di questo metodo sono evidenziate nella sezione discussione.

<table><tbody><tr><td>Langendorff perfusion system</td><td>inhouse construction</td><td></td><td>double-walled with a water&lt;br/&gt; based heating system</td></tr><tr><td>Tissue chopper Mc Ilwain</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td><td>inhouse construction</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Abdominal shears</td><td>Aeskulap</td><td>BC772R</td><td></td></tr><tr><td>Capsule forceps</td><td>Eickemeyer</td><td>171307</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor large</td><td>Aeskulap</td><td>BC562R</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting scissor small</td><td>Aeskulap</td><td>BC163R</td><td></td></tr><tr><td>Mash with Polyamid</td><td>Neolab</td><td>4-1413</td><td>mash size 200 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>plastic disc</td><td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Typ II</td><td>Worthington</td><td>LS004177</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

In un cuore intatto, celle adiacenti influenzano cardiomiociti adulti. Con il metodo di isolamento e coltura dei cardiomiociti adulti, è possibile una valutazione dettagliata del comportamento di queste cellule nell'ambito di trattamenti specifici e di ambienti. Questo manoscritto presenta un protocollo per l'isolamento di successo e coltivazione dei cardiomyocytes ventricolari di ratto adulto (ARVC).
Il ratto è sacrificato dalla dislocazione cervicale sotto anestesia profonda. Quindi, viene estratto il cuore e l'aorta è scoperto. Successivamente, viene eseguita aspersione sul sistema di perfusione di Langendorff con deplezione di calcio e trattamento collagenasi. In seguito, tessuto ventricolare ottiene macinata, ricircolo e filtrata, seguita da tre fasi di centrifugazione con graduale aggiunta di CaCl2 finché non viene raggiunta la concentrazione fisiologica di calcio. ARVC sono placcati su piastre di coltura delle cellule. Dopo l'aggiornamento il mezzo di coltura cellulare, ARVC può essere coltivata fino a sei giorni senza cambiare il mezzo di coltura contenente siero. Isolamento di ARVC è un processo delicato di calcio. Piccoli cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio causano una diminuzione della qualità e la vitalità delle cellule isolate.
Appena isolato ARVC sono a forma di asta. Entro i primi giorni di coltivazione perdono l'asta-a forma di forma e morfologia pseudopodi-come le strutture (diffusione). Durante questa formazione morfologica ARVC degradare inizialmente loro elementi contrattili, seguite da una riforma attraverso fibre di actina stress e de novo sarcomerogenesis. Dopo una settimana di coltivazione, la maggior parte ARVC mostrano un aspetto diffuso con una striatura trasversale chiaramente rilevabile. Questo processo è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio, come il trattamento con ionomicina attenua la diffusione. Catena pesante β-miosina (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2) sono indicatori chiavi in questo processo di de - e re - differentiation. Studi recenti hanno suggerito che cardiaco re e de differentiation che si verificano in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il ritocco cardiaco. Di conseguenza, isolamento e coltura di ARVC gioca un ruolo chiave nella comprensione della biologia dei cardiomiociti.

Adulti cardiomiociti in coltura: La figura 1 Mostra una panoramica di recente isolate cardiomiociti adulti 2 h dopo l'ultimo lavaggio. Circa il 75% di tutti i cardiomiociti aveva una morfologia a forma di bastoncello. Il restante 25% ha mostrato un aspetto insolito con una morfologia rotonda e non rilevabile membrana intatta di cella (Figura 1). Alla fine della coltivazione (giorno 6), fino al 15% di tutti i card...

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Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

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Medicine

15.5K Views.  Justus Liebig University Giessen. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

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Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is difficult and time consuming. The most commonly used cells are neonatal rat cardiomyocytes (NRCMs), which require isolation every time cells are needed. The birth of the rats can be unpredictable. Cryopreservation is proposed to allow for cells to be stored until needed, yet freezing/thawing methods for primary cardiomyocytes are challenging due to the sensitivity of the cells. Using the proper cryoprotectant, dimethyl sulfoxide (DMSO), cryopreservation was achieved. By slowly extracting the DMSO while thawing the cells, cultures were obtained with viable NRCMs. NRCM phenotype was verified using immunocytochemistry staining for &#945;-sarcomeric actinin. In addition, cells also showed spontaneous contraction after several days in culture. Cell viability after thawing was acceptable at 40-60%. In spite of this, the methods outlined allow one to easily cryopreserve and thaw NRCMs. This gives researchers a greater amount of flexibility in planning experiments as well as reducing the use of animals.

The isolation of neonatal rat cardiomyocytes is a time consuming and unpredictable procedure. This study describes methods for cryopreservation and thawing of neonatal rat cardiomyocytes that allows for more efficient use of cells. The thawed NRCMs can be used for various experiments without the need for performing isolations each time.

Isolamento e Crioconservazione di neonatali Rat Cardiomyocytes

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

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Biologia dello sviluppo

Primary Culture of Adult Rat Heart Myocytes

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research. Nevertheless, establishment of robust, viable cultured adult myocytes can be a technically challenging, rate-limiting step for many researchers. Here we described a protocol to obtain a high yield of adult rat heart myocytes that remain viable in culture for several days. The heart is isolated and perfused with collagenase and protease under low Ca2+ conditions to recover single myocytes. Ca2+-tolerant cells are obtained by stepwise increases in extracellular Ca2+ concentration in three subsequent wash steps. Cells are filtered, resuspended in culture medium, and plated on laminin coated slips. Cultured myocytes obtained using this protocol are viable for up to four days and are suitable for most experiments including electrophysiology, biochemistry, imaging and molecular biology.

In this paper, we described a typical way to isolate and culture adult rat heart myocytes. Collagenase and protease are used to digest and isolate single myocytes. Myocytes cultured follow this protocol meet most experiment requirements.

Cultura primario di miociti adulti Cuore Rat

Cultured primary adult rodent heart cells are an important model system for cardiovascular research.  Nevertheless, establishment of robust, viable ...

Biologia

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

L&#39;isolamento e la manipolazione genetica di adulti miociti cardiaci per confocale Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Medicina

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular mechanisms of cardiovascular disease progression such as cardiac hypertrophy, fibrosis, and atherosclerosis. Although several attempts with variable success have been made to develop immortalized cell lines from the cardiovascular system to understand these cellular mechanisms, primary cells offer a more natural and close to in vivo environment for such studies. Therefore, different laboratories working on a particular cell type have developed protocols to isolate individual types of rat cardiac cells of interest. A protocol that allows the isolation of more than one cell type, however, is missing. Here an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation and enables their use for cellular analyses. This permits the most efficient use of available resources, which may save time and reduce research costs.

Several protocols have been developed and described for the isolation of different cardiac cell types from a rat heart. Here, an optimized protocol is described that allows the isolation of high-quality major cardiac cell types (cardiomyocytes, endothelial cells, and fibroblasts) from a single preparation, reducing the experimental costs.

Isolamento simultaneo di cardiomiociti di alta qualità, cellule endoteliali e fibroblasti da un cuore di ratto adulto

The rat is an important animal model used in cardiovascular research, and rat cardiac cells are used routinely for in vitro analysis of the molecular ...

Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

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