Gli autori ringraziano Nadine Woitasky e Peter Volk per assistenza tecnica. Inoltre, gli autori ringraziano la signora Claudia Lorenz (scrittore medico, ACCEDIS) per il suo aiuto nella preparazione del manoscritto. Questo manoscritto è stato sostenuto finanziariamente da DFG (Schlu 324/7-1).

l'indagine è condotta secondo la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato da la US National Institute of Health (NIH pubblicazione n. 85-23, rivisto 1996). In generale, ratti maschii di wistar invecchiati 3-4 mesi e con un peso medio di 250-350 g vengono utilizzati per questo protocollo. Un cuore di ratto è sufficiente per 20 piastre di coltura (1 mL per ogni piatto; diametro interno: 35 mm) con una densità approssimativa delle cellule di 1.5 x 10 4 cellule/1000 millimetri 2.
 1. preparazione dei terreni e reagenti <ol><li>Creatina-Carnitina-taurina medio (medio CCT) Nota: CCT medium è un mezzo complesso basato su medium 199 con l'aggiunta di creatina, carnitina e taurina.
	<ol><li>Preparare 1 L di medium 199: aggiungere 3,6 g Hepes e mescolare per 1 h. Quindi aggiungere 655,5 mg creatina (5 mM), carnitina 395,4 mg (2 mM) e taurina 625,5 mg (5 mM). Carnitina e taurina cambiare pH a &#60; 7. Al fine di inibire la crescita di cellule contaminanti, ad es. cellule endoteliali o fibroblasti, aggiungere 10 µM citosina β-D-arabinofuranoside al mezzo. Regolare il pH con NaOH (2 mM) per filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il mezzo CCT a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Medio di Powell <ol><li>per 1 medio L Powell, sciogliere 6,43 g NaCl (110 mM) con 0,19 g KCl (2,5 mM), 0,16 g KH 2 PO 4 (1,2 mM), 0,3 g MgSO 4 7 H 2 O (1,2 mM), 5,96 g Hepes (25 mM) e 1,98 g D (+ )-Glucosio monoidrato (10 mM) in Aqua sterile. Regolare il pH con NaOH (2 M) al filtro 7,4 e sterile il mezzo. Conservare il medium Powell a 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Cloruro di calcio (CaCl 2) <ol><li>preparare una soluzione di 100 mM CaCl 2 (50 mL) e preparare aliquote contenente 500 µ l CaCl 2. Congelare aliquote a -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparazione del terreno di coltura <ol><li>preparare tre cellule di coltura: pre-placcatura medie, medie di placcatura e lavaggio medio. Utilizzo medio CCT come base per tutti i tre Medium (tabella 1). Calcolare medie CCT con 1 mL / piastra di coltura. Quindi, preparare 20 mL di terreno di CCT per 20 piastre di coltura (diametro interno: 35 mm).</li>
		<li>Cella cultura piastre: cappotto ogni piastra di coltura delle cellule (diametro interno: 35 mm) con 1 mL pre-placcatura medio. Conservare le piastre a 37 ° C durante la notte o per almeno 2 h prima dell'uso.</li>
	</ol></li></ol> 2. Isolamento di cardiomiociti adulti <ol><li>sistema di perfusione di preparazione di Langendorff <ol><li>di calore medio di placcatura e lavaggio medio a 37 ° C. scongelare un tubo di 500 µ l CaCl 2 e pesare 25 mg di collagenasi.</li>
		<li>A filo il sistema di perfusione di Langendorff con aqua sterile, lasciate in seguito medio di Powell circolare del sistema per 5 min.</li>
		<li>Riempire il sistema di perfusione di Langendorff con 80 mL di mezzo di Powell senza qualsiasi aria bolle e gas il mezzo con 95% di ossigeno.</li>
		<li>Preparare una provetta (50 mL) con 40 mL di mezzo di Powell, riscaldare fino a 37 ° C e gas con 95% di ossigeno.</li>
		<li>Preparare un filo di circa 25 cm di lunghezza per il collegamento di cuore rimosso alla cannula.</li>
		<li>Sgrassare una lama di rasoio con alcool (70% in volume) e fissarlo all'elicottero. Fissare un disco di plastica nel chopper.</li>
	</ol></li> <li>Estrazione del cuore <ol><li>anestetizzare un ratto wistar maschio con 4-5% isoflurane e sacrificalo con dislocazione cervicale. Aprire l'addome dietro l'arco costale con un taglio addominale e, con lo stesso paio di forbici, tagliare attraverso il diaframma per aprire la cassa toracica.</li>
		<li>Rimuovere il cuore, insieme con il polmone e timo, tagliando sopra il timo altamente cranico nella cavità toracica. Trasferire il materiale a soluzione salina ghiacciata immediatamente.</li>
		<li>Rimuovere il polmone e timo dal cuore con una forbice per dissezione (grande) e di fissazione del materiale con il forcipe capsula, trasferire a quest'ultimo a una nuova soluzione salina.</li>
	</ol></li> <li>Isolamento <ol><li>rimuovere il tessuto in eccesso, come residui di timo, della trachea, grasso e tessuto connettivo dal cuore utilizzando capsule pinze e forbici per dissezione (grandi o piccole). Scoprire l'aorta e si divide con una forbice per dissezione (grande o piccola) tra il primo e in secondo luogo branchial Arch.</li>
		<li>Avviare il gocciolamento dell'apparato di aspersione di Langendorff. Posto nel cuore della cannula dell'apparato di aspersione di Langendorff e fissare lo sguardo in primo luogo con un morsetto a coccodrillo e successivamente con il thread pronto. Sciacquare il cuore fino a quando non è priva di sangue.</li>
		<li>Sciogliere 25 mg collagenasi in 5-6 mL di liquido caldo di Powell e aggiungere 12,5 µ l CaCl 2 (30 µM).</li>
		<li>Chiudere circolazione spostando un imbuto di vetro, che è collegato con il sistema di perfusione di Langendorff, sopra il cuore di gocciolamento e aggiungere la collagenosi risolto per il sistema di perfusione. Iniziare la perfusione per 25 min con una velocità di discesa di 1 goccia al secondo. 
		Nota: Durante l'aspersione, il cuore si gonfiano e ottenere un aspetto ceroso.</li>
		<li>Interrompere la perfusione dopo 25 min e togliere il cuore del sistema di aspersione di Langendorff. Rimuovere l'aorta, atrii e tessuto connettivo dal cuore e aprire i ventricoli destro e sinistro.</li>
		<li>Tritare il cuore due volte ad un angolo di 90° (larghezza di taglio: mm 0,7; velocità: 0,15 cm/s). Ripetere questo processo manualmente con due bisturi per 10 s ogni lato.</li>
		<li>Trasferire 12 mL di terreno di aspersione in una nuova provetta (50 mL). Versare i residui delle cellule in queste cellule medie e digest per altri cinque minuti a 37 ° C. Mix la soluzione ogni minuto.</li>
		<li>Filtrare la soluzione con il cuore digerito attraverso una rete di nylon (200 µm) in una nuova provetta (50ml).</li>
		<li>Centrifugare la soluzione filtrata a 29 x g per 3 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL di terreno caldo Powell cui 12,5 µ l CaCl 2 (250 µM) per il pellet cellulare. Risospendere il pellet attraverso movimenti di agitazione. Centrifugare nuovamente a 29 x g per 2 min. scartare il sopranatante e aggiungere 6 mL caldo medio Powell sostituito con 25 µ l CaCl 2 (500 µM). Sciogliere il pellet cellulare attraverso delicati movimenti di agitazione e aggiungere 12 mL caldo Powell media tra cui 120 µ l CaCl 2 (1 mM). Centrifuga per la terza volta a 16 x g per 1 min. Ancora una volta, rimuovere il sopranatante.</li>
		<li>Mescolare il pellet cellulare con il mezzo di placcatura preriscaldata.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di pre-placcatura da piastre di coltura. Trasferire 1 mL di mezzo, compresi i cardiomiociti isolati, per ogni piastra di coltura di placcatura. Incubare i cardiomiociti isolati freschi a 37 ° C per 1 h.</li>
		<li>Togliere la soluzione di placcatura da piastre di coltura. Aggiungere 1 mL di media per ogni piastra di coltura di lavaggio e memorizzare le piastre a 37 ° C fino a sei giorni senza cambiare mezzo.</li>
		<li>Per indagare l'influenza di diverse sostanze chimiche e trattamenti su ARVC, prima di aggiornare placcatura media media di lavaggio e successivamente aggiungendo diverse sostanze chimiche. 
		Nota: Valutazione con microscopia chiara: con ogni preparazione delle cellule, devono essere monitorati cardiomyocytes 150 a 300 al giorno da microscopia chiara. Suddividere tutti contati cardiomiociti in gruppi secondo il loro aspetto (ad es., &#34; asta-a forma di &#34;, &#34; arrotondare per difetto &#34;, &#34; diffusione &#34;, e &#34; apparenza insolita &#34;). La categoria &#34; diffusione &#34; include tutti i cardiomiociti con pseudopodi-come le strutture. &#34; Apparenza insolita &#34; comprende tutti i ARVC con una superficie irregolare e non rilevabile membrana cellulare intatta.</li>
	</ol></li></ol> 3. Esempio Esperimenti <ol><li>fluorescenza/immunofluorescenza di cardiomiociti adulti <ol><li>analizza le conversioni morfologiche e strutturale di ARVC durante la coltivazione da microscopia laser confocale. Utilizzare falloidina-TRITC per indagare strutture di F-actina in &#34; asta-a forma di &#34;, &#34; arrotondare per difetto &#34;, e &#34; diffusione &#34; ARVC. Eseguire la colorazione secondo il produttore &#39; protocollo s. Un esempio per la colorazione falloidina-TRITC è dato in riferimento Nippert et al. 11. con fluorescenza/immunofluorescenza, differenze in differentiation de e re dell'apparato contrattile nei cardiomyocytes coltivati adulto tra trattamenti sperimentali (ad es., con Swiprosin-1, Ionomicina) possono essere investigate.</li>
	</ol></li> <li>Real-Time RT-PCR quantitativa (qRT-PCR) <ol><li>eseguire qRT-PCR per studiare i cambiamenti nell'espressione di mRNA di geni diversi (ad es., OSM, Swiprosin-1, β-MHC) durante la coltivazione di ARVC. Per dimensione del campione sufficiente, utilizzare piastre di coltura più grandi (diametro interno: 60 mm) con 2 mL di volume. ARVC di cinque piatti di cultura produce un campione. Eseguire l'isolamento di mRNA e la trasformazione del cDNA secondo il produttore &#39; protocollo s.</li>
	</ol></li> <li>Tecniche Immunoblot <ol><li>eseguire Western Blots per studiare i cambiamenti nell'espressione della proteina (ad es., per Swiprosin-1) durante la coltivazione di ARVC. Utilizzare una piastra di coltura (1 mL) per esempio.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Schl&#252;ter, K. -. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , (2016).</li><li>Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+of+calcium+stable+adult+cardiac+myocytes.">Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes.</a> J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).</li><li>Schl&#252;ter, K. -. 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I risultati mostrati sono parte della tesi dottorale di Franziska Nippert.

Il comportamento di cardiomiociti adulti in vivo è influenzato da molte interazioni con altre cellule (ad es., neuroni, cellule endoteliali, fibroblasti, cellule infiammatorie) e il sincizio elettrico che formano1. Pertanto, studiare esclusivamente adattamento allo stress dei cardiomiociti adulti richiede l'isolamento e la coltura di ARVC. I principali effetti di isolare e coltivare ARVC sono: 1) disconnetterli dalla matrice extracellulare e contatti cellula-cellula; 2) eseguire...

Cardiomiociti adulti in vivo funziona come un sincizio elettrico basato su contatti cellula-cellula fra miociti. Inoltre, sono influenzati da celle adiacenti come fibroblasti cardiaci, cellule endoteliali, neuroni e cellule infiammatorie1. Al fine di studiare la capacità dei cardiomiociti di adeguare la loro organizzazione intracellulare di alterate condizioni di carico, come si è visto durante l'ipertrofia cardiaca, che è un passo iniziale che porta a insufficienza cardiaca, l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC) sono necessario2,3,4. Storicamente, cardiomiociti in primo luogo sono stati isolati da pulcino embrionali cuori5,6. Pochi anni dopo, il primo isolamento di cardiomiociti terminalmente differenziati è stata descritta utilizzando calcio svuotamento7. Tuttavia, questi cardiomiociti adulti non erano calcio tollerante e non potevano essere usati per saggi funzionali. Infine, nel 1976 un nuovo protocollo abilitato Powell e Twist per indagare su cardiomiociti adulti ventricolari sotto condizioni fisiologiche8. Come primo passo, hanno isolato cardiomiociti adulti sotto le concentrazioni basse del calcio e calcio in seguito aumentato a concentrazioni fisiologiche in una procedura graduale. Oggi, maggior parte dei protocolli per l'isolamento e la coltura di cardiomiociti adulti lavoro con questo protocollo di calcio e utilizzare collagenasi per la digestione enzimatica della cellula-cellula densa contatti1.
Per una coltivazione di successo, è necessario il siero fetale di vitello (FCS) o oncostatin M (OSM). ARVC eseguire un de - e re - differentiation con vasti cambiamenti strutturali tra cui sarcomero smontaggio e riforma9,10,11,12. Questo processo è accompagnato da una ri-espressione dei geni di tipo fetale, come β-miosina catena pesante (β-MHC), come noto da ipertrofia e una formazione di pseudopodi-come le strutture, anche chiamato diffusione4,11, 13. Inoltre, swiprosin-1 (EFHD2), una proteina di recente identificazione, svolge un ruolo importante nel processo di re-differenziazione di coltivato ARVC11. Di conseguenza, ARVC nella cultura trasformare nelle cellule polimorfiche, diffuse, che spontaneamente mostrano contrazioni dopo due o tre settimane nella cultura2,4,14.
Recenti scoperte hanno rivelato che cardiaco re e de differentiation come si verifica in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il rimodellamento cardiaco10,15. Rimodellamento cardiaco è un processo chiave durante malattie cardiache16. Come le malattie cardiache sono ancora la principale causa di morte nelle società industrializzate, una migliore comprensione della biologia dei cardiomiociti adulti è importante (OMS; 2015). Isolamento e coltura di ARVC può aiutare a sviluppare nuove strategie e medicinali per il trattamento delle malattie cardiache. Con questo manoscritto, un protocollo per l'isolamento e la coltura di ARVC è fornito. Inoltre, alcune parti critiche di questo metodo sono evidenziate nella sezione discussione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Langendorff perfusion system</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td>double-walled with a water 
			based heating system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper Mc Ilwain</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic Cannula, OD 1,8 mm</td>
			<td>inhouse construction</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal shears</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC772R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capsule forceps</td>
			<td>Eickemeyer</td>
			<td>171307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor large</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC562R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissor small</td>
			<td>Aeskulap</td>
			<td>BC163R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mash with Polyamid</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>4-1413</td>
			<td>mash size 200 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic disc</td>
			<td>Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Typ II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004177</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and cultivation of adult rat cardiomyocytes

In un cuore intatto, celle adiacenti influenzano cardiomiociti adulti. Con il metodo di isolamento e coltura dei cardiomiociti adulti, è possibile una valutazione dettagliata del comportamento di queste cellule nell'ambito di trattamenti specifici e di ambienti. Questo manoscritto presenta un protocollo per l'isolamento di successo e coltivazione dei cardiomyocytes ventricolari di ratto adulto (ARVC).
Il ratto è sacrificato dalla dislocazione cervicale sotto anestesia profonda. Quindi, viene estratto il cuore e l'aorta è scoperto. Successivamente, viene eseguita aspersione sul sistema di perfusione di Langendorff con deplezione di calcio e trattamento collagenasi. In seguito, tessuto ventricolare ottiene macinata, ricircolo e filtrata, seguita da tre fasi di centrifugazione con graduale aggiunta di CaCl2 finché non viene raggiunta la concentrazione fisiologica di calcio. ARVC sono placcati su piastre di coltura delle cellule. Dopo l'aggiornamento il mezzo di coltura cellulare, ARVC può essere coltivata fino a sei giorni senza cambiare il mezzo di coltura contenente siero. Isolamento di ARVC è un processo delicato di calcio. Piccoli cambiamenti nella concentrazione intracellulare di calcio causano una diminuzione della qualità e la vitalità delle cellule isolate.
Appena isolato ARVC sono a forma di asta. Entro i primi giorni di coltivazione perdono l'asta-a forma di forma e morfologia pseudopodi-come le strutture (diffusione). Durante questa formazione morfologica ARVC degradare inizialmente loro elementi contrattili, seguite da una riforma attraverso fibre di actina stress e de novo sarcomerogenesis. Dopo una settimana di coltivazione, la maggior parte ARVC mostrano un aspetto diffuso con una striatura trasversale chiaramente rilevabile. Questo processo è sensibile alla concentrazione intracellulare di calcio, come il trattamento con ionomicina attenua la diffusione. Catena pesante β-miosina (β-MHC), oncostatin M (OSM) e swiprosin-1 (EFHD2) sono indicatori chiavi in questo processo di de - e re - differentiation. Studi recenti hanno suggerito che cardiaco re e de differentiation che si verificano in condizioni di coltura imita caratteristiche visto in vivo durante il ritocco cardiaco. Di conseguenza, isolamento e coltura di ARVC gioca un ruolo chiave nella comprensione della biologia dei cardiomiociti.

Adulti cardiomiociti in coltura: La figura 1 Mostra una panoramica di recente isolate cardiomiociti adulti 2 h dopo l'ultimo lavaggio. Circa il 75% di tutti i cardiomiociti aveva una morfologia a forma di bastoncello. Il restante 25% ha mostrato un aspetto insolito con una morfologia rotonda e non rilevabile membrana intatta di cella (Figura 1). Alla fine della coltivazione (giorno 6), fino al 15% di tutti i card...

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Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

Isolamento e coltura dei cardiomiociti di ratto adulto.

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

15.4K Views.  Justus Liebig University Giessen. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e la coltura di ratto adulto ventricolare cardiomiociti (ARVC). ARVC isolata può essere utilizzato per la coltivazione di breve e lungo termine. L'isolamento e la coltura di ARVC possono giocare un ruolo chiave nello sviluppo di nuovi regimi di trattamento per malattie cardiache.

Video: Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

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Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

Isolamento dei cardiomiociti atriali da un modello del ratto di metabolico sindrome-relativo infarto con la frazione conservata di espulsione

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

An Efficient Sieving Method to Isolate Intact Glomeruli from Adult Rat Kidney

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by proteinuria which can eventually lead to chronic and end-stage renal disease. The glomerulus is a complex apparatus responsible for the filtration of plasma from the body. In disease, structural integrity is lost and allows for the abnormal leakage of plasma contents into the urine. A method to isolate and examine glomeruli in culture is critical for the study of these diseases. In this protocol, an efficient method of retrieving intact glomeruli from adult rat kidneys while conserving structural and morphological characteristics is described. This process is capable of generating high yields of glomeruli per kidney with minimal contamination from other nephron segments. With these glomeruli, injury conditions can be mimicked by incubating them with a variety of chemical toxins, including protamine sulfate, which causes foot process effacement and proteinuria in animal models. Degree of injury can be assessed using transmission electron microscopy, immunofluorescence staining, and western blotting. Nephrin and Wilms Tumor 1 (WT1) levels can also be assessed from these cultures. Due to the ease and flexibility of this protocol, the isolated glomeruli can be utilized as described or in a way that best suits the needs of the researcher to help better study glomerular health and structure in diseased states.

The main focus of this protocol is to efficiently isolate viable primary glomeruli cultures with minimal contaminants for use in a variety of downstream applications. The isolated glomeruli retain structural relationships between component cell types and can be cultured ex vivo for a short time.

Un metodo efficiente di setacciatura per isolare i Glomeruli intatti dal rene di ratto adulto.

Preservation of glomerular structure and function is pivotal in the prevention of glomerulonephritis, a category of kidney disease characterized by ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Isolamento dei miociti atriale dai topi adulti

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Ultrasonic-augmented Primary Adult Fibroblast Isolation

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary fibroblasts cannot divide indefinitely due to myofibroblast differentiation or senescence induction, new cultures must be established regularly. However, there are several obstacles to overcome during the processes of developing a reliable isolation protocol and primary fibroblast isolation itself: the method&#8217;s degree of difficulty (especially for beginners), the risk of bacterial contamination, the required time until primary fibroblasts can be used for experiments, and subsequent cell quality and viability. In this study, a fast, reliable and easy-to-learn protocol to isolate and culture primary adult fibroblasts from mouse heart, lung, liver and kidney combining enzymatic digestion and ultrasonic agitation is provided.

We present a protocol to isolate primary adult fibroblasts in an easy, fast and reliable way, performable by beginners (e.g., students). The procedure combines enzymatic tissue digestion and mechanical agitation with ultrasonic waves to obtain primary fibroblasts. The protocol can easily be adapted to specific experimental requirements (e.g., human tissue).

Isolamento fibroblasto adulto primario aumentata ad ultrasuoni

Primary adult fibroblasts have become an important tool to study fibrosis, fibroblast interactions and inflammation in all body tissues. Since primary ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring apparatus and a motor to perform functional studies. These studies will allow measurement of cardiomyocyte stiffness (passive force) and its activation with different calcium (Ca2+)-containing solutions to determine, amongst others: maximum force development, myofilament Ca2+-sensitivity (pCa50), cooperativity (nHill) and the rate of force redevelopment (ktr). This method also enables determination of the effects of drugs acting directly on myofilaments and of the expression of exogenous recombinant proteins on both active and passive properties of cardiomyocytes. Clinically, skinned cardiomyocyte studies highlight the pathophysiology of many myocardial diseases and allow in vitro assessment of the impact of therapeutic interventions targeting the myofilaments. Altogether, this technique enables the clarification of cardiac pathophysiology by investigating correlations between in vitro and in vivo parameters in animal models and human tissue obtained during open heart or transplant surgery.

This protocol aims to describe step-by-step the technique of extraction and assessment of cardiac function using skinned cardiomyocytes. This methodology allows measurement and acutemodulation of myofilament function using small frozen biopsies that can be collected from different cardiac locations, from mice to men.

Valutazione in vitro della funzione cardiaca con cardiomiociti scuoiati

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...

Isolation and Cultivation of Mandibular Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Rats

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous high-quality cells for experimental requirements. mBMSCs could be widely used in therapeutic applications as tissue engineering cells in case of craniofacial diseases and cranio-maxillofacial regeneration in the future due to the excellent self-renewal ability and multi-lineage differentiation potential. Therefore, it is important to obtain mBMSCs in large numbers.
In this study, bone marrow was flushed from the mandible and primary mBMSCs were isolated through whole bone marrow adherent cultivation. Furthermore, CD29+CD90+CD45&#8722; mBMSCs were purified through fluorescent cell sorting. The second generation of purified mBMSCs were used for further study and displayed potential in differentiating into osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Utilizing this in vitro model, one can obtain a high number of proliferative mBMSCs, which may facilitate the study of the biological characteristics, the subsequent reaction to the microenvironment, and other applications of mBMSCs.

This article presents a method that combines whole bone marrow adherence and flow cytometry sorting for isolating, cultivating, sorting, and identifying bone marrow mesenchymal stem cells from rat mandibles.

Isolamento e coltivazione di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo mandibolare nei ratti

Here we present an efficient method for isolating and culturing mandibular bone marrow mesenchymal stem cells (mBMSCs) in vitro to rapidly obtain numerous ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells provide promising sources for cardiac disease modeling. For cardiomyopathies, sarcomere shortening is one of the standard physiological assessments that are used with adult cardiomyocytes to examine their disease phenotypes. However, the available methods are not appropriate to assess the contractility of PSC-CMs, as these cells have underdeveloped sarcomeres that are invisible under phase-contrast microscopy. To address this issue and to perform sarcomere shortening with PSC-CMs, fluorescent-tagged sarcomere proteins and fluorescent live-imaging were used. Thin Z-lines and an M-line reside at both ends and the center of a sarcomere, respectively. Z-line proteins &#8212;&#160;&#945;-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP), and actin-associated LIM protein (PDLIM3) &#8212; and one M-line protein &#8212; Myomesin-2 (Myom2) &#8212;&#160;were tagged with fluorescent proteins. These tagged proteins can be expressed from endogenous alleles as knock-ins or from adeno-associated viruses (AAVs). Here, we introduce the methods to differentiate mouse and human pluripotent stem cells to cardiomyocytes, to produce AAVs, and to perform and analyze live-imaging. We also describe the methods for producing polydimethylsiloxane (PDMS) stamps for a patterned culture of PSC-CMs, which facilitates the analysis of sarcomere shortening with fluorescent-tagged proteins. To assess sarcomere shortening, time-lapse images of the beating cells were recorded at a high framerate (50-100 frames per second) under electrical stimulation (0.5-1 Hz). To analyze sarcomere length over the course of cell contraction, the recorded time-lapse images were subjected to SarcOptiM, a plug-in for ImageJ/Fiji. Our strategy provides a simple platform for investigating cardiac disease phenotypes in PSC-CMs.

This method can be used to examine sarcomere shortening using pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes with fluorescent-tagged sarcomere proteins.

Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

Modifiche del metodo Langendorff per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...