Siamo grati al Prof. emerito Jean-Claude Perriard e Evelyn Perriard (Istituto Federale Svizzero di Tecnologia, Svizzera) per l&#39;introduzione di tecniche di isolamento per ratto neonato e cardiomiociti di topo. Vorremmo ringraziare il Prof. Ju Chen e il Prof. Sylvia Evans (UCSD, USA) per il loro supporto. Il lavoro nel laboratorio di EE è stato finanziato da un MRC Career Istituzione Grant. SL è supportato da un K99/R00 percorso di aggiudicazione indipendenza dal NIH / NHLBI (HL107744). TMM è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato dalla American Heart Association (11POST7310066).

La procedura seguente descrive un protocollo 16,17 di due giorni per l&#39;isolamento e la cultura dei cardiomiociti neonatali di topo. Tutte le soluzioni sono sterili o sterili filtrata. Tutti gli strumenti sono sterilizzati mediante sterilizzazione superficie con il 75% di etanolo. Tranne per l&#39;estrazione del tessuto iniziale, tutte le fasi vengono eseguite in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare sterile. Questo protocollo è destinato per l&#39;isolamento di cuori neonatali di topo 1-2 cucciolata (s) - circa 5-14 cuccioli, ma può essere adattato per dimensioni dei cuccioli più grandi e cardiomiociti neonatali di ratto. L&#39;utilizzo di supporti Scala / enzima come appropriato. Per il lavoro con i roditori neonatali, consultare le linee guida universitari locali e le regole stabilite dal legislatore e / o programmi di cura degli animali, e di aderire al vostro protocollo animali istituzionalmente approvato. Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dalla Institutional Animal Care ed uso commissione UC San Diego (IACUC), e di aderire alla fedenormative ral e statali. Giorno 1. 1. Isolamento di tessuto cardiaco da topi neonati <ol><li> Preparare 50 ml di PBS 1x (senza Ca 2 +, Mg 2 +) supplementato con 20 BDM mM 6-8, e disperdere in due piatti sterili batteriche immessi sul ghiaccio. </li><li> Preparare 10 ml di terreno di isolamento in 50 ml sterile tubo Falcon conica. Conservare tutte le soluzioni su ghiaccio. Sterilizzare le forbici (una curva, una retta), e pinze (curve, Dumont No.7). </li><li> 1-3 giorni vecchi topi neonati sono sciacquati rapidamente in una soluzione di etanolo al 75% per la sterilizzazione di superficie. I cuccioli vengono decapitati con forbici sterili (diritti), e il torace si apre lungo lo sterno per consentire l&#39;accesso alla cavità toracica e il cuore (Figura 1A, Supplemental Movie S1). Commento tecnico: topi neonati di età superiore ai tre giorni possono essere utilizzati, ma comportano un minor numero di cellule vitali 2. </li><li> Cuori sono estratti dail corpo con forbici curve e trasferiti immediatamente nel piatto batterica contenente PBS 1x (senza Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 mM BDM, su ghiaccio. Tutte le fasi sono eseguite nella cappa coltura cellulare sterile. </li><li> Rimuovere il tessuto polmonare, navi più grandi (e atri, se lo si desidera). Lavare cuori nella soluzione 1x PBS (senza Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 BDM mm (su ghiaccio) per rimuovere il sangue. Trasferimento lavato cuori dal primo piatto al secondo piatto batterico contenente 1x PBS (senza Ca 2 +, Mg 2 +) con 20 BDM mm (su ghiaccio) con pinze o un mestolo forato (Figura 1B). </li><li> Cuori Transfer pulito / lavato in una goccia di terreno di isolamento (circa 250 microlitri; la figura 1C) in un terzo piatto batterica (su ghiaccio) e usare le forbici curve di sminuzzare i cuori in piccoli pezzi (circa 0,5-1 mm 3, o più piccoli; Figura 1D, 1E). </li><li> Trasferire cuori tritati in una conicaprovetta contenente 10 ml di terreno di isolamento (su ghiaccio), e incubare con lieve agitazione a 4 ° C durante la notte. </li></ol> Day 2. 2. Tissue digestione enzimatica e la placcatura delle cellule <ol><li> Pesare 15 mg di collagenasi / dispasi miscela (Roche), e sciogliere la miscela enzimatica in 10 ml L15-medio 5 supplementato con 20 mM BDM (medium digestione). Filtro sterile il mezzo digestione nella cappa coltura cellulare in un nuovo tubo sterile 50 ml Falcon. </li><li> Preparare 30 ml L-15 supplementato con 20 mM BDM, e media placcatura. </li><li> Piastre Coat coltura cellulare con la soluzione di collagene (Sigma C-8919), per un minimo di 1 ora. Rimuovere la soluzione di collagene (può essere riutilizzato) e collagene rivestito a secco coltura cellulare piatti in cappa coltura cellulare a flusso laminare sterile. </li><li> Rimuovere il tubo conico contenente i cuori predigerito da 4 ° C. Frammenti di tessuto devono essere aggregati (Figura 1G). Lasciate che i frammenti di tessuto si depositanoil fondo del tubo e rimuovere il surnatante (assicurarsi di non perdere i frammenti di tessuto;. normalmente, circa 1 ml di terreno di isolamento possono restare nel tubo). Aggiungere 5 ml di terreno digestione e 5 ml di L-15 supplementato con 20 BDM mM di frammenti di tessuto e le sospensioni ossigenare con ossigeno o aria per 1 min. </li><li> Trasferire il tubo conico sigillata contenente i frammenti di tessuto cardiaco in mezzo digestione a 37 ° C a bagnomaria per circa 2 min per regolare la temperatura della soluzione digestione. </li><li> Incubare frammenti di tessuto cardiaco a 37 ° C con agitazione delicata per 20-30 min (es shaker a 37 ° C, insieme a non più di 60rpm). Tempi di digestione possono dipenderà in gran miscela di enzimi e numero di lotto. Attenzione: periodi di incubazione più lunghi o concentrazioni enzimatiche più elevate possono ridurre la vitalità cellulare. </li></ol> Commento tecnico: Si consiglia l&#39;utilizzo di una miscela collagenasi / dispasi da Roche (art: 10269638001), che ha ben poca variabilità da lotto a lotto. L&#39;enzima classica per l&#39;isolamento di cardiomiociti di topo è tripsina e / o collagenasi di tipo II 3,16-20 disponibile da Worthington (Cat n CLS-2). Tuttavia, le prestazioni di collagenasi II può differire sostanzialmente da lotto a lotto. Worthington consente in genere per la sperimentazione di diversi lotti di collagenasi per ottimizzare i tempi di digestione e l&#39;enzima utilizzo. In alternativa, Worthington vende un kit di isolamento cardiomiociti con una miscela di enzimi pre-testati inclusi che possono essere adattate per l&#39;isolamento di cardiomiociti di topo 17 (Cat. No.: NCIS). <ol start="7"><li> Posizionare sterile cell-filtro (40-100 micron maglia di nylon) in freschi sterile 50 ml tubo conico falco. Filtro cella di prelavaggio con 5 ml L-15 supplementato con 20 BDM mm. Frammenti di tessuto delicatamente triturare con un pre-bagnata 10 ml di coltura cellulare pipetta per circa 10-20 volte. I frammenti di tessuto devono principalmente disperdere durante questa fase, rilasciando le cellule in suspension (Figura 1H). </li><li> Lasciate frammenti di tessuto grandi sedimenti e surnatante trasferimento contenente cellule sospese in provetta conica attraverso la cella-filtro (Figura 1I). </li><li> Re-sospendere i frammenti di tessuto non digerito in 5 ml di mezzo la digestione e incubare per altri 5-10 minuti a 37 ° C con agitazione. </li><li> Dopo aver continuato digestione dei restanti frammenti di tessuto, triturare delicatamente il tessuto per 10-20 volte e aggiungere al tubo contenente cellule coniche dal primo digerire attraverso il filtro delle cellule. Risciacquare cellula-filtro con 5 ml L-15 supplementato con 20 mM BDM per consentire il passaggio di tutte le cellule digerite. </li><li> Provetta conica centrifugato contenente cardiomiociti sospensione per 5 min a 300 rpm (circa 50-100 xg). Rimuovere il surnatante (contenente principalmente fibroblasti e cellule endoteliali) e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di placcatura medie. </li><li> Celle a piastre in cella 10 cm piatto di coltura (Figura 2A) e incubare per 1-3 Ore in cella cultura incubatore. Questa fase di pre-placcatura rimuove fibroblasti e cellule endoteliali (Figura 2B), che aderirà al piatto coltura cellulare non patinata (Figura 2C). </li><li> Dopo l&#39;incubazione, lavare i cardiomiociti non aderenti da 10 cm piatto cultura (ri-sospensione delle cellule pipettando ripetutamente il mezzo placcatura sopra il piatto), e le cellule risospese trasferimento ad una conica provetta Falcon da centrifuga sterile (15 ml o 50 ml). Facoltativo: Ripetere la fase di pre-plating per rimuovere i fibroblasti supplementari dalla cella-sospensione. Se lo si desidera, le cellule di fibroblasti ed endoteliali aderenti possono essere ulteriormente coltivate. </li><li> Contare le celle (ad esempio utilizzando emocitometro Neubauer, trypan esclusione colorazione blu 21). </li><li> Celle a piastre in collagene rivestite piatti di coltura di cellule con una densità di circa 1,5 x 10 5 cellule per cm 2 (Figura 2D; vedi i commenti anche nella tabella 1 sulla placcaturae rivestimento). Mettere i piatti nella cella cultura incubatore e lasciare indisturbati per 12-18 ore per consentire l&#39;aderenza e la diffusione dei cardiomiociti. </li></ol> Giorno 3 - Cultura di cardiomiociti neonatali <ol><li> Preparare terreno di mantenimento e Preriscaldare a 37 ° C bagnomaria. Fare riferimento alla Tabella 1 per l&#39;aggiunta di inibitori di proliferazione o agenti cronotropi, o la procedura per la trasfezione liposomiale dei cardiomiociti neonatali di topo. </li><li> Un giorno, dopo la placcatura, cardiomiociti dovrebbero hanno aderito al piatto di coltura cellulare e in modo ottimale inizia spontaneamente a contrarsi (Figura 2E, 2F, lettera Movie S2, vedi Tabella 2 per i problemi più comuni durante la procedura di isolamento / cultura). Sostituire placcatura media con terreno di mantenimento, e la cultura per altri 1-5 giorni. Cambiare mezzo come necessario. </li></ol>

L&#39;uso di modelli animali per studiare le malattie cardiache è diventato standard nella ricerca cardiovascolare. Caratterizzazione Closer biochimica di questi modelli (ovvero studiando risposte dirette su cellule cardiache a stimoli biochimici e biomeccanici) richiede in genere l&#39;isolamento dei tessuti cardiaci o cardiomiociti. Gli studi che indagano risposte fisiologiche del cuore ex vivo (ad esempio dell&#39;acetilcolina 40, o in scenari ischemia-riperfusione 41) general...

Le prime relazioni per la dissociazione di successo e coltura di cellule cardiache del roditore risale al 1960 1,2. Anche allora, Harary e Farley notato che cardiomiociti in coltura &quot;possono fornire un sistema unico per lo studio dei requisiti della contrattilità periodica [e possono] fornire un mezzo per determinare il contributo dei vari percorsi metabolici per la [battito] processo&quot;. Anche se Harary e Farley cardiomiociti isolati e coltivati ​​da giovani ratti, e il protocollo originale è stato adattato e modificato da molti scienziati nel corso degli anni, la procedura generale isolamento e la coltura non è molto cambiata. Tuttavia, enzimi migliori 3, soluzioni standardizzate 4,5, e l&#39;aggiunta del canale reversibile e miosina ATPasi inibitore BDM per proteggere le cellule durante la procedura di isolamento 6-9 è migliorata significativamente cellula-resa e la fattibilità. Adulto vs cardiomiopatia neonataleciti Cardiomiociti isolati e coltivati ​​da topi o ratti neonati hanno diversi vantaggi rispetto colture di cardiomiociti adulti. Primo, la procedura di isolamento di topo o ratto cuori neonatali è più semplice e meno costosa, rispetto all&#39;isolamento di cardiomiociti di topo adulto o ratto 10. Cardiomiociti neonatali sono molto meno sensibili alle reintroduzione in un mezzo contenente calcio dopo dissociazione, aumentando notevolmente cella rendimento. Un altro grande vantaggio è che i cardiomiociti neonatali di topo subiscono una più rapida de-differenziazione - ciclo ridifferenziazione che di solito si traduce in modo spontaneo battere cellule 20 ore dopo la placcatura, mentre cardiomiociti adulti in genere richiedono stimolazione per indurre la contrazione. Cardiomiociti neonatali sono anche più facilmente transfectable con i metodi liposomiale trasfezione, considerando che i cardiomiociti adulti necessitano di vettori virali per la consegna di successo di DNA transgenico. In contrasto con cardiomiociti neonatalis, la cultura dei cardiomiociti roditori adulti 11-13 consente di ricerche di degradazione miofibrillare ed eventuale ripristino dell&#39;apparato contrattile. Questi cambiamenti morfologici caratteristici cardiomiociti adulti avvengono su periodi di 1-2 settimane. Il dedifferentiation - ciclo ridifferenziazione è accompagnata da reexpression del programma gene fetale, imitando in tal modo i cambiamenti patologici osservati in cardiomiopatie umani 14. Un altro vantaggio di cardiomiociti di ratto adulto di coltura di cardiomiociti neonatali è la capacità di coltura queste cellule per lunghi periodi di tempo. Rat vs cardiomiociti di topo L&#39;isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di ratto ha alcuni vantaggi rispetto quella del topo cardiomiociti neonatali, compresi rendimenti più elevati di cellule vitali e un aumento dei tassi di trasfezione. Tuttavia, l&#39;ampio utilizzo di modelli murini geneticamente modificati per le malattie cardiache (es. &lt;/ Em&gt; il lim muscolo topo knockout proteine ​​come modello per la cardiomiopatia dilatativa 15) ha portato alla adeguamento della procedura di isolamento di cardiomiociti derivati ​​da topi neonati. Sebbene i protocolli utilizzati per isolare neonatali di ratto e di topo cardiomiociti sono quasi identiche, una maggiore attenzione deve essere posta nella scelta di un mix enzima appropriato per quest&#39;ultimo. Infatti, cardiomiociti neonatali di topo sono generalmente più suscettibili a overdigestion, risultante in una cella rendimento e ridotta vitalità. Inoltre, la densità di placcatura deve essere regolata, perché cardiomiociti derivati ​​da topi neonati sono più piccole rispetto alle cellule derivate da cuori di ratto neonatale. Con molti usi per le indagini, parametri morfologici, elettrofisiologici, biochimici cellulari-biologica e biomeccanica nonché per il processo di myofibrillogenesis, cardiomiociti neonatali coltivate sono diventati uno dei sistemi più versatili per lo studio difunzioni delle cellule cardiache in vitro. Il primo passo per un saggio di successo però, dipende da una metodologia semplice e affidabile per isolare i cardiomiociti neonatali di topo. Il nostro protocollo trae metodologia da molte fonti e stato ottimizzato per la riproducibilità e robustezza. Discutiamo fattori che influenzano cardiomyocyte rendimento e la redditività, e di fornire una varietà di opzioni per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BDM (2,3-Butanedione monoxime) 6-8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B-0753</td>
			<td>prepare 0.2M stock solution in HBSS (without Ca2+, Mg2+), filter sterilize, can be kept at 4 &deg;C up to 6 months; Caution: Prolonged usage of BDM other than during isolation procedure may result in non-beating cells, decreased cell viability and/or significantly altered gene-expression during cardiomyocyte culture46,47.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase/Dispase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10269638001</td>
			<td>can be substituted with collagenase type II from Worthington</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type II3</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>CLS-2</td>
			<td>substitute for Collagenase/Dispase mix from Roche</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x trypsin solution (0.25%) with EDTA</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>25-053-CI</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Penicillin/ Streptomycin solution with EDTA in HBSS</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>30-002-Cl</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (without Ca2+, Mg2+)</td>
			<td>e,g, cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS (Hank's balanced salt solution; without Ca2+, Mg2+) 4</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>21-022-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-199</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-060-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-011-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>horse serum</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>35-030-CV</td>
			<td>cell-culture grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz L-155</td>
			<td>e.g. cellgro</td>
			<td>10-045-CV</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AraC (Cytosine-B-D-arabino-furanoside hydrochloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-6645</td>
			<td>proliferation inhibitor, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylephrine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-6126</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 100 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoproterenol hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I-6501</td>
			<td>chronotropic agent, prepare 1 mM stock solution in H2O, filter sterilize, store at 4 &deg;C or -20 &deg;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% collagen solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-8919</td>
			<td>extracellular matrix for coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mg/ml collagen type 1 solution</td>
			<td>Advanced BioMatrix</td>
			<td>5005-B</td>
			<td>alternative to Sigma collagen solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell strainer</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>22363548</td>
			<td>appropriate filter size:40 &mu;m-100 &mu;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe filter 0.2 &mu;m</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>09-719C</td>
			<td>for sterile filtration of digestion medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>straight scissors</td>
			<td>e.g. Fine Sciences Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>curved scissors</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91461-11</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No. 7 forceps</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>91197-00</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perforated spoon</td>
			<td>e.g. Fine Science Tools</td>
			<td>10370-19</td>
			<td>optional, for transfer of heart tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>e.g. Gibco</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>live cell staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer hemocytometer</td>
			<td>e.g. Prosource Scientific</td>
			<td>3500</td>
			<td>alternatively use: disposable hemocytometer C-chip or automated cell counting systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>14-432-23</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Falcon tubes</td>
			<td>e.g. Fisherbrand</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml syringe</td>
			<td>e.g. BD Medical</td>
			<td>14-820-19</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml serological pipette</td>
			<td>e.g. Falcon</td>
			<td>357551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>153066</td>
			<td>for standard culture of cardiomyocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mm cell culture dish, glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-0-10-C</td>
			<td>for live cell imaging with inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm cell culture dish</td>
			<td>e.g. Nunc</td>
			<td>172958</td>
			<td>for preplating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escort III</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3037</td>
			<td>for liposomal transfection, alternatively use lipofectamin 2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies, Invitrogen</td>
			<td>52887</td>
			<td>substitute for Escort III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffers and media: 
			<ul>
				<li>Isolation medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				0.0125% trypsin 
				in HBSS4 (without Ca2+, Mg2+)</li>
				<li>Digestion medium (filter sterilize) 
				20 mM BDM 
				1.5 mg/ml Roche Collagenase/Dispase enzyme mix 
				in L15 medium</li>
				<li>Plating medium 
				65% DMEM high glucose 
				19% M-199 
				10% horse serum 
				5% fetal calf serum 
				1% penicillin/streptomycin</li>
				<li>Maintenance medium 
				78% DMEM high glucose 
				17% M-199 
				4% horse serum 
				1% penicillin/streptomycin 
				optional: 
				1 &mu;M AraC 
				1 &mu;M isoproterenol or 0.1 mM phenylephrine</li>
			</ul>
			The plating and maintenance medium can be stored at 4 &deg;C for up to 6 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes

Cardiomiociti neonatali in coltura sono stati a lungo utilizzati per studiare myofibrillogenesis e le funzioni miofibrillari. Cardiomiociti in coltura consentono una facile ricerca e manipolazione di vie biochimiche, e il loro effetto sulle proprietà biomeccaniche di battere spontaneamente cardiomiociti. Il protocollo 2-giorno seguente descrive l&#39;isolamento e la coltura di cardiomiociti neonatali di topo. Mostriamo come sezionare facilmente cuore da neonati, dissociare il tessuto cardiaco e arricchire cardiomiociti dalle cellule popolazione cardiaca. Discutiamo l&#39;utilizzo di diversi mix di enzimi per la cella-dissociazione, e dei loro effetti sulla cellula-vitalità. I cardiomiociti isolati possono essere successivamente utilizzati per una varietà di,,, saggi di cellule biologiche o biomeccanica biochimici elettrofisiologici morfologiche. Abbiamo ottimizzato il protocollo per robustezza e riproducibilità, utilizzando solo soluzioni disponibili in commercio e l&#39;enzima mix che shpoca variabilità ow lotto a lotto. Ci rivolgiamo anche a problemi comuni associati con l&#39;isolamento e la coltura di cardiomiociti, e di offrire una varietà di opzioni per l&#39;ottimizzazione delle condizioni di isolamento e coltura.

Usando questo protocollo, abbiamo isolato i cuori da 8 un giorno di età topi neonati (Figure 1A, 1B, Supplemental Movie S1). Dopo il lavaggio e macinazione i cuori con le forbici (Figure 1C-1F), frammenti di tessuto sono stati predigerito in terreno di isolamento per tutta la notte a 4 ° C con agitazione. Dopo predigestione (Figura 1G), abbiamo trasferito i frammenti di tessuto in mezzo digestione appena fatto, e incubate i frammenti di tessuto per 20 min a 37 ° C co...

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Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l&#39;indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l&#39;isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

isolation-and-culture-of-neonatal-mouse-cardiomyocytes

Research

JoVE Journal

Biology

62.0K Views.  King’s College London.  Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolamento e la coltura di cellule endoteliali polmonari da topi neonati

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Ricerca

Biologia

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

Isolamento e registrazioni dei canali Kv in cardiomiociti murini atriale e ventricolare

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one week. More than 20 x 106 acinar cells can be obtained from a single murine pancreas. This protocol offers the possibility to independently process as many as 10 pancreases in parallel. Because it preserves acinar architecture, this model is well suited for studying the physiology of the exocrine pancreas in vitro in contrast to cell lines established from pancreatic tumors, which display many genetic alterations resulting in partial or total loss of their acinar differentiation.

In this publication, we describe a rapid and convenient procedure for isolating and culturing primary pancreatic acinar cells from the murine pancreas. This method constitutes a valuable approach to study the physiology of fresh primary normal/untransformed exocrine pancreatic cells.

Isolamento e Cultura del mouse principale acinose pancreatiche Cellule

This protocol permits rapid isolation (in less than 1 hr) of murine pancreatic acini, making it possible to maintain them in culture for more than one ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

Isolamento e fisiologica Analisi di mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation of Neonatal Extrahepatic Cholangiocytes

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, differences between intra and extrahepatic cholangiocytes, and between neonatal and adult cells, are not well understood.
Methods for the isolation of cholangiocytes from intrahepatic bile ducts are well established1-4. Isolation of extrahepatic ductal cells, especially from the neonate, has not yet been described, although this would be of great benefit in understanding the differences between distinct cholangiocyte populations and in studying diseases such as biliary atresia that appear to target the extrahepatic ducts. Described here is an optimized technique to isolate both neonatal and adult mouse extrahepatic bile duct cells. This technique yields a pure cell population with minimal contamination from mesenchymal cells like fibroblasts.
This method is based on the removal of the extrahepatic ducts and gallbladder, followed by meticulous dissection and scraping to remove fat and fibroblast layers. Structures are embedded in thick layers of collagen and cultured for approximately 3 weeks to allow outgrowth of cholangiocytes in monolayers, which can then be trypsinized and re plated for experimental use.

A technique to isolate cholangiocytes from the extrahepatic bile ducts of neonatal mice is described. The ducts are meticulously dissected, and then cells are isolated by outgrowth in thick collagen gels. This method provides a useful tool for studying extrahepatic bile duct development and pathology.

Isolamento dei neonatale extraepatico colangiociti

The intra and extrahepatic bile ducts of the liver are developmentally distinct, and may be differentially affected by certain diseases. However, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolamento e colture primarie di cellule di topo aortica endoteliali

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

Isolamento e cultura dei cheratinociti primari del mouse dalla pelle dei neonati e adulti

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...