N.G. è il destinatario di borse di studio della "Fondation pour la Recherche Médicale FRM" francese e della Fondazione Philipp; R.S. è supportato dalla Lucile Packard Foundation for Children's Health e dal numero di premio STANFORD NIH/NCRR CTSA UL1 RR025744; P.S. è sostenuta da una Borsa max Kade della Fondazione Max Kade e dall'Accademia austriaca delle scienze e da una Borsa di studio Schroedinger del Fondo scientifico austriaco (FWF): J3399-B21; S.J.G. riconosce il sostegno dei National Institutes of Health grants U19 AI104209, NS 080062 e del Tobacco-Related Disease Research Program presso l'Università della California; L.L.R. riconosce il sostegno della Arthritis National Research Foundation (ANRF) e della Sovvenzione nazionale per gli istituti sanitari K99AI110645.

Tutta la cura e la sperimentazione degli animali sono state condotte nel rispetto delle linee guida dei National Institutes of Health e con l'approvazione specifica dell'Institutional Animal Care and Use Committee della Stanford University.
1. Generazione e caratterizzazione di mastociti coltivati derivati dal midollo osseo (BBMCMC).
Nota: I BBMCMC donatori devono essere generati da cellule del midollo osseo dello stesso background genetico dei topi riceventi carenti di MC. I BBMCMC donatori di derivazione maschile non sono adatti per l'innesto di topi femmine. I BBMCMC donatori di derivazione femminile si innesteranno con successo sia nei riceventi maschi che in quello femminile.
<ol><li>Estrazione del midollo osseo.<ol>
<li>Versare la salina sterile tamponata con fosfato (PBS) in 6 piastre di coltura del pozzo (1 pozzo per topo) e posizionarla sul ghiaccio.</li>
		<li>Immergere gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per la sterilizzazione.</li>
		<li>Eutanasia dei topi donatori per inalazione dianidride carbonica(CO 2) seguita da lussazione cervicale, quindi spruzzare i topi con il 70% di etanolo nei siti di manipolazione.</li>
		<li>Utilizzare strumenti sterili di dissezione per estrarre le ossa di femore, tibia e fibula senza tagliare epifisi ossee.</li>
		<li>Mentre si fissano le ossa con una flesso, raschiare via tutto il tessuto dalle ossa (e scartare la fibula) usando forbici sterili (o lame bisturi). Posizionare le ossa in PBS sul ghiaccio fino a quando tutte le ossa non vengono raccolte.</li>
		<li>Eseguire tutti i passaggi rimanenti nella cappa di coltura dei tessuti sterili. Utilizzando strumenti sterili, fissare le ossa con le forcep e tagliare entrambe le epifisi per esporre la cavità midollare.</li>
		<li>Utilizzando siringhe da 3 ml e aghi da 30 G e mezzo di lavaggio a freddo (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] integrato con siero di vitello fetale al 10% [FCS, inattivato dal calore], 2 mM L-glutammina, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 50 μM Β-mercaptoetanolo), lavare il midollo osseo rosso in una piastra di Petri.</li>
		<li>Utilizzare la stessa siringa per dissociare i grappoli di cellule del midollo osseo lavato mediante ripetute aspirazione ed espulsione delicata.</li>
		<li>Mettere in piscina il midollo osseo femorale e tibiale di ogni topo in un tubo di centrifuga da 15 ml. Riempire il tubo con mezzo di lavaggio a freddo per lavare le cellule del midollo osseo e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Cultura BMCMC.<ol>
<li>Rimuovere il supernatante e recuperare le cellule del midollo osseo a pellet in 10 ml di mezzo di coltura (DMEM integrato con siero fetale al polpaccio al 10% [FCS, inattivato termicamente], 2 mM L-glutammina, soluzione antibiotico-antimicotica all'1%, 50 μM Β-mercaptoetanolo e 20% di supporto condizionato alle cellule WEHI-3 [come fonte di IL-3; in alternativa utilizzare il topo ricombinante IL-3 a 10 ng/ml]).</li>
		<li>Posizionare le cellule nel pallone di coltura tissutale di dimensioni appropriate(ad esempio,T25 per 1 topo, T75 per 2 topi, ecc.).</li>
		<li>1-2 giorni dopo la placcatura delle cellule, trasferire cellule medie e sospese (lasciando detriti e cellule aderenti attaccate al fondo del pallone) in un nuovo pallone e aggiungere un mezzo di coltura fresco (10 ml/ topo).</li>
		<li>Durante le settimane successive, nutrire le cellule ogni 3-4 giorni (aggiungere 10 ml di mezzo di coltura per topo). Mantenere la densità cellulare tra 2,5 x 105-1 x 106 cellule/ml. Trasferire le cellule non aderenti in un nuovo pallone una volta alla settimana fino a quando non sono presenti cellule aderenti nel pallone di coltura. Testare la maturità delle cellule (vedi sotto) prima dell'uso per saggi in vitro o innesto in topi a basso consumo di MC. NOTA: La differenziazione completa dei BBMCMC richiederà 4-6 settimane.</li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione della maturità di BMCMC.<ol>
<li>
Usando la citometria a flusso.
		<ol>
<li>Lavare le celle (5 x 104-5 x 105 celle/condizione) con tampone FACS ghiacciato (PBS, 0,5% FCS) in tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml. Centrifuga a 400 x g per 5 min a 4 °C. Aspira il supernatante.</li>
			<li>Diluire gli anticorpi monoclonali anti-mouse CD16/32 (clone 93 o 2.4G2) 1:200 (2,5 μg/ml) nel tampone FACS. Aggiungere 10 μl ad ogni pellet e ripresorsi con un breve vortice. Incubare 5 minuti sul ghiaccio per bloccare l'attacco Fc. NOTA: proteggere i campioni dalla luce diretta per tutti i passaggi rimanenti.</li>
			<li>Fieerythrin coniugato diluire (PE) l'anti-mouse Coniugato Fc εRI α (clone MAR-1) 1:200 (1 μg/ml) e l'isotiocianato di fluoresceina (FITC) COjugate anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8) 1:200 (2,5 μg/ml) ("soluzione di colorazione"), o i rispettivi anticorpi di controllo dell'isotipo etichettati nel buffer FACS ("soluzione di controllo dell'isotipo").</li>
			<li>Dividere metà delle celle bloccate dal passaggio 1.3.1.2) in un tubo inferiore rotondo in polistirolo aggiuntivo e aggiungere 20 μl di "soluzione di colorazione" in un tubo e 20 μl di "soluzione di controllo dell'isotipo" nell'altro tubo. Incubare 30 minuti sul ghiaccio.</li>
			<li>Aggiungere 3 ml di tampone FACS ghiacciato e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il supernatante e resospendare il pellet in tampone FACS da 300 μl contenente 1 μg/ml di ioduro di propidio (PI, per l'identificazione di cellule morte). Procedere all'analisi della citometria del flusso (vedere figura 2A).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Usando la colorazione blu toluidina.<ol>
<li>Lavare 1 x 105 celle una volta con PBS per centrifugazione a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi aspirare e rimorsire le cellule in 200 μl di PBS.</li>
			<li>Trasferire la sospensione cellulare in un citofunnel preparato collegato a uno scivolo del microscopio e procedere con la citocentrifugazione usando un citocentrifugo (40 x g per 5 min).</li>
			<li>Scivoli ad aria secca per 10 minuti e disegnare un cerchio di cera intorno alle celle utilizzando una penna PAP. Aggiungere la soluzione blu toluidina allo 0,1% per coprire le cellule. Incubare per 1 minuto. Lavare gli scivoli in acqua corrente del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria per 10 minuti.</li>
			<li>Copre le celle di sospensione utilizzando il supporto di montaggio. Procedere all'analisi del microscopio luminoso (vedere figura 2B)</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Innesto di topi carenti di mast cell con BBMCMC.
<ol><li>Innesto dell'orecchio per iniezione intradermica (d.d.). NOTA: Per il trasferimento adottivo di BBMCMC nella pinna dell'orecchio di topi a disinnesto mc, si consiglia di eseguire due iniezioni di 1 x 106 cellule ciascuna (per un totale di 2 x 106 cellule) per pinna dell'orecchio. L'innesto intradermico dei BBMCMC nell'apice dell'orecchio dei topi a disinfezione MC è stato utilizzato da molti investigatori in diversi modelli, tra cui modelli di anafilassi cutanea passiva (PCA)24,27,difesa ospite contro i veleno28e reazioni di ipersensibilità cronica (CHS)29,30.<ol>
<li>Contare e rimosodire le celle a 4 x 107 BCMC/ml (1 x 106 BBMCMC/ 25 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
		<li>Anestetizzare topi mc carenti di 4-6 settimane usando isoflurane (2,5% v/v). Controllare la profondità dell'anestesia con il dito del dito del giorno, regolare l'isoflurane se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la risposta delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per prevenire la secchezza degli occhi.</li>
		<li>Con l'indice, creare pressione verticale sulla faccia dorsale dell'pinna dell'orecchio per esporre ed allungare la faccia ventrale.</li>
		<li>Eseguire due iniezioni di 25 μl di soluzione BMCMC in due diversi siti della faccia ventrale della pinna dell'orecchio, la prima iniezione al centro dell'orecchio e la seconda iniezione verso la punta della pinna dell'orecchio. Attendere 4-6 settimane dopo l'innesto d.d. prima di eseguire esperimenti in vivo. Nota: Nella nostra esperienza, a quel punto il numero di MC/mm2 di derma nella parte centrale dell'pinna dell'orecchio è generalmente simile a quello nella posizione corrispondente nei topi di tipo selvatico,mentre il numero di MC/mm 2 nella periferia dell'pinna dell'orecchio è in genere sostanzialmente inferiore a quello dei corrispondenti topi di tipo selvatico27,28. Questo dovrebbe essere tenuto presente quando si progettano esperimenti con tali topi innestati mc(ad esempio,gli agenti con possibili effetti sulla funzione MC dovrebbero essere iniettati nella parte centrale dell'pinna dell'orecchio e l'analisi degli effetti di tali trattamenti dovrebbe concentrarsi anche su quell'area).</li>
	</ol></li>
	<li>Innesto della cavità peritoneale mediante iniezione intraperitoneale (i.p.). NOTA: Il trasferimento adottivo di BBMCMC nella cavità peritoneale dei topi a basso consumo di MC richiederà un'iniezione di 2 x 106 cellule per topo. Tali iniezioni di IBC in topi a basso consumo di MC sono state utilizzate da molti gruppi per studiare i ruoli dei MC peritoneali in vari modelli, inclusi i modelli di difesa ospite contro i veleno31 o la sepsi batterica32,33.<ol>
<li>Contare il numero appropriato di cellule e rimosi a 1 x 107 BCMC/ml (2 x 106 BCMC/ 200 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 25 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
		<li>Eseguire 1 iniezione di soluzione BMCMC da 200 μl nella cavità peritoneale di topi mc-carenti di 4-6 settimane. Attendere 4-6 settimane dopo l'innesto di i.p. prima di eseguire esperimenti in vivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Innesto per iniezione endovenosa (v.v.). NOTA: Il trasferimento adottivo di BBMCMC mediante iniezione i.v. in topi a disinnesto mc richiederà un'iniezione di 5 x 106 cellule per topo. Iniezioni endovenose (v.v.) di BBMCMC in topi a disinfezione MC sono state utilizzate da molti gruppi per studiare il ruolo delle MC in vari modelli di malattia, tra cui modelli di infezione della vescica34,asma35,fibrosipolmonare 36e artrite mediata da anticorpi37.<ol>
<li>Contare il numero appropriato di cellule e rimosi a 2,5 x 107 BCMC/ml (5 x 106 BCMC/200 μl) in DMEM freddo. Trasferire la soluzione BMCMC in una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G. Tenere sul ghiaccio fino all'iniezione.</li>
		<li>Anestetizzare topi mc carenti di 4-6 settimane usando isoflurane (2,5% v/v). Controllare la profondità dell'anestesia con il dito del dito del giorno, regolare l'isoflurane se indicato e continuare a monitorare la respirazione e la risposta delle dita dei piedi durante tutta la procedura. Applicare unguento oftalmico con una punta Q per prevenire la secchezza degli occhi.</li>
		<li>Eseguire un'iniezione di 200 μl di soluzione BMCMC nella vena di coda (o, in alternativa, nella vena retro-orbitale) di un topo a disinvolto MC. Attendere 12 settimane dopo l'innesto di i.v. prima di eseguire esperimenti in vivo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi dei topi a disinnestati carenti di cellule d'albero.
<ol><li>Analisi dell'innesto dell'orecchio.<ol>
<li>Alla fine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale.</li>
		<li>Isolare la pinna dell'orecchio e fissarla in formalina tamponata al 10% (vol/vol) durante la notte a 4 °C. Incorporare pinna fissa dell'orecchio in paraffina, tagliare sezioni di 4 μm di pinna dell'orecchio e montare su scivoli di vetro.</li>
		<li>Macchiare gli scivoli con una soluzione blu toluidina allo 0,1% per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Le diapositive di coverslip con supporto di montaggio, quindi contano il numero di MC innestati per sezioni pinnae utilizzando un microscopio a luce. Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale e la distribuzione di TC nella pelle dell'orecchio dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'innesto della cavità peritoneale.<ol>
<li>Valutazione del numero di mastociti nella cavità peritoneale.<ol>
<li>Alla fine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale. Rimuovere con cura la pelle ventrale dei topi senza rompere la cavità peritoneale.</li>
			<li>Iniettare 5 ml di PBS a temperatura fredda o ambiente nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 5 ml dotata di un ago da 25 G. Utilizzare PBS freddo per ridurre il rischio di attivazione delle cellule peritoneali (questo è molto importante quando si valuta la degranulazione MC peritoneale o i livelli di alcuni prodotti derivati da MC nel liquido di lavaggio peritoneale). Eseguire un massaggio dell'addome per 20 secondi per raccogliere le cellule peritoneali.</li>
			<li>Aspirare lentamente il lavaggio peritoneale utilizzando una siringa da 5 ml dotata di un ago da 22 G. Registrare il volume di lavanda aspirata (si prevede di recuperare fino all'80% del volume iniettato).</li>
			<li>Trasferire il liquido di lavanda peritoneale in un tubo inferiore rotondo in polistirolo da 5 ml e centrifugare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Aspira il supernatante. Recuperare il pellet in PBS freddo da 400 μl.</li>
			<li>Contare il numero totale di cellule peritoneali usando una camera emocitometrica. Utilizzare metà della sospensione cellulare per un'analisi della citometria di flusso (come descritto al passaggio 1.3.1), per valutare la percentuale e l'espressione marcatore delle TC innestati nella cavità peritoneale. Moltiplicare il numero totale di celle peritoneali per la percentuale di TC per ottenere il numero assoluto di TC peritoneali.</li>
			<li>Eseguire una citocentrifugazione con le cellule rimanenti come descritto al passaggio 1.3.2.2. Scivoli ad aria secca per 10 minuti a temperatura ambiente e disegnare un cerchio di cera intorno alle celle utilizzando una penna PAP.</li>
			<li>Coprire le celle con soluzione di colorazione May-Grünwald non diluita per 5 minuti, seguita da lavaggio in PBS per 5 minuti, entrambe a temperatura ambiente. Coprire le cellule con macchia di Giemsa diluita 1:20 con acqua deionizzata e incubare 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli 2 volte in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare l'aria.</li>
			<li>Copre le celle di rilipano utilizzando il supporto di montaggio e calcola la percentuale di MC innestati utilizzando un microscopio a luce (contando almeno 400 celle totali). Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale di TC nella lavanda peritoneale dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Valutazione delle mastociti nelle finestre mesenteriche.<ol>
<li>Seguendo il gabinetto peritoneale descritto nel passaggio 3.2.1, aprire la membrana peritoneale per esporre il tratto intestinale dei topi. Disporre da 4 a 5 finestre mesenteriche per mouse su una diapositiva.</li>
			<li>Fissare le diapositive per 1 ora in soluzione di Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol di etanolo, cloroformio e acido acetico glaciale) a temperatura ambiente. Scivoli ad aria asciutta e rimuovere l'intestino (le finestre mesenteriche fisse rimarranno attaccate alle diapositive).</li>
			<li>Macchiare i preparati per 20 minuti a temperatura ambiente con soluzione di colorazione Csaba (Blu alciano / Safranina O).<ol>
<li>Per fare 500 ml di macchia di Csaba, preparare 500 ml di tampone di acetato mescolando 100 ml di soluzione di acetato di sodio da 1 M con 120 ml di 1 M HCl. Quindi, sciogliere 90 mg di Safranina [identifica "MC maturi" in rosso], 1,8 g blu alciano [identifica "MC immaturi" in blu] e 2,4 g di solfato di ammonio ferrico NH4Fe(SO4)2 in 500 ml di tampone di acetato.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Le diapositive di coverslip con supporto di montaggio, quindi contano il numero di MC innestati per finestra mesenterica utilizzando un microscopio a luce. Valutare l'efficienza di innesto confrontando la percentuale e la distribuzione di TC nelle finestre mesenteriche dei topi innestati rispetto ai topi di tipo selvatico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dell'innesto I.v.<ol>
<li>Al termine dell'esperimento, eutanasiare i topi per inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale e raccogliere tessuti di interesse(ad esempio polmone, pelle o milza) e fissarsi durante la notte in formalina tamponata al 10% (vol/vol) a 4 °C.</li>
		<li>Incorporare tessuti fissi in paraffina, tagliare sezioni da 4 μm e montare su vetrini. Macchiare gli scivoli con una soluzione blu toluidina allo 0,1% per 1 minuto a temperatura ambiente. Lavare gli scivoli in acqua del rubinetto per 1 minuto, quindi asciugare all'aria gli scivoli per 10 minuti.</li>
		<li>Coverslip scorre utilizzando il supporto di montaggio e valuta il numero e la distribuzione dei MC innestati per sezioni di tessuto utilizzando un microscopio a luce.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Quasi 30 anni dopo la sua descrizioneiniziale 38,l'approccio'mast cell knock-in'continua a fornire preziose informazioni su ciò che i PC possono fare o non possono fare in vivo. Si pensava che le funzioni dei TC fossero limitate al loro ruolo nell'allergia. I dati generati utilizzando l'approccio "mast cell knock-in" hanno cambiato questa visione, fornendo prove che i MC possono, tra le altre funzioni, svolgere ruoli critici nella difesa dell'ospitecontro alcuni agenti patogeni...

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che derivano da progenitori pluripotenti del midolloosseo 1-3. A seguito dell'egressione del midollo osseo, i progenitori di MC migrano in vari tessuti dove si sviluppano in MC maturi sotto l'influenza di fattori dicrescita locali 1-3. I MC residenti nei tessuti si trovano strategicamente nelle interfacce host-ambiente, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale, dove si comportano come una prima linea di difesa contro gli insultiesterni 3-6. I MC sono spesso sottoclassificato in base alle loro caratteristiche fenotipiche "basale" e alle loro posizioni anatomiche. Nei topi sono stati descritti due tipi di TC: I MAT (CTMC) di tipo tessuto connettivo e i MC mucosi (MMC)1-3,7,8. I CTMC si trovano spesso intorno alle vene e vicino alle fibre nervose e risiedono in cavità sierosali, mentre gli MLC occupano posizioni intraepiteliali nell'intestino e nella mucosarespiratoria 1-3.
Numerose metodologie sono state applicate per studiare le funzioni biologiche dei MC9-13. Molti gruppi si sono concentrati su approcci in vitro utilizzando linee cellulari (come le linee MC umane HMC114 o LAD215,16),MC derivati in vitro (come MC17derivati dal sangue periferici umani o derivati dal midollo osseo del topo MC coltivati [BCMCC]18, MC coltivati derivati dalla pelle fetale [FCMCC]19 e MC peritoneali derivati da cellule [PCPC]20) o MC isolati ex vivo provenienti da diversi siti anatomici. Tutti questi modelli sono ampiamente utilizzati per studiare i dettagli molecolari della biologia MC, come le vie di segnalazione coinvolte nell'attivazione MC. Tuttavia, un aspetto importante della biologia delle CCI è che le loro caratteristiche fenotipiche e funzionali(ad esempio,contenuto di proteasi del granulo citoplasmatico o risposta a diversi stimoli) possono essere modulate dalla posizione anatomica e dal microambiente2,7. Poiché l'esatta miscela di tali fattori che si incontrano in vivo può essere difficile da riprodurre in vitro,favoriamo l'utilizzo di approcci in vivo per ottenere informazioni sulle funzioni9 delle TC.
Esistono diversi ceppi di topi con carenza genetica di MC, come i topi WBB6F1-Kit W/W-v o C57BL/6-Kit W-sh/W-sh. Questi topi mancano di espressione e/o attività di KIT (CD117), il recettore per il principale fattore di crescita MC fattore di crescita fattore di cellule staminali (SCF)21,22. Di conseguenza, questi topi hanno una profonda carenza di MC ma hanno anche anomalie fenotipiche aggiuntive legate alle loro mutazioni delkit c- (nei topi WBB6F1-Kit W/W-v) o agli effetti della grande inversione cromosomica che si traduce in una ridotta espressione delkit c- (nei topi C57BL/6-Kit W-sh/W-sh) 9,10,12,23. Più recentemente, diversi ceppi di topi con carenza di MC costitutiva indipendente dalkitc- sono stati segnalati24-26. Tutti questi topi e alcuni nuovi tipi aggiuntivi di topi inducibili a disinvolto mc sono stati recentemente esaminati indettaglio 9,10,13.
Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BBMCMC), il loro trasferimento adottivo in topi a disacienti mc e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo cosiddetto metodo "mast cell knock-in" può essere utilizzato per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% Antibiotic-Antimycotic Solution</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>30-004-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 ml Syringe</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>309656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm x 10 mm Dish</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml Polystyrene Round Bottom Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid Glacial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A35-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue 8GX</td>
			<td>Rowley Biochemical Danver</td>
			<td>33864-99-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra 6R Centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD16/32 (clone 93) Purified</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-0161-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 22G x1 (0.7 mm x 25 mm) Needles</td>
			<td>BD Precision Glide Needle</td>
			<td>205155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 25G 5/8 Needles</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30G x1/2 Needles</td>
			<td>BD Precision Glide</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue MAX Jr, 15 ml Polypropylene Conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoseal 60 Mounting Medium</td>
			<td>Richard-Allan Scientific</td>
			<td>8310-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytospin3</td>
			<td>Shandon</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DakoCytomation pen</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>15-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E 7023-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum Heat Inactivated</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F4135-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Conjugated IgG2b K Rat Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-4031-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isotiocyanate (FITC) Conjugated Anti-mouse KIT (CD117; clone 2B8)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>11-1171-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Giemsa Stain Modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>GS-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>29405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>May-Grunwald Stain</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MG-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiwell 6 well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35 3046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus BX60 Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast Plus Tissue Embedding Medium</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>23-021-400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Conjugated IgG Armenian Hamster Isotype Control</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-4888-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered-Saline (PBS) 1x</td>
			<td>Corning cellgro</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phycoerythrin (PE) Conjugated Anti-mouse FceRIa (clone MAR-1)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-5898-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium Iodide Staining Solution</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>00-6990-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse IL-3</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>213-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safranin-o Certified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T25 25 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flasks T75 75 cm2</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>353110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toluidine Blue 1 % Aqueous</td>
			<td>LabChem-Inc</td>
			<td>LC26165-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse SCF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-03</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyzing the functions of mast cells in vivo using 'mast cell knock-in' mice

Le mastociti (MC) sono cellule ematopoietiche che risiedono in vari tessuti e sono particolarmente abbondanti in siti esposti all'ambiente esterno, come la pelle, le vie aeree e il tratto gastrointestinale. Meglio noti per il loro ruolo dannoso nelle reazioni allergiche dipendenti dall'IgE, i MC sono anche emersi come attori importanti nella difesa dell'ospite contro il veleno e invadendo batteri e parassiti. Il fenotipo e la funzione MC possono essere influenzati da fattori microambientali che possono differire a seconda della posizione anatomica e/o in base al tipo o allo stadio di sviluppo delle risposte immunitarie. Per questo motivo, noi e altri abbiamo favorito approcci in vivo rispetto ai metodi in vitro per ottenere informazioni sulle funzioni MC. Qui descriviamo i metodi per la generazione di MC coltivati derivati dal midollo osseo del topo (BCMCC), il loro trasferimento adottivo in topi geneticamente carenti di MC e l'analisi del numero e della distribuzione di MC trasferiti adottivamente in diversi siti anatomici. Questo metodo, chiamato approccio"mast cell knock-in", è stato ampiamente utilizzato negli ultimi 30 anni per valutare le funzioni dei MC e dei prodotti derivati da MC in vivo. Discutiamo dei vantaggi e dei limiti di questo metodo, alla luce degli approcci alternativi sviluppati negli ultimi anni.

Una panoramica dell'approccio "mast cell knock-in" è mostrata nella Figura 1, e include la generazione di BBMCC, il numero di cellule che dovrebbero essere innestati i.p., i.d. o i.v. in topi mc-carenti (il numero può essere variato se indicato in base al progetto sperimentale) e l'intervallo tra l'innesto e l'esperimento a seconda del sito di iniezione (anche questo intervallo può variare, se indicato; ad esempio, ilcontenuto di mediatori immagazzinati nei granuli citoplasmatici MC ...

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Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l'analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.

Analisi delle funzioni delle mastociti in vivo usando topi ' Mast Cell Knock-in'

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

10.2K Views.  Stanford University School of Medicine. Descriviamo un metodo per la generazione di mastociti derivate in vitro, il loro innesto in topi carenti di mastociti, e l'analisi del fenotipo, dei numeri e della distribuzione delle mastociti innestati in diversi siti anatomici. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare le funzioni delle mastociti in vivo.

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Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un saggio di micropiastre per valutare gli effetti chimici su RBL-2H3 Mast cellule Degranulazione: Effetti del Triclosan senza l&#39;uso di un solvente organico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly synthesized allergic, inflammatory and immunoregulatory mediators. MCs&#8217; mediators affect multiple tissues and organs culminating in allergic and immune responses. The synthesis, storage and release of the MC mediators are highly regulated. The pre-formed mediators are packed in cytoplasmic secretory granules&#160;(SG) that fuse with the plasma membrane and release their content by regulated exocytosis. We present a protocol, based on the co-expression of a gene of interest with a reporter gene that is targeted to the SGs and is released in a regulated fashion alongside the endogenous SG mediators. The protocol enables high resolution four dimensional confocal analyses of the MC SGs and monitoring their timeline from biogenesis to triggered exocytosis. Thus, using this protocol for screening genes of interest for their phenotypic and functional impact allows deciphering the molecular mechanisms that govern the biogenesis and exocytosis of the MC SGs and identifying the regulators involved. Thereby, further insights into the cellular mechanisms that account for MCs function in health and disease should be provided.

The goal of the present&#160;protocol was to develop a method that will allow functional genomic analyses of mast cell secretion. The protocol is based on quantitative assessment of the release of a fluorescent reporter gene cotrasfected with the gene of interest and real time&#160;analyses of the secretory granule&#39;s morphology.

Indagare Mast Cellula secretoria Granuli; dal Biosintesi a Esocitosi

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando un test citometria a flusso basato su

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test per la determinazione della funzione citolitica di cellule T antigene-specifiche utilizzando un modello di vaccinazione

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolamento dei mastociti peritoneo-derivati e loro caratterizzazione funzionale con Ca2 +-imaging e degranulazione saggi

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a formidable defense against invading pathogens via diverse mechanisms. One major goal of vaccination is to induce protective antigen-specific antibodies to prevent life-threatening infections. Both thymus-dependent (TD) and thymus-independent (TI) antigens can elicit robust antigen-specific IgM responses and can also induce the production of isotype-switched antibodies (IgG, IgA and IgE) as well as the generation of memory B cells with the help provided by antigen presenting cells (APCs). Here, we describe a protocol to characterize TD and TI Ig isotype responses in mice using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In this protocol, TD and TI Ig responses are elicited in mice by intraperitoneal (i.p.) immunization with hapten-conjugated model antigens TNP-KLH (in alum) and TNP-polysaccharide (in PBS), respectively. To induce TD memory response, a booster immunization of TNP-KLH in alum is given at 3 weeks after the first immunization with the same antigen/adjuvant. Mouse sera are harvested at different time points before and after immunization. Total serum Ig levels and TNP-specific antibodies are subsequently quantified using Ig isotype-specific Sandwich and indirect ELISA, respectively. In order to correctly quantify the serum concentration of each Ig isotype, the samples need to be appropriately diluted to fit within the linear range of the standard curves. Using this protocol, we have consistently obtained reliable results with high specificity and sensitivity. When used in combination with other complementary methods such as flow cytometry, in vitro culture of splenic B cells and immunohistochemical staining (IHC), this protocol will allow researchers to gain a comprehensive understanding of antibody responses in a given experimental setting.

In this paper, we describe a protocol to characterize T-dependent and T-independent immunoglobulin (Ig) isotype responses in mice using ELISA. This method used alone or in combination with flow cytometry will allow researchers to identify differences in B cell-mediated Ig isotype responses in mice following T-dependent and T-independent antigen immunization.

Caratterizzazione delle risposte di isotipo dell'immunoglobulina timo-dipendenti e indipendenti del timo in topi usando l'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Generazione di cellule Knock-out NK umano primario ed espansa utilizzando Cas9 ribonucleoproteine

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and generation of high-affinity antibodies. In influenza virus infection, robust Tfh and GC B cell responses are induced to facilitate effective virus eradication, which confers a qualified mouse model for Tfh-associated study. In this paper, we described protocols in detection of basic Tfh-associated immune response during influenza virus infection in mice. These protocols include: intranasal inoculation of influenza virus; flow cytometry staining and analysis of polyclonal and antigen-specific Tfh cells, GC B cells and plasma cells; immunofluorescence detection of GCs; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of influenza virus-specific antibody in serum. These assays basically quantify the differentiation and function of Tfh cells in influenza virus infection, thus providing help for studies in elucidating differentiation mechanism and manipulation strategy.

This paper describes protocols of evaluating Tfh and GC B response in mouse model of influenza virus infection.