Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'epigenetica come i meccanismi di regolazione genica e le relazioni di causa ed effetto tra diversi elementi regolatori della cromatina. Il principale vantaggio di questa tecnica è che per la prima volta è possibile modulee un loci di cromatina con enzimi endogeni fisiologicamente rilevanti. Generalmente gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà perché la cultura ESL del mouse è intrinsecamente difficile per coloro che non sono stati addestrati nella tecnica.
Un'ulteriore dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto i passaggi di infezione virale cellulare sono difficili da imparare. Il ricercatore deve temporeggiare due linee separate di coltura cellulare ed è necessario monitorare attentamente la sicurezza durante queste fasi. Per iniziare il protocollo, passare 18 milioni di cellule HEK 293T per piastra di 50 centimetri.
Aspirare il vecchio supporto e aggiungere 10 millilitri di una salina tamponata con fosfato X, o PBS. Aspirare il PBS e aggiungere tre millilitri dello 0,05% di trippsina. Incubare le cellule in tripsiderina per otto minuti a 37 gradi Celsius.
Dondolare e toccare le cellule a metà dell'incubazione. Il giorno seguente, quando le cellule hanno raggiunto la confluenza dal 60 all'80%, eseguire una trasfezione di polietilenimina, o PEI. Successivamente, mescolare delicatamente il DNA, il PEI e i mezzi di trasfezione in un tubo conico da 15 millilitri.
Incubare il campione a temperatura ambiente per 15 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere la soluzione dropwise alla piastra di 15 centimetri. Quindi, incubare il campione per 16 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, aspirare il supporto e sostituirlo delicatamente con supporti HEK freschi e prebellici alle piastre da 15 centimetri. Dopo lo scambio di media, incubare le cellule in un incubatore Celsius di 37 gradi con 5% di anidride carbonica per 48 ore. Conta le cellule con un emocitometro.
Passaggio precedentemente preparato mESC in un formato a piastra di 12 po porsi con 100.000 cellule per pozzo un giorno prima dell'infezione. Per le celle coltivate in un formato di 10 centimetri, aspirare il vecchio supporto, aggiungere cinque millilitri di un X PBS, aspirare il PBS e aggiungere un millilitro dello 0,25% di tripside. Incubare le cellule in tripsiderina per otto minuti a 37 gradi Celsius e dondolare e toccare le cellule a metà dell'incubazione.
48 ore dopo lo scambio di supporti, rimuovere e trasferire il supernatante delle celle HEK 293T in un tubo conico da 50 millilitri. Centrifugare il supernatante a 300 volte G per cinque minuti per pellettare i detriti cellulari. Quindi, filtrare il supernatante attraverso una membrana da 0,45 micron.
Concentrare il virus tramite ultracentrifugo con un rotore SW32 e ruotare il campione a 72.000 volte G per due ore e mezza a quattro gradi Celsius. Mentre il virus si concentra sotto ultracentrifugazione, trattare i CIA mESC nella piastra di 12 pozzi con gambo embrionale fresco o mezzi ES contenenti cinque microgrammi per millilitro di Polibrene. Al termine della concentrazione del virus, aspirare accuratamente il supernatante e sospendere attentamente il pellet del virus in 100 microlitri di un X PBS per evitare bolle in eccesso.
Aggiungere il virus e un X PBS a un tubo di microfugo da 1,5 millilitri. Vortice il tubo all'impostazione più bassa per sospendere completamente il virus. Girare il tubo in una mini centrifuga da tavolo per cinque-10 secondi per rimuovere le bolle.
Aggiungere 30 microlitri del virus ad ogni pozzo di una piastra da 12 porri. Ruotare la piastra e quindi centrifugare i campioni a 1000 volte G per 20 minuti. Posizionare la piastra di 12 pozzi nell'incubatore di 37 gradi Celsius durante la notte.
La mattina seguente, scambiare i media con nuovi mezzi ES e consentire l'infezione per 48 ore. Dopo 48 ore di infezione, selezionare per le cellule che hanno integrato il plasmide virale aggiungendo l'antibiotico appropriato. Cambia i media ogni giorno.
Conservare il supporto di selezione sulle celle per 72-96 ore in un incubatore di 37 gradi Celsius con anidride carbonica del 5%. Continuare con modificatore epigenetico chimico, o CEM, preparazione e trattamento sospendendo il CEM in polvere e il solfossido di dimetile, o DMSO, a una concentrazione di magazzino di un millimolare e una concentrazione di lavoro di 100 micromolare. Dopo che le celle sono state sottoposte a selezione per 72-96 ore, dividere le mESC in un formato a 12 pozzi con 100.000 celle per pozzo.
Incubare le cellule in un incubatore celsius di 37 gradi con 5% di anidride carbonica per 24 ore. Dopo l'incubazione, preparare una soluzione media di CEM nanomolare 100 con mezzi ES. Usa i supporti per alimentare il CIA mESC con un pozzo millilitro.
Mantenere un pozzo di celle senza alcun CEM aggiunto per fungere da controllo. Successivamente, cambiare i supporti aspirando i vecchi supporti e aggiungendo un millilitro per pozzo CEM appena preparato contenente o supporti ES senza CEM ogni 24 ore per tutta la durata dell'esperimento. Dopo 48 ore di trattamento CEM, immagini le cellule senza trattamento CEM nelle cellule trattate con CEM nanomolare 100 utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Scatta immagini rappresentative usando la fase o il campo luminoso per registrare la morfologia mESC con un ingrandimento da 10 a 40 volte. Le cellule avrebbero dovuto formare attorno a colonie con alcune cellule differenziate. Sotto il canale di fluorescenza FITC, immagini entrambe le condizioni cellulari.
Successivamente, isolare le cellule di controllo e trattate con CEM per la citometria del flusso aspirando il mezzo, lavando le celle con un millilitro di un X PBS, aspirando il PBS e aggiungendo 0,25 millilitri dello 0,25% di tripside con EDTA per otto-10 minuti. Verificare che le cellule non siano più raggruppate in grandi grumi attraverso il microscopio utilizzando l'ingrandimento 20 volte superiore. Se le celle non sembrano essere in una singola sospensione cellulare, pipettarle delicatamente su e giù con una pipetta P1000 per tripinare completamente le cellule.
Dissetare la tripina con un millilitro di mezzi freschi e rimorsiva le cellule ad alta velocità con una pipetta sierologica fino a quando le cellule non sono in una singola sospensione cellulare. Quindi, far girare le cellule a 300 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente. Aspirare il supernatante, lavare le cellule con un X PBS e centrifugare le cellule.
Aspirare il supernatante PBS e rimescolare il pellet cellulare in 200 microlitri di tampone FACS. Eseguire la citometria a flusso su circa 50.000 cellule con le cellule sospese ed eseguire i campioni a una velocità di sheath di circa 5.000 cellule al secondo. Infine, esportare i dati per ulteriori analisi.
Le immagini di fase del sistema CEM presso il locus Oct4 e il CIA mESC sono immagini dopo 48 ore di trattamento con 100 nanomolari di CEM23 o con cellule non trattate indicano una specifica repressione della GFP. Le immagini fluorescenti mostrano un'espressione GFP brillante nelle celle di controllo e un'espressione GFP ridotta in mESC trattata con CEM23. La citometria del flusso ha costantemente rivelato una diminuzione superiore al 30% dell'espressione della GFP negli mESC della CIA trattati con 100 nanomolari di CEM23 per 48 ore.
L'immunoprecipitazione della cromatina, o CHIP, ha rivelato che 48 ore di trattamento con 100 nanomolari di CEM23 hanno diminuito il livello di H3K27ac al locus bersaglio rispetto alle cellule di controllo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di stare attenti con le cellule staminali embrionali del topo. Se si differenziano durante il protocollo, i risultati verranno annullati.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della biologia sintetica per esplorare i meccanismi in vivo nel genoma dei mammiferi.
