Name: mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis
Uploaded: 2015-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Canadian Institutes of Health Research e Heart and Stroke Foundation of BC &amp; Yukon (CCM).

Tutti i protocolli di questo studio sono stati esaminati e approvati dal comitato etico per la cura degli animali Simon Fraser University. Utilizzare Balb / CYJ (H2 d) topi donatori e topi C57BL / 6 (H2 b) destinatario per esaminare le reazioni allogeniche. I topi sono utilizzati per esperimenti di età compresa tra 8 a 12 settimane tra. Utilizzare i topi o sesso femminile o maschile. Controlli singenico costituiti da segmenti aortici da C57Bl / 6 donatori in C57BL / 6 destinatari. 1. donatore e del ricevente Preparazione Nota: Sia il donatore e il ricevente sono anestetizzati e preparati prima della chirurgia per ridurre al minimo l&#39;ischemia dell&#39;innesto. Anestetici iniettabili sono utilizzati nel protocollo per impedire l&#39;ostruzione dell&#39;animale da attrezzature necessarie per l&#39;erogazione di anestetici inalatori. Tuttavia, se desiderato, l&#39;anestetico inalato è un&#39;alternativa appropriata. Dalla iniezione iniziale degli anestetici, l&#39;intera procedura richiede circa 90 minuti per completare. Tempo ischemica dell&#39;innesto è meno than 30 min. <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg, 1 mg / ml). Il mouse sarà sedato entro 10 o 15 minuti. Valutare la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la parte grassa del pad piede animale. Somministrare 1/3 della dose originale del cocktail anestetico, come necessario, fino a quando l&#39;animale non presenta recesso reflex. Monitorare la frequenza respiratoria strettamente dopo ogni cocktail viene somministrato. Durante l&#39;intervento, valutare il livello di anestesia ogni 15 minuti pizzicando la parete addominale anteriore con un paio di pinze. I topi dovrebbe rimanere profondamente anestetizzati per 60 a 90 min. </li><li> Lubrificare gli occhi del topo con una pomata oftalmica per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Radere capelli come vicino alla pelle il più possibile sulla regione ventrale addominale dalla metà del torace al pube. Prestare particolare attenzione a non nick tutta la pelle. Non usare la crema depilatoria perché può essere assorbito into la pelle e potrebbe essere infiammatorio. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina su un asciugamano sopra il tavolo riscaldamento o pad. </li><li> Pulire il sito chirurgico con uno scrub preliminare con il 2% clorexidina. Preparare una grande area di lavoro per massimizzare il campo chirurgico. Avviare lavaggio al centro del sito chirurgico e spostare verso l&#39;esterno in modo lineare o circolare. Smaltire la garza. Ripetere questa procedura almeno 5 volte di più. Applicare un tampone di alcool preparazione alla stessa area. Una volta che l&#39;alcol è asciutto, preparare l&#39;area pulita con una soluzione di Betadine e drappeggio con garza sterile. </li></ol> Anastomosi procedura 2. end-to-end <ol><li> Donor Operazione <ol><li> Mantenere tecnica asettica durante tutta l&#39;operazione. Pulire tutte le superfici del controsoffitto e da tavolo chirurgico con 0,5% di soluzione di perossido di idrogeno accelerato prima dell&#39;uso. Avvolgere e autoclave tutti chirurgiche strumenti, garze, tende e abiti prima dell&#39;uso. Verificare la sterilità degli strumenti con un bagno turcostriscia indicatrice sterilizzatrice posto in ogni confezione. Guanti chirurgici sterili vengono usati e smaltiti tra interventi chirurgici. In caso di più interventi chirurgici, sterilizzare gli strumenti chirurgici tra impieghi con il caldo perle di vetro sterilizzatore. </li><li> Posizionare il mouse donatore in posizione supina su una superficie pulita, consiglio plexiglas sottile avvolto con telo sterile sotto il microscopio operatorio a 8-30X ingrandimento. </li><li> Dopo aver verificato l&#39;anestesia chirurgica adeguati come indicato nella sezione 1.1, procedere con un intervento chirurgico. </li><li> Utilizzando forbici sterili, fare un unico mediana inferiore incisione longitudinale addominale, dal pube al processo xifoideo. </li><li> Usando un piccolo divaricatore, aprire le pareti addominali per esporre la cavità. </li><li> Utilizzando cotone sterile con punta applicatori, ritrarre delicatamente l&#39;intestino superiormente all&#39;animale di sinistra e coprire con una garza inumidita con soluzione fisiologica. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente e individuare sottorenale e la vena cava inferiore (IVC). Moisdieci tessuti esposti periodicamente con soluzione salina. </li><li> Utilizzando i No. medico 5 pinze, separare l&#39;aorta dal IVC, dal livello dell&#39;arteria renale sinistra alla biforcazione. Utilizzare 10-0 monofilamento poliammide per legare i piccoli rami in prossimità dell&#39;aorta. </li><li> Una volta aorta del donatore è stato separato dal IVC, saturare il recipiente con soluzione salina, coprire la cavità esposta con garza inumidita e impostare il donatore parte su una zona sterile. Controllare lo stato del donatore (funzione respiratoria e cardiovascolare, e la profondità dell&#39;anestesia) ogni 15 min. Inizia operano sul destinatario, isolando l&#39;aorta come descritto di seguito (passaggi da 2.2.1 a 2.2.7). </li><li> Una volta che l&#39;aorta destinatario è stato separato dal IVC e mettere da parte, restituire il donatore sotto il microscopio. Morsetto a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) dell&#39;aorta donatore, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti 4 millimetri microvascolari. </li><li> Utilizzando le microscissors Vannas-Tübingen,transezione un piccolo segmento graft (3 a 4 mm di lunghezza) dell&#39;aorta addominale. </li><li> Utilizzando un ago 25 G 5/8 attaccato ad una siringa, svuotare l&#39;aorta escissa con eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina. Assicurare la punta dell&#39;ago non venire a contatto con il recipiente. </li><li> Luogo aorta in eparina (100 U / ml) di soluzione salina in ghiaccio e mettere da parte. Mentre era ancora sotto anestesia profonda, rilasciare i morsetti microvascolari. Euthanize il donatore per dissanguamento. </li><li> Impiantare la nave cedente entro 30 min di escissione. Anche se è possibile utilizzare una nave cedente per più destinatari escissione una lunghezza maggiore di aorta, mantenere il tempo ischemico per meno di 30 min. </li></ol></li><li> Operazione Destinatario <ol><li> Mantenere asettiche durante l&#39;operazione, come nel funzionamento donatore. </li><li> Posizionare il mouse destinatario in posizione supina su una tavola di plexiglas sottile avvolto con telo sterile sotto il microscopio operatorio a 8-30X ingrandimento. </li><li> After garantire un&#39;adeguata anestesia, procedere con la chirurgia quando l&#39;animale non presenta ritiro reflex. </li><li> Utilizzando forbici sterili, fare un unico mediana inferiore incisione longitudinale addominale, dal pube al processo xifoideo. </li><li> Usando un piccolo divaricatore, aprire le pareti addominali per esporre la cavità. </li><li> Utilizzando cotone sterile con punta applicatori, ritrarre delicatamente l&#39;intestino superiormente all&#39;animale di sinistra e coprire con una garza inumidita con soluzione fisiologica. Spostare gli organi riproduttivi inferiormente e individuare sottorenale e IVC. Bagnare i tessuti esposti periodicamente con soluzione salina. </li><li> Separare l&#39;aorta dal IVC, dal livello dell&#39;arteria renale sinistra alla biforcazione. Se necessario, utilizzare 10-0 suture monofilamento poliammide per legare i piccoli rami vicino l&#39;aorta. </li><li> Morsetto a croce (prossimale e distale al segmento di interesse) dell&#39;aorta, a circa 5 mm di distanza, con due morsetti 4 millimetri microvascolari. </li><li> Utilizzando le microscissors Vannas-Tübingen, fare un unico aortotomy orizzontale e resecare un piccolo segmento (non più di 0.5 mm) dell&#39;aorta addominale per accogliere il donatore trapianto aortica. </li><li> Lavare l&#39;aorta escissa con eparinizzata (100 U / ml) di soluzione salina. Il trapianto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare le estremità aortica transected del destinatario. </li><li> Posizionare il donatore trapianto aortica in posizione ortotopica e anastomosi fine innesto del donatore alla fine del destinatario, che corrisponde con la graft orientamento anatomico con quello del destinatario. </li><li> Afferrare il externa tunica della nave e rovesciare leggermente con le pinze No.5 mediche. Utilizzando le pinze, guidare l&#39;ago per il gol del 10-0 poliammide monofilamento sutura attraverso l&#39;intero spessore della parete del vaso, al fine di garantire l&#39;innesto aortico donatore nave resezione del destinatario. Prestare attenzione al fine di garantire che l&#39;apertura nave non è chiusa a causa to cucitura involontaria della parete di fondo del recipiente. </li><li> Per punti continui, posizionare suture alle 9 entrambe le estremità superiore ed inferiore dell&#39;innesto. Partendo all&#39;estremità superiore dell&#39;innesto dalle 3, anastomosi le estremità resecate con 2 suture corsa e fissare la sutura al soggiorno suture. <ol><li> Capovolgere l&#39;innesto sopra e continuare la sutura corsa per dorsale parte della nave, incontrando il soggiorno provenienza di sutura. Fissare senza applicare molta pressione sulla nave. Ripetere la sutura per l&#39;anastomosi inferiore. Nota: i punti staccati iniziano allo stesso modo come la sutura continua con l&#39;eccezione che la nave è anastomizzato con tre punti separati fra le suture. Tempo anastomosi è di solito di 20 min. </li></ol></li><li> Una volta che l&#39;anastomosi è completa, rilasciare il morsetto microvascolare distale per permettere al sangue di fluire retrogrado e controllo delle perdite dei siti anastomizzato. Se vi è una perdita, immediately posizionare un punto di chiudere il sito difettoso. Se non c&#39;è sanguinamento nei siti, quindi rilasciare il morsetto prossimale. </li><li> Esaminate il trapianto e verificare che non vi siano ostacoli sangue nel trapianto, e prossimale e distale del vaso del destinatario. Vigoroso modello impulso nel recipiente sia il destinatario del donatore e di una indicazione primaria che il sangue scorre liberamente. Utilizzando la coppia di pinze, afferrare delicatamente un&#39;estremità delle suture e rovesciare leggermente il vaso di ispezionare la parete di fondo del recipiente. Nota: Non ci dovrebbero essere increspature della parete del vaso ad entrambe le estremità dei siti anastomizzato. Scadente flusso sanguigno dopo la rimozione dei morsetti è un segno di trombosi. </li><li> Utilizzando cotone punta applicatori, restituire l&#39;intestino nella cavità addominale. </li><li> Con il porta-aghi Castroviejo e pinze Graefe, chiudere la parete addominale con 5-0 punti di sutura in polipropilene con cucitura continua. Chiudere lo strato di pelle con la stessasuture con chiusura sottocuticolare. </li><li> Somministrare immediatamente Torbugesic (1 mg / kg) im al termine del trapianto. </li><li> Dare immediatamente, nell&#39;ordine, Atipamezolo (1 mg / kg), ketoprofene (5 mg / kg) e riscaldato soluzione sottocutanea Ringer lattato. </li><li> Immediatamente dopo l&#39;intervento chirurgico, collocare topi in una gabbia riscaldato sotto una coperta acqua per una notte (12 ore). Durante il periodo di anestetico recupero, posizionare gli animali da solo in un ambiente pulito zona libera asciutta,. Linea gabbia (autoclave) con carta assorbente pulita e regolare la temperatura della coperta di acqua a circa 20 a 22 ° C. Fornire crocchette secche e umide ad libitum sul pavimento della gabbia. Nota: Una componente importante di cura post-chirurgica è l&#39;osservazione dell&#39;intervento animali e opportuno, come richiesto, durante il recupero da anestesia e chirurgia. L&#39;intensità necessaria di monitoraggio varia con l&#39;animale e potrebbe essere maggiore durante il periodo di recupero anestetico immediato come compared a tardi nel recupero post-operatorio. </li><li> Continuamente controllare gli animali che hanno subito l&#39;anestesia monitorati fino a che non guariscono completamente. L&#39;animale deve essere in grado di mantenere senza aiuto decubito sternale e deve apparire calmo e priva di dolore prima di poter essere lasciato incustodito. </li><li> Dare buprenorfina (0,1 mg / kg BID) e ketoprofene (5 mg / kg SID) per un periodo di tre giorni, sia per via sottocutanea. </li><li> Monitorare cardiovascolare e la funzione respiratoria, la temperatura corporea, e il dolore post-operatorio o disagio durante il recupero dall&#39;anestesia per un minimo di tre giorni. Cura supplementare può essere richiesto, come ad esempio la somministrazione di analgesici e altri farmaci, e liquidi per via parenterale per ridurre al minimo la disidratazione e la perdita di elettroliti. </li><li> Valutare il successo della chirurgia dei trapianti osservando la funzione motoria degli arti posteriori. Completa il successo del trapianto comporta ostruita flusso di sangue al dell&#39;arto posteriore e la coda, che dovrebbe essere immediata recupero del Animal, e il recupero completo senza paralisi degli arti posteriori il secondo giorno </li></ol></li></ol> 3. Tissue Collection Nota: punti finali predeterminata gamma 3-60 giorni a seconda del tipo di analisi desiderata e la natura del disallineamento antigene. In generale, ispessimento intimale è robusto a 30 giorni dopo il trapianto attraverso complete MHC ceppi di topi non corrispondenti. <ol><li> Anestetizzare il mouse con iniezioni intraperitoneali di ketamina (100 mg / kg; 10 mg / ml) e xilazina (10 mg / kg, 1 mg / ml). Valutare la profondità dell&#39;anestesia pizzicando la parte grassa del pad piede animale. Procedere con la chirurgia quando l&#39;animale non presenta ritiro reflex. </li><li> Pulire il sito chirurgico con acqua e termina con il 70% di alcol. </li><li> Posto l&#39;animale in posizione supina su un vassoio rivestito con tampone assorbente. </li><li> Aprire la cavità addominale con una incisione longitudinale grande linea mediana. Posizionare un divaricatore di auto-mantenimento per esporre la cavità, l&#39;una IVCd l&#39;aorta addominale. </li><li> Separare delicatamente il segmento aortico donatore trapiantato dalla vicina IVC con un paio di n medico 5 pinze. Prestare particolare attenzione a non mettere a nudo l&#39;avventizia della nave trapiantato. </li><li> Esporre la cavità toracica tagliando attraverso le nervature lungo entrambi i lati della colonna vertebrale toracica fino toracico. Riflettere parete toracica anteriore superiormente per esporre il pericardio e fissare la gabbia toracica con un paio di emostatico. </li><li> Una volta che il cuore è esposto, inserire un ago 25 G 5/8 (attaccato ad una siringa) nel ventricolo sinistro ea filo con 0,1 ml di soluzione salina eparinizzata (100 U / ml). </li><li> Utilizzando un paio di forbici, rimuovere l&#39;atrio destro per permettere al sangue, soluzione salina eparinizzata e fissativo per lasciare il corpo durante la perfusione. Profumato l&#39;animale con 5 ml di paraformaldeide al 4% o fino a quando viene eseguito il liquido chiaro. Rimuovere il cuore al fine di garantire l&#39;eutanasia. </li><li> Excise trapiantato segmento nave e immergere nel 4% paraformaldeide per non più di un&#39;ora. Impostare la nave trapiantato in OCT (temperatura ottimale di taglio) matrice e flash freeze. Sezione della nave in un criostato fissato a 8 spessori um. Sezioni Macchia con Ematossilina e eosina e / o Verhoeff-van Gieson (van Gieson) macchia elastico. </li></ol> 4. Analisi morfologica di innesti Nota: TA è caratterizzata da ispessimento intimale 13. In questo modello, ispessimento intimale e una conseguente riduzione delle dimensioni del lume sono riflettenti della gravità delle lesioni vascolari immuno-mediata. Controlli Syngraft vengono utilizzati per determinare le caratteristiche di base delle navi, in assenza di risposte immunitarie allogenici. Questi controlli permettono anche la valutazione del danno arterioso che si verifica come risultato della procedura chirurgica. Non ci dovrebbero essere ispessimento intimale in syngrafts. <ol><li> Per esaminare ispessimento intimale e luminale occlusione, misurare l&#39;area all&#39;interno della cellula endotelialestrato, lamina interna elastica (IEL) e lamina elastica esterna (EEL) su elastici van Gieson segmenti delle arterie macchiato con un software di analisi delle immagini. I parametri di seguito possono essere utilizzati per determinare i cambiamenti arteriosi riflettenti di TA. <ol><li> Misurare l&#39;area intimale assoluto: area all&#39;interno della lamina elastica interna - l&#39;area all&#39;interno dello strato di cellule endoteliali. Ciò fornisce una misura assoluta di espansione intimale, che è il segno distintivo di TA. </li><li> Misurare l&#39;area mediale assoluto: area all&#39;interno della lamina elastica esterna - area all&#39;interno della lamina elastica interna. Questo fornisce una misura assoluta di degradazione mediale o di crescita, che occasionalmente può verificarsi a seguito di variazioni immunomediate a questa regione della parete del vaso. </li><li> Misurare l&#39;area totale del vaso come l&#39;area all&#39;interno della lamina elastica esterna. Questo fornisce una misura del rimodellamento nave che coinvolge espansione o costrizione di un&#39;arteria a causa di danno immunologico. </li><li> Misural&#39;intima / Media: (area all&#39;interno della lamina elastica interna - area all&#39;interno dello strato di cellule endoteliali) / (area all&#39;interno della lamina elastica esterna - area all&#39;interno della lamina elastica interna). Ciò fornisce una misura relativa di espansione intimale e normalizza le differenze di dimensioni delle navi. </li><li> Misurare la Restringimento% Luminal: [(area all&#39;interno della lamina elastica interna - area all&#39;interno dello strato di cellule endoteliali) / area con la lamina elastica interna)] * 100. Questo fornisce una misura del grado di occlusione del lume, che deriva da una combinazione di espansione intimale e rimodellamento (verso l&#39;interno o verso l&#39;esterno) della parete del vaso. </li></ol></li></ol>

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	<li>Billingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft+coronary+disease:+the+lesions+and+the+patients.">Graft coronary disease: the lesions and the patients.</a> Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).</li><li>Foegh, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+rejection--graft+arteriosclerosis.">Chronic rejection--graft arteriosclerosis.</a> Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).</li><li>Libby, P., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+rejection.">Chronic rejection.</a> Immunity. 14, 387-397 (2001).</li><li>Tellides, G., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+axis+in+graft+arteriosclerosis.">Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis.</a> Circulation research. 100, 622-632 (2007).</li><li>Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spectrum+of+coronary+artery+pathologic+findings+in+human+cardiac+allografts.">The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts.</a> The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).</li><li>Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerated+coronary+vascular+disease+in+the+heart+transplant+patient:+coronary+arteriographic+findings.">Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings.</a> Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).</li><li>Mennander, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+rejection+in+rat+aortic+allografts.+An+experimental+model+for+transplant+arteriosclerosis.">Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis.</a> Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).</li><li>Choy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzymes+and+perforin+in+solid+organ+transplant+rejection.">Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection.</a> Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).</li><li>Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recipient+cells+form+the+intimal+proliferative+lesion+in+the+rat+aortic+model+of+allograft+arteriosclerosis.">Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis.</a> Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).</li><li>Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracardiac+progenitor+cells+repopulate+most+major+cell+types+in+the+transplanted+human+heart.">Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart.</a> Circulation. 112, 2951-2958 (2005).</li><li>Yu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AIP1+prevents+graft+arteriosclerosis+by+inhibiting+interferon-gamma-dependent+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion.">AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion.</a> Circ Res. 109, 418-427 (2011).</li><li>Miller, C., DeWitt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+humoral+responses+to+major+and+minor+histocompatibility+antigens.">Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens.</a> Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumen+loss+in+transplant+coronary+artery+disease+is+a+biphasic+process+involving+early+intimal+thickening+and+late+constrictive+remodeling:+results+from+a+5-year+serial+intravascular+ultrasound+study.">Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study.</a> Circulation. 104, 653-657 (2001).</li><li>Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bim+regulates+allogeneic+immune+responses+and+transplant+arteriosclerosis+through+effects+on+T+cell+activation+and+death.">Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).</li><li>Ho, M. K., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+distribution,+structural+characterization,+and+biosynthesis+of+Mac-3,+a+macrophage+surface+glycoprotein+exhibiting+molecular+weight+heterogeneity.">Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity.</a> J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).</li><li>Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+macrophages+that+overlap+in+specificity+with+fibroblasts.">Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts.</a> Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+basis+of+transplant-associated+arteriosclerosis.">Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).</li><li>Skaro, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8++T+cells+mediate+aortic+allograft+vasculopathy+by+direct+killing+and+an+interferon-gamma-dependent+indirect+pathway.">CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway.</a> Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).</li><li>Tellides, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+elicits+arteriosclerosis+in+the+absence+of+leukocytes.">Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes.</a> Nature. 403, 207-211 (2000).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+induces+human+vascular+smooth+muscle+cell+proliferation+and+intimal+expansion+by+phosphatidylinositol+3-kinase+dependent+mammalian+target+of+rapamycin+raptor+complex+1+activation.">Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation.</a> Circ Res. 101, 560-569 (2007).</li><li>Soulez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perlecan+fragment+LG3+is+a+novel+regulator+of+obliterative+remodeling+associated+with+allograft+vascular+rejection.">The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection.</a> Circ Res. 110, 94-104 (2012).</li><li>Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perforin+mediates+endothelial+cell+death+and+resultant+transplant+vascular+disease+in+cardiac+allografts.">Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts.</a> Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).</li><li>Choy, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Granzyme+B+induces+endothelial+cell+apoptosis+and+contributes+to+the+development+of+transplant+vascular+disease.">Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease.</a> Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).</li><li>Reis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dramatic+remodeling+of+advanced+atherosclerotic+plaques+of+the+apolipoprotein+E-deficient+mouse+in+a+novel+transplantation+model.">Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model.</a> Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).</li><li>Potteaux, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppressed+monocyte+recruitment+drives+macrophage+removal+from+atherosclerotic+plaques+of+Apoe-/-+mice+during+disease+regression.">Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression.</a> J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).</li></ol>

Abbiamo descritto un protocollo per interposizione aortica innesti in topi che è utile per studiare il rigetto vascolare immunomediata e TA. Questo modello può essere utilizzato per analizzare le cause dei TA nonché lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche. E &#39;stato usato in passato per stabilire un ruolo essenziale di immunità adattativa, citotossici risposte delle cellule T, le risposte effettrici CD4 T cellule citochine-mediata, e danni trapianto mediata da anticorpi in TA 14,17-21. Trapianto Artery nei topi è difficile a causa delle piccole dimensioni evidente dell&#39;animale; tuttavia, con la pratica e la dovuta diligenza, interventi chirurgici di successo può essere realizzato. Il successo dipende la pervietà del vaso. Ciò comporta assicurando che l&#39;innesto non sia danneggiato gestendo impropriamente nave con una pinza, costrizione del lume del vaso, sutura della parete posteriore della nave, e la sutura ripetitiva dello stesso sito. Perdita della nave è anche problematico e richiede attenzione per postaNsure che il numero e la posizione dei punti sono divisi in modo uniforme intorno alla parete del vaso. È anche essenziale che l&#39;ischemia innesto è ridotto al minimo per meno di 30 minuti. Con questo, un tasso di successo superiore al 95% può essere raggiunto. L&#39;aorta è il più grande arteria del mouse in modo tale procedura è il più semplice approccio microchirurgico per indagare rigetto vascolare in questo modello animale. Inoltre, il segmento aortico si innesta in una posizione fisiologicamente rilevanti, sperimenta normale flusso di sangue, e ispessimento intimale sviluppa rapidamente. L&#39;altro modello principale utilizzato per la valutazione del rigetto vascolare e TA è il trapianto cardiaco eterotopico, che ha il vantaggio di esaminare lo sviluppo di TA in arterie coronariche e nel contesto del trapianto di cuore che è lo scenario clinico più rilevante per TA. Tuttavia, trapianti di cuore eterotopici sono collocati in una posizione non fisiologica all&#39;interno del corpo (di solito anastamosed alla vena cava eaorta nell&#39;addome) e il cuore non pompa sangue attraverso i ventricoli a causa della natura retrograda della fornitura di sangue al cuore trapiantato. Come tale, la natura del flusso di sangue attraverso l&#39;albero coronarico potrebbe essere diverso da quello normalmente sperimentato da vascolatura coronarica 22,23. Inoltre, le strategie per superare il rigetto acuto del cuore deve essere incorporato per valutare cambiamenti arteriosi. In entrambi i modelli, è importante scegliere con attenzione il tipo di antigene disadattamento utilizzato per essere in grado di affrontare adeguatamente questioni specifiche relative al rigetto vascolare e TA. In sintesi, aortico interposizione innesto è una tecnica potente per studiare danni arteriosa immuno-mediata e TA. Può essere masterizzato routine con la pratica e diligenza da parte del ricercatore. Una volta masterizzato, questa procedura può essere modificata per l&#39;innesto interposizione di altri segmenti arteriosi, come la carotide, thpresso può consentire l&#39;esame delle ulteriori questioni scientifiche. Inoltre, l&#39;uso di questo modello può essere esteso oltre lo studio del trapianto. Interposizione innesto delle arterie può essere utilizzato per introdurre segmenti arteriosi da modificata (es transgenici o lipidi alimentati) in topi omologhi non modificato, o viceversa, per isolare gli effetti biologici di molecole alle cellule delle pareti dell&#39;arteria contro cellule della parete non-arteriose 24 , 25.

Nel corso degli ultimi 30 anni, i progressi in materia di farmaci immunosoppressori sono diminuiti rigetto del trapianto a causa di rigetto acuto, ma il rigetto cronico rimane una sfida. La manifestazione principale del rigetto del trapianto cardiaco cronico è arteriosclerosi trapianto (TA) 1,2. Questa condizione è caratterizzata da iperplasia intimale e vasomotoria disfunzione delle arterie allogenico e si sviluppa come risultato di immunologica Il targeting delle cellule muscolari lisce endoteliali e dal sistema immunitario ricevente. La gestione mirata del sistema vascolare del trapianto a causa di riconoscimento del complesso di istocompatibilità straniera peptide-major (MHC) è evidenziata dallo sviluppo di TA esclusivamente nelle arterie innesto risparmiando vasi ospitanti 3. In linea con questo è l&#39;osservazione che TA non si verifica sperimentalmente quando il destinatario è geneticamente identico al donatore o quando il destinatario manca cellule T e B 4. Danno vascolare immuno-mediata e dysfunction provoca lo sviluppo di ispessimento intimale e fibrosi, così come l&#39;accumulo anormale di lipidi e proteine ​​ECM, in TA 5. Ispessimento intimale tende ad essere concentrici in tutto l&#39;albero arterioso 4-6. Perdita del trapianto e la morte di solito si verificano a seguito di ischemia progressiva derivante dalla occlusione del lume delle arterie allotrapianto 4. Nel 1991, Mennander et al. 7 ha favorito un modello di interposizione aortica nei ratti per modellare TA. Diversi gruppi hanno successivamente adattato questo procedimento per l&#39;utilizzo nei topi. In questo modello, i segmenti aortici trapianto allogenico di sviluppare lesioni che hanno caratteristiche analoghe a TA osservate nei trapianti clinici. Questo include ispessimento intimale caratterizzata da accumulo di cellule come-muscolari lisce e leucociti destinatari 7. Nel corso degli ultimi 2 decenni questo modello è stato utilizzato per generare importanti informazioni sui meccanismi di danno vascolare, il rifiuto e TA. Può essere noied esaminare le questioni relative alla risposta immunitaria e vascolari durante la patologia arteriosa. La scelta degli impatti antigene disadattamento la capacità di affrontare in modo appropriato a queste domande. Trapianto attraverso le barriere complete MHC permette una valutazione completa delle risposte immunitarie che sono noti per essere coinvolti nel rigetto dei trapianti d&#39;organo. Questo include il riconoscimento delle cellule CD4 e CD8 T diretta e la destinazione di stranieri peptide-MHC presentato da cellule innesto di derivazione, CD4 indiretta (e possibilmente CD8) il riconoscimento delle cellule T e la destinazione dei alloantigeni innesto di derivazione presentati da antigene destinatario presentano cellule, e anticorpi riconoscimento mediata di alloantigeni sulla superficie delle cellule vascolari 8. Tuttavia, la risposta vascolare al danno in completi esperimenti MHC-non corrispondenti possono variare rispetto a quello osservato clinicamente. Johnson et al. 9 hanno mostrato che, negli innesti interposizione aortici trapiantati attraverso una barriera completa MHC disallineamento, la maggior parte dile cellule neointimal sono di origine destinatario e non di provenienza dei donatori. Questo è diverso da quello osservato nei trapianti umani, dove la maggior parte delle cellule muscolari lisce intimale di origine donatore 9,10. Per tenere conto di questa limitazione, modelli sperimentali alternativi che coinvolgono innesto attraverso piccoli disallineamenti antigene di istocompatibilità sono stati sviluppati che innescano le risposte vascolari che si avvicinano maggiormente a quelli osservati nel trapianto clinica 11. Anche se questi modelli alternativi permettono di conclusioni importanti da effettuare per quanto riguarda le risposte vascolari che guidano lo sviluppo della TA, i processi immunologici che causano il rigetto vascolare in antigene di istocompatibilità minore innesti corrispondenti non completamente ri-capitolare quelle che si verificano in ambito clinico. Ad esempio, antigeni di istocompatibilità minori sono riconosciuti male da innesto anticorpi reattivi 12. Alla luce delle considerazioni che precedono, è importante considerare il QUESTI patologicosu essere esaminato quando si sceglie il tipo di antigene disadattamento utilizzato un modello interposizione aortica. Qui si descrive un protocollo dettagliato per murino aortica interposizione innesto. Descriviamo interposizione innesto tra completi topi MHC-non corrispondenti, ma lo stesso protocollo viene utilizzato per l&#39;innesto su altri ceppi di antigene non corrispondenti mouse.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J (H-2b)</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 000664</td><td></td></tr><tr><td>Balb/cBYJ</td><td>Jackson Laboratories, Bar Harbour ME</td><td>Strain# 001026</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ml</td><td>Ketalean</td><td>DIN 00612316</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylazine Injection 20 mg/ml</td><td>Rompum</td><td>DIN 02169592</td><td></td></tr><tr><td>Ketoprofen Injection 100 mg/ml</td><td>Anafen</td><td>DIN 01938126</td><td></td></tr><tr><td>Butorphanol Tartrate&amp;nbsp;injection 10 mg/ml</td><td>Torbugesic</td><td>DIN 008450000</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine Injection 0.3 mg/ml</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>B.N. 5241</td><td></td></tr><tr><td>Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution</td><td>Antisedan</td><td>DIN 02237744</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodium Injection, USP, 1,000 units/ml</td><td>McKesson Distribution</td><td>DIN 02264315</td><td></td></tr><tr><td>Tears naturale ophthalmic ointment</td><td>Alcon</td><td>DIN 02082519</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer&amp;rsquo;s solution, sterile</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 ml</td><td>Baxter Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep Pads</td><td>Loris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidone Iodine</td><td>Betadine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorohexidine Gluconate 4% w/v</td><td>Germi-Stat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Black Polyamide Monofilament</td><td>AROSurgical Instruments</td><td>T4A10Q07</td><td></td></tr><tr><td>Suture, 10-0 suture, 70 microns</td><td>Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue monofilament suture 5-0, P3 needle</td><td>Ethicon</td><td>8698G</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309659</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Syringe</td><td>BD</td><td>REF 309604</td><td></td></tr><tr><td>1cc TB insulin syringe with 28 G 1/2</td><td>BD</td><td>REF 309309</td><td></td></tr><tr><td>25 G 7/8, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305124</td><td></td></tr><tr><td>27 G 1/2, hypodermic needle</td><td>BD</td><td>REF 305109</td><td></td></tr><tr><td>Colibri Retractor- 1.5 cm spread 4 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-04</td><td></td></tr><tr><td>S&amp;amp;T CAF-4 Clip applying forceps, without lock</td><td>Fine Science Tools</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Supergrip forceps, S&amp;amp;T</td><td>Fine Science Tools</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Medical No.5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>Lexer Baby Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14078-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro Adson forceps serrated</td><td>Fine Science Tools</td><td>11018-12</td><td></td></tr><tr><td>Vannas-Tubingen microscissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length</td><td>Fine Science Tools</td><td>00396-01</td><td></td></tr><tr><td>Graefe-forceps, 10cm 1x2 teeth</td><td>Fine Science Tools</td><td>11054-10</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo with lock and tungsten jaws</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>Hot glass bead sterilizer</td><td>Inotech 250</td><td>IS-250 - Steri-250</td><td></td></tr><tr><td>Non-woven gauzes</td><td>Progene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotton Tipped Applicators</td><td>Puritan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beard Trimmer</td><td>Wahl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heating pad</td><td>Sunbeam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mouse model of alloimmune-induced vascular rejection and transplant arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

In questo modello, l&#39;aorta addominale da un topo Balb / CYJ è interposto in aorta sottorenale di un / 6 ricevente C57Bl. Questo permette una valutazione completa di alloimmuni risposte che colpiscono le arterie trapianto allogenico. Danno vascolare Immune-mediata in questo modello inizia risposte riparative vascolari che culminano in ispessimento dell&#39;intima, restringimento del lume e il reclutamento di cellule immunitarie (figure 1 e 2). Questi criteri agiscono come uno-out lettura per la gravità della alloimmuni risposte, rigetto vascolare e TA. Il successo della procedura può essere valutata dallo sviluppo di robusta ispessimento intimale dei segmenti delle arterie allogenico e l&#39;assenza di ispessimento intimale nei controlli syngraft. Clinicamente immunosoppressione rilevante può essere utilizzato con questo modello ad assomigliare più da vicino il trapianto clinico. Questo modello può essere utilizzato anche con animali transgenici per studiare l&#39;effetto di specifiche proteine ​​/ percorsi in un alloimmuni rispostes abbiamo fatto 14. Alloinnesto segmenti aortici sviluppare ispessimento intimale L&#39;ammontare del danno vascolare allogenico immuno-mediata è stata esaminata quantificando ispessimento intimale e restringimento del lume in segmenti aortici innestate al giorno 30 post-trapianto. Segmenti delle arterie alloinnesto sviluppano significativo ispessimento intimale e l&#39;occlusione del lume e nessun cambiamento si osservano in syngraft segmenti di controllo delle arterie (Figura 1). L&#39;accumulo di leucociti nei segmenti aortica trapianto allogenico. L&#39;accumulo di leucociti nelle arterie allogenico è stata esaminata quantificando il numero di cellule T CD4, le cellule T CD8 e macrofagi (Mac-3) 15 mediante immunoistochimica. Mac-3 è stato usato per colorare per macrofagi in questo studio, anche se altri marcatori, come F4 / 80, possono anche essere utilizzati 16. Cellule T CD4, le cellule CD8 T e macrofagi sono stati rilevati nel<html> l&#39;intima delle arterie alloinnesto (Figura 2) <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52800/52800fig1.jpg" /> Figura 1: L&#39;analisi istologica delle arterie innestati (A) segmenti dell&#39;aorta addominale da singenici topi e allogenici erano interposti nelle aorte addominali resezione di topi C57BL / 6.. Le arterie innestati sono state raccolte in 30 giorni post-trapianto. Sono mostrati microfotografie rappresentativi di van elastico Giesen arterie macchiati. Barra di scala = 0.1 mm = 100 micron (B) Schema che illustra come i diversi strati della nave sono misurate, L:. Lumen, E: strato endoteliale, I: intima, M: i media, A:. Avventizia (C) Quantificazione del intima / media e rapporto% restringimento del lume da 30 giorni singenici (n = 3) e allogenici (n = 6) trapianti, * p &lt;0,05.= &quot;_ Blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52800/52800fig2.jpg" /> Figura 2: l&#39;accumulo di cellula immunitaria nelle arterie trapianto allogenico. Microfotografie rappresentativi di trapianto allogenico di segmenti aortici immunoistochimica colorate per (A) CD4, (B) CD8, e (C) Mac-3 e di contrasto con ematossilina sono mostrati. Scala bar = 0.1 mm = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52800/52800fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

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Nanyang Technological University

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8.4K Views.  Simon Fraser University. We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure. 

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Orthotopic Aortic Transplantation: A Rat Model to Study the Development of Chronic Vasculopathy

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant vasculopathy (TVP).
The commonly used animal model for cardiovascular chronic rejection studies is the heterotopic heart transplant model performed in laboratory rodents. This model is used widely in experiments since Ono and Lindsey (3) published their technique. To analyze the findings in the blood vessels, the heart has to be sectioned and all vessels have to be measured.
Another method to investigate chronic rejection in cardiovascular questionings is the aortic transplant model (1, 2). In the orthotopic aortic transplant model, the aorta can easily be histologically evaluated (2). The PVG-to-ACI model is especially useful for CAV studies, since acute vascular rejection is not a major confounding factor and Cyclosporin A (CsA) treatment does not prevent the development of CAV, similar to what we find in the clinical setting (4). A7-day period of CsA is required in this model to prevent acute rejection and to achieve long-term survival with the development of TVP.
This model can also be used to investigate acute cellular rejection and media necrosis in xenogeneic models (5).

This video demonstrates the orthotopic aortic transplant model as a simple model to study the development of transplant vasculopathy (TVP) in rats.

Trapianto ortotopico aortica: un modello di ratto per studiare lo sviluppo di vasculopatia cronica

Research models of chronic rejection are essential to investigate pathobiological and pathophysiological processes during the development of transplant ...

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Medicina

Orthotopic Aortic Transplantation in Mice for the Study of Vascular Disease

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. This is largely true, but there are a number of important principles that can reduce the difficulty of these procedures and enhance reproducibility. Orthotopic aortic transplantation is an excellent procedure in which to learn these principles because it involves only two end-to-end anastomoses, but requires good suturing technique and handling of the vessels for consistent success. This procedure begins with the procurement of a length of abdominal aorta from a donor animal, followed by division of the native aorta in the recipient. The procured aorta is then placed between the divided ends of the recipient aorta and sutured into place using end-to-end anastomoses. To accomplish this objective successfully requires a high degree of concentration, good tools, a steady hand, and an appreciation of how easily the vasculature of a mouse can be damaged, resulting in thrombosis. Learning these important principles is what occupies most of the beginner's time when learning microsurgery in small rodents. Throughout this protocol, we refer to these important points. This model can be used to study vascular disease in a variety of different experimental systems1-8. In the context shown here, it is most often used for the study of post-transplant vascular disease, a common long-term complication of solid organ transplantation in which intimal hyperplasia occurs within the allograft. The primary advantage of the model is that it facilitates quantitative morphometric analyses and the transplanted vessel lies contiguous to the endogenous vessel, which can serve as an additional control9. The technique shown here is most often used for mice weighing 18-25 grams. We have accumulated most of our experience using the C57BL/6J, BALB/cJ, and C3H/HeJ strains.

We describe a technique in which a section of the abdominal aorta from a mouse is transplanted orthotopically to just below the renal arteries in an allogeneic or syngeneic recipient. This technique can be useful in studies in which transplantation of large arteries of uniform size is deemed advantageous.

Aortica trapianto ortotopico in Mouse per lo studio della malattia vascolare

Vascular procedures involving anastomoses in the mouse are generally thought to be difficult and highly dependent on the skill of the individual surgeon. ...

Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Graft arteriosclerois (GA), also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over months to years in transplanted organs characterized by diffuse, circumferential stenosis of the entire graft vascular tree. The most critical component of GA pathogenesis is the proliferation of smooth muscle-like cells within the intima. When a human coronary artery segment is interposed into the infra-renal aortae of immunodeficient mice, the intimas could be expand in response to adoptively transferred human T cells allogeneic to the artery donor or exogenous human IFN-&gamma; in the absence of human T cells. Interposition of a mouse aorta from one strain into another mouse strain recipient is limited as a model for chronic rejection in humans because the acute cell-mediated rejection response in this mouse model completely eliminates all donor-derived vascular cells from the graft within two-three weeks. We have recently developed two new mouse models to circumvent these problems. The first model involves interposition of a vessel segment from a male mouse into a female recipient of the same inbred strain (C57BL/6J). Graft rejection in this case is directed only against minor histocompatibility antigens encoded by the Y chromosome (present in the male but not the female) and the rejection response that ensues is sufficiently indolent to preserve donor-derived smooth muscle cells for several weeks. The second model involves interposing an artery segment from a wild type C57BL/6J mouse donor into a host mouse of the same strain and gender that lacks the receptor for IFN-&gamma; followed by administration of mouse IFN-&gamma; (delivered via infection of the mouse liver with an adenoviral vector. There is no rejection in this case as both donor and recipient mice are of the same strain and gender but donor smooth muscle cells proliferate in response to the cytokine while host-derived cells, lacking receptor for this cytokine, are unresponsive. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, both models can be used to assess the effect of specific genes on GA progression. Here, we describe detailed protocols for our mouse GA models.

We describe protocols for our mouse graft arteriosclerois (GA) models which involve interposition of a mouse vessel segment into a recipient of the same inbred strain. By backcrossing additional genetic changes into the vessel donor, the model can assess the effect of specific genes on GA.

Modelli murini per l&#39;arteriosclerosi Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms requires reliable models. Here, we describe models of tolerance to cardiac allograft in rat, induced by blockade of costimulation signals or by upregulation of immunoregulatory molecules through gene transfer. Each of these models allowed in vivo generation of regulatory cells such as regulatory T cells (Tregs), regulatory B cells (Bregs) or regulatory myeloid cells (RegMCs). In this manuscript, we describe two complementary protocols that have been used to identify and define in vitro and in vivo regulatory cell activity to determine their responsibility in tolerance induction and maintenance. First, an in vitro suppressive assay allowed rapid identification of cells with suppressive capacity on effector immune responses in a dose dependent manner, and can be used for further analysis such as cytokine measurement or cytotoxicity. Second, the adoptive transfer of cells from a tolerant treated recipient to a newly irradiated grafted recipient, highlighted the tolerogenic properties of these cells in controlling graft directed immune responses and/or converting new regulatory cells (termed infectious tolerance). These methods are not restricted to cells with known phenotypic markers and can be extended to any cell population. Furthermore, donor directed allospecificity of regulatory cells (an important goal in the field) can be assessed by using third party donor cells or graft either in vitro or in vivo. Finally, to determine the specific tolerogenic capacity of these regulatory cells, we provide protocols to assess the humoral anti-donor antibody responses and the capacity of the recipient to develop humoral responses against new or former known antigens. The models of tolerance described can be used to further characterize regulatory cells, to identify new biomarkers, and immunoregulatory molecules, and are adaptable to other transplantation models or autoimmune diseases in rodent or human.

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

Here, we present a protocol to induce tolerance in transplantation, and assess in vitro and in vivo the suppressive capacity of distinct cell subsets from the recipient and the immune status of the recipient toward donor or exogenous antigens.

In Vitro e In Vivo valutazione della attività soppressiva T, B e cellule mieloidi e risposte umorali dai destinatari del trapianto

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

Immunologia e infezioni

A Novel Microsurgical Model for Heterotopic, En Bloc Chest Wall, Thymus, and Heart Transplantation in Mice

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression must be pursued. Employing vascularized bone marrow transplantation and co-transplantation of the thymus have shown promise in this regard in various animal models.1-11 Vascularized bone marrow transplantation allows for the uninterrupted transfer of donor bone marrow cells within the preserved donor microenvironment, and the incorporation of thymus tissue with vascularized bone marrow transplantation has shown to increase T-cell chimerism ultimately playing a supportive role in the induction of immune regulation. The combination of solid organ and vascularized composite allotransplantation can uniquely combine these strategies in the form of a novel transplant model. Murine models serve as an excellent paradigm to explore the mechanisms of acute and chronic rejection, chimerism, and tolerance induction, thus providing the foundation to propagate superior allograft survival strategies for larger animal models and future clinical application. Herein, we developed a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique. The experience in syngeneic and allogeneic transplant settings is described for future broader immunological investigations via an instructional manuscript and video supplement.

To study combined solid organ and vascularized composite allotransplantation, we describe a novel heterotopic en bloc chest wall, thymus, and heart transplant model in mice using a cervical non-suture cuff technique.

A Novel microchirurgica modello per eterotopica, in blocco parete toracica, Timo, e trapianto cardiaco nei topi

Exploration of novel strategies in organ transplantation to prolong allograft survival and minimizing the need for long-term maintenance immunosuppression ...

Orthotopic Hind Limb Transplantation in the Mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and translational research in the field of transplantation medicine. A vast array of reagents is available exclusively in this setting, including mono- and polyclonal antibodies for both diagnostic and interventional applications. In addition, a vast number of genotyped, inbred, transgenic, and knock out strains allow detailed investigation of the individual contributions of humoral and cellular components to the complex interplay of an immune response and make the mouse the gold standard for immunological research. 
Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) delineates a novel field of transplantation using allografts to replace "like with like" in patients suffering traumatic or congenital tissue loss. This surgical methodological protocol shows the use of a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis in an orthotopic mouse hind limb transplantation model. The model specifically allows for comparison between established paradigms in solid organ transplantation with a novel form of transplants consisting of various different tissue components. Uniquely, this model allows for the transplantation of a viable vascularized bone marrow compartment and niche that have the potential to exert a beneficial effect on the balance of immune acceptance and rejection. This technique provides a tool to investigate alloantigen recognition and allograft rejection and acceptance, as well as enables the pursuit of functional nerve regeneration studies to further advance this novel field of transplantation.

This novel model for orthotopic hind limb transplantation in the mouse, applying a non-suture cuff technique for super-microvascular anastomosis, provides a powerful tool for in&#160;vivo mechanistic immunological research related to vascularized composite allotransplantation (VCA).

Ortotopico degli arti posteriori del trapianto di mouse

In vivo animal model systems, and in particular mouse models, have evolved into powerful and versatile scientific tools indispensable to basic and ...

Modified Heterotopic Hindlimb Osteomyocutaneous Flap Model in the Rat for Translational Vascularized Composite Allotransplantation Research

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand and face transplants and, more recently, abdominal wall, uterus, and urogenital transplants. Functional outcomes have exceeded initial expectations, and most recipients enjoy an improved quality of life. However, as clinical experience accumulates, chronic rejection and complications from the immunosuppression must be addressed. In many cases where grafts have failed, the causative pathology has been ischemic vasculopathy. <span style="font-size: 11pt; line-height: 115%; font-family: Arial, sans-serif; color: rgb(41, 43, 49); background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial;">The biological mechanisms of the acute and chronic rejection associated with VCA, especially ischemic vasculopathy, are important areas of research. However, due to the very small number of VCA patients, the evaluation of proposed mechanisms is better addressed in an experimental model. Multiple groups have used animal models to address some of the relevant unsolved questions in VCA rejection and vasculopathy. Several model designs involving a variety of species are described in the literature. Here we present a reproducible model of VCA heterotopic hindlimb osteomyocutaneous flap in the rat that can be utilized for translational VCA research. This model allows for the serial evaluation of the graft, including biopsies and different imaging modalities, while maintaining a low level of morbidity.

Vascularized composite allograft offers life-altering benefits to transplant recipients, but the biological causes of graft rejection and vasculopathy remain poorly understood. The rodent surgical model presented here offers a reproducible, clinically relevant model of transplantation, allowing researchers to evaluate rejection events and potential therapeutic strategies to prevent their occurrence.

Modificato Eterotopic Hindarto Osteomyocutaneo flap modello nel ratto per traslazionale vascolarizzazione composito Allotransplantazione ricerca

Vascularized composite allotransplantation (VCA) is a relatively new field in the reconstructive surgery. Clinical achievements in human VCA include hand ...

Murine Cervical Aortic Transplantation Model using a Modified Non-Suture Cuff Technique

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. However, only minor improvement in the long-term results of transplanted solid organs could be observed over the past decades. In this context, chronic allograft vasculopathy (CAV) still represents the leading cause of late organ failure in cardiac, renal and pulmonary transplantation.
Thus far, the underlying pathogenesis of CAV development remains unclear, explaining why effective treatment strategies are presently missing and emphasizing a need for relevant experimental models in order to study the underlying pathophysiology leading to CAV formation. The following protocol describes a murine heterotopic cervical aortic transplantation model using a modified non-suture cuff technique. In this technique, a segment of the thoracic aorta is interpositioned in the right common carotid artery. With the use of the non-suture cuff technique, an easy to learn and reproducible model can be established, minimizing the possible heterogeneity of sutured vascular micro anastomoses.

Here, we present a protocol of heterotopic aortic transplantation in mice using the non-suture cuff technique in a cervical murine model. This model can be used to study the underlying pathology of chronic allograft vasculopathy (CAV) and can help evaluate new therapeutic agents in order to prevent its formation.

Modello di trapianto aortico cervicale murine utilizzando una tecnica di manette non sutura modificata

With the introduction of powerful immunosuppressive protocols, distinct advances are possible in the prevention and therapy of acute rejection episodes. ...

A Rat Orthotopic Renal Transplantation Model for Renal Allograft Rejection

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential model to investigate the mechanism of renal allograft rejection in pre-clinical studies and could aid in the development of novel approaches to improve the long-term survival of renal allografts. Donor kidney implantation in rat orthotopic renal transplantation is commonly performed by end-to-side anastomosis to recipients' aorta and inferior vena cava. In this model, the donor's kidney was implanted using end-to-end anastomosis to the recipients' renal artery and renal vein. The donor's ureter was anastomosed to the recipient's bladder in an end-to-side 'tunnel' method. This model contributes to better healing of ureter-bladder anastomosis and increases the recipients' survival by avoiding interference with blood supply and venous reflux of the lower body. This model can be used to investigate the mechanisms of acute and chronic immune and pathologic rejection of renal allografts. Here, the study describes the detailed protocols of this orthotopic renal transplantation between rats.

The rat orthotopic renal transplantation model contributes to investigating the mechanism of renal allograft rejection. The current model increases the recipients' survival without interference with blood supply and venous reflux of the lower body using an end-to-end anastomosis of kidney implantation and an end-to-side "tunnel" method of ureter-bladder anastomosis.

Un modello di trapianto renale ortotopico di ratto per il rigetto dell'allotrapianto renale

Renal allograft rejection limits the long-term survival of patients after renal transplantation. Rat orthotopic renal transplantation is an essential ...