Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni NIH R01 HL109420 a WM e AHA 9320033N a LY.

Topo allotrapianto e singenico modello di trapianto di innesto Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dalla cura degli animali istituzionale e comitati uso di Yale. Per il modello di allotrapianto, segmenti di aorta toracica da maschio, 4-5 settimane vecchia WT (C57BL/6J) o IFN-γR-KO sono stati interposti in aorta addominale del destinatario femminile, 8-12 settimane di età WT utilizzando un end-to -end microchirurgico tecnica anastomotica (vedi successivo per i dettagli). Per il modello innesto singenico, segmenti di aortae toracica da Male, la settimana 4-5 topi WT sono stati interposti nella aortae addominale del maschio, 8-12 settimane di età IFN-γR1-KO con una soluzione end-to-end microchirurgico tecnica anastomotica. Dopo 1 settimana dopo l&#39;intervento, gli animali sono stati inoculati iv con Ad5.CMV-topo IFN-γ o Ad5.CMV-LacZ (Qbiogene) a 1 x 10 9 PFU. Siero del mouse IFN-γ livelli sono stati misurati mediante test ELISA (eBioscience) a 1 e 5 settimane dopo la somministrazione di adenovirus. Taluni animali hanno ricevuto BrdU(Sigma-Aldrich) a 100 mg / kg sc per 2 settimane prima del sacrificio. End-to-end microchirurgica tecnica anastomotica (video verranno intraprese per questa parte): 1. Procedura donatore <ol><li> Anestetizzare i topi donatori con iniezioni intraperitoneali di ketamina (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). </li><li> Dopo aver verificato l&#39;anestesia adeguata, mettere i topi donatori sotto il microscopio operatorio a X8-30 ingrandimento su un vassoio in posizione supina, e l&#39;uso di iodio Prep Pad e alcol Prep Pad per la preparazione della parete toracica. </li><li> Incidere la parete toracica anteriore attraverso le nervature e il diaframma per esporre il cuore. </li><li> Aprire l&#39;atrio destro, iniettare 10 ml di eparina (100 U / ml) di soluzione salina nel ventricolo sinistro per svuotare i topi utilizzando una siringa da 10 ml con un ago calibro 25. </li><li> Resecare cuore e polmoni per esporre l&#39;intera lunghezza dell&#39;aorta toracica. </li><li> Sezionare attentamente l&#39;aorta toracica per minimizzare il trauma diretto, while identificare, legare e sezionare i rami legname che utilizzano 11-0 sutura vicino l&#39;aorta. </li><li> Una volta che l&#39;aorta toracica è libera dal tessuto circostante, accise tutta aorta toracica per il trapianto. </li><li> Lavare l&#39;estremità del taglio dell&#39;aorta donatore con eparina (100 U / ml) di soluzione salina, e memorizzarlo nella stessa soluzione sul ghiaccio (fino a 6 ore) fino al trapianto. </li></ol> 2. Procedura destinatario <ol><li> Iniettare i topi riceventi con ip ketoprofene (5 mg / kg) per l&#39;analgesia, e thenanesthetize i topi con ketamina ip (50 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg). I topi riceventi sono profondamente anestetizzati entro 10 minuti per una durata di 60-90 min. Durante l&#39;intervento, il livello di anestesia viene valutata ogni 15 min da pizzicare la parete addominale anteriore o il piede con pinze. Se l&#39;animale reagisce agli stimoli nocivi in ​​qualsiasi momento durante l&#39;intervento, un&#39;ulteriore dose di chetamina e xilazina (1/4 o 1/3 della dose originale) sarà somministrato per sc o im </li><li> Dopo aver verificato l&#39;anestesia adeguata, radere il pelo nella parete addominale anteriore con un rasoio elettrico, pulire la pelle con Iodio Prep Pad e alcol Prep Pad, coprire gli occhi con pomata oftalmica. Durante la chirurgia, le seguenti tecniche asettiche saranno utilizzati per le operazioni di pulizia, compreso il tavolo operatorio con 10% di candeggina, indossando guanti sterili e utilizzando strumenti di microchirurgia sterilizzati (strumenti sterilizzati per l&#39;inizio dell&#39;operazione, vetro poi caldo bead-sterilizzato strumenti tra i più operazioni, ecc.) </li><li> Collocare i topi riceventi al microscopio operativo ad un ingrandimento di X8-30 su un vassoio in posizione supina. </li><li> Incidere la parete addominale sulla linea mediana da xifoidea al pube, e diffondere la parete addominale le superfici usando un micro-retrattore per esporre la cavità addominale. </li><li> Ritrarre l&#39;intestino superiormente e avvolgere con una garza inumidita con soluzione fisiologica. I topi riceventi soffrano il freddo da perdita di heaT attraverso intestino esternalizzati. È importante mantenere il calore animale. Tuttavia, il bordo del riscaldamento non viene usato durante la chirurgia come modesta ipotermia è utile per prevenire lesioni spinali durante l&#39;occlusione del flusso ematico aortico e vi è poco efficiente trasferimento di calore con il flusso di sangue assente alla metà inferiore del corpo topi. </li><li> Spostare gli organi riproduttivi inferiormente, avvolgere le zone addome di topi riceventi con garza salina-soluzione-inumidito, e usarlo per ritrarre il retto al lato destro dell&#39;addome. I tessuti esposti sono irrigati periodicamente con soluzione salina durante il trapianto. </li><li> Sezionare senza mezzi termini un segmento di aorta sottorenale tra il vaso renale prossimale e distale biforcazione aortica e separare dalla vena cava inferiore (IVC) con attenzione. </li><li> Identificare e legare tutti i piccoli rami provenienti da questo segmento di aorta addominale utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura. </li><li> Cross-clamp il segmento isolato di unaaorta bdominal utilizzando due morsetti vascolari proximately 5 millimetri a parte, uno ad ogni estremità. </li><li> Transezione l&#39;aorta addominale tra il morsetto con taglienti micro-forbici per creare i siti anastomosi. </li><li> Resecare un piccolo segmento di aorta addominale (fino a 0,4 mm di lunghezza) da una estremità tagliata di transected destinatario aorta per accogliere il graft aortico donatore. </li><li> Lavare i segmenti aortici tra i morsetti utilizzando soluzione fisiologica con eparina per rimuovere il sangue residuo. I segmenti aortici tra morsetti e l&#39;innesto aortico donatore sono irrigati periodicamente con eparina (100 U / ml) di soluzione salina (fino a 40 ml / kg) durante anastomosi. </li><li> Transezione entrambi i lati del donatore aorta con taglienti micro-forbici per creare un innesto segmento di 2,5 mm di lunghezza per il trapianto. </li><li> Posizionare l&#39;innesto aortico donatore in posizione ortotopico, anastomose estremità prossimale e distale del donatore dell&#39;innesto a fine taglio prossimale e distale del destinatario dell&#39;aorta addominale, rispettivamente, con un fine-tmodello o-end utilizzando 11-0 poliammide monofilamento sutura. </li><li> Per le continue suture, posizionare i punti di sutura soggiorno a 3 e 9 posizioni in primo luogo. Tra due suture a ogni lato del graft, anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti utilizzando le suture in esecuzione, e legare le suture in esecuzione per rimanere suture con un doppio nodo. Poiché i due strati di chiusura sono continui, il rischio di deiscenza è aumentato. L&#39;innesto aortico donatore dovrebbe essere di lunghezza adeguata per collegare all&#39;estremità di taglio prossimale e distale del destinatario della aorta addominale. </li><li> Per i punti staccati, costruire quattro anastomosi a 3 e 9 posizioni in entrambi i lati del trapianto in primo luogo, e anastomose entrambi i bordi tagliati in 3-4 punti di sutura tra due punti di sutura soggiornare in ogni lato del trapianto. </li><li> Rilasciare il morsetto distale per consentire il flusso retrogrado in trapianto, identificare le sedi di sanguinamento e fare punti aggiuntivi entro 3 minuti. </li><li> Dopo aver accertato l&#39;emostasi soddisfacente, allentare il morsetto prossimale. </li><li> Confermare la pervietà dell&#39;innesto dalla presenza di pulsazione vigorosa l&#39;innesto e il segmento adiacente prossimale dell&#39;aorta addominale nativa, in particolare nel segmento adiacente distale dell&#39;aorta addominale e mesenterica inferiore. Considerare trombosi in siti anastomotiche se la pulsazione diminuisce nel giro di pochi minuti dopo il ripristino del flusso sanguigno. </li><li> Restituire l&#39;intestino nella cavità addominale. </li><li> Suturare chiudere la parete addominale utilizzando 5-0 sutura in nylon strato muscolare e lo strato della pelle, rispettivamente. </li><li> Mettere i topi riceventi in una gabbia pulita sulla sommità di una piastra elettrica, e aspettare 1-2 ore per i topi a riprendere coscienza e recuperare da anestesia. È importante mantenere un&#39;adeguata animale calore durante il recupero. Tenere i topi in gabbia caldo e asciutto prima di scia animale dall&#39;anestesia. </li><li> Valutare la funzione motoria degli arti posteriori dopo il recupero topi, e di nuovo il secondo giorno. Un intervento chirurgico di trapianto di successo verrà confermato if nessuna disfunzione degli arti posteriori è osservata in topi riceventi il ​​secondo giorno. </li><li> Amministrare i topi riceventi con ketoprofene in acqua potabile (5 mg / kg / d = 27 ug / ml in acqua potabile) per 48 ore. Se alcuni topi riceventi soffrono di dolore non trattato dagli analgesici postoperatori come dimostra la perdita di mobilità, il mancato sposo, anormale ricompattato postura, ecc, saranno sacrificati. Gli animali saranno sacrificati a fine punti predefiniti dopo 1-60 giorni. </li></ol> Analisi Graft Innesti di arteria del trapianto sono stati acquistati a 4 settimane e innesti a modello dell&#39;innesto singenico erano sei settimane dopo l&#39;intervento (5 settimane dopo l&#39;infezione virale) e analizzati mediante tecniche istologiche standard per Elastica-van Gieson (EVG) colorazione ematossilina eosina (HE) colorazione e colorazione di immunofluorescenza. Foto sono state scattate con un sistema di microscopia di immunofluorescenza (Zeiss). Conteggio delle cellule di nuclei circondati da immunoistochimica positiva è stata eseguireed in alto ingrandimento e in media da 5 sezioni per ogni innesto. Le misurazioni dell&#39;area innesto del lume (entro l&#39;endotelio), intimale (tra la lamina elastica interna ed endotelio, IEL), media (tra il IEL e della lamina elastica esterna, EEL), spessore di parete (tra la lamina elastica esterna ed endotelio) e vaso intero (entro l&#39;anguilla) sono stati calcolati da 5 seriali sezioni, 150 micron a parte per ogni innesto, utilizzando l&#39;analisi computer-assistita e NIH Immagine 1.60 ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/nih-image</a> ). L&#39;analisi statistica Tutti i dati sono espressi come media ± SEM. Due code, t test appaiati e un due vie ANOVA = analisi sono state eseguite utilizzando il programma software Prism (GraphPad Software). Differenze con p &lt;0,05 sono stati considerati come statisticamente significativi.

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Res. 109, 418-427 (2011).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

I protocolli descritti si concentrano su modelli murini GA. Le procedure possono essere applicate ad altri modelli di trapianto innesto. Questi modelli includono xenotrapianto umanizzato (cioè segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti), e il rigetto acuto del mouse modello GA (cioè una aorta mouse da un ceppo genetico in un altro ceppo ricevente genetica). I nostri modelli murini descritti sono più per chiudere le lesioni GA umani. Il primo m...

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell&#39;intero albero vascolare dell&#39;innesto 7. Fasi precoci possono causare stenosi eccentriche e focale che sono più evidenti nelle arterie, quindi più da vicino assomiglia stenosi visto in aterosclerosi convenzionale. La perdita lume dei vasi dell&#39;innesto risultati espansione intimale causa di infiltrazioni di cellule T e macrofagi ospite e soprattutto per l&#39;accumulo di matrice extracellulare e di muscolo liscio-come cellule originati da trapianto, host o entrambi 5, 13, 19, che è insufficientemente compensata da esterno nave rimodellamento. In allotrapianti cardiaci, le lesioni clinicamente più significative sono quelle nelle arterie coronarie e epicardiche intramiocardica. In definitiva, GA delle arterie coronarie provoca insufficienza cardiaca ischemica. GA è la principale causa di ritardo gr cardiacoperdita di poppa. Le stenosi di GA fermano le linee di sutura, che implica fortemente la risposta dell&#39;ospite a alloantigeni innesto nella sua patogenesi e che ci porta a classificare GA come una forma di rigetto cronico 3. Tuttavia, altre forme di lesione arteriosa può aumentare il rischio di GA, sia attraverso aumentando il carico netto di lesioni o intensificando e / o modulare la risposta allo immune. La cella (CE) rivestimento endoteliale delle arterie innesto viene conservata in GA umano e le regioni più superficiali del intimale adiacente al rivestimento CE è il sito più pesantemente infiltrati da host-derived IFN-γ-producono cellule T e macrofagi 11; nella alcuni pazienti GA è associato con lo sviluppo di alloanticorpi donatore-specifici che si legano a innesto EC 16 ma i vasi mostrano poca prova della necrosi fibrinoide che è caratteristica di rigetto acuto anticorpo-mediata 11. Il componente più critico di GA patogenesi è laproliferazione di cellule muscolari lisce-simili all&#39;interno del intima, se questo processo può essere arrestato, GA è improbabile a progredire. Precedente lavoro del nostro gruppo aveva dimostrato che intimas di segmenti di arterie coronariche umane interposti nella aortae infra-renale di topi immunodeficienti espandono in risposta a cellule T umane allogeniche adoptively trasferiti al donatore arteria e che questo processo potrebbe essere inibito neutralizzando umana IFN- γ 18. Inoltre esogeno IFN-γ umano potrebbe causare intimale (e mediale) cellule muscolari lisce (VSMC) proliferazione vascolare in questi innesti arteriosi in assenza di cellule umane T 15, 17. (E &#39;importante notare che uomo e topo IFN-γ non attraversare specie, escludendo gli effetti indiretti sulla ospite del mouse in questo sistema sperimentale). Questi modelli di topo umanizzato hanno il vantaggio di ricapitolare cellule T umano / interazioni delle cellule vascolari e il intimale Le lesioni sono in gran parte costituiti da cellule umane (cioè graft-derivato),Come è stato osservato in campioni clinici, ma non ricapitolare appieno la situazione clinica perché ignorano il ruolo dei macrofagi ospitanti e forse altri tipi di cellule coinvolte nelle lesioni trapianti clinici. Un modello convenzionale topo di questo processo potrebbe teoricamente risolvere questo problema, integrando le limitazioni del modello umanizzato coinvolgendo un sistema completo immunitario ospite e fornendo l&#39;ulteriore vantaggio di permettere la potenza di approcci genetici topo da applicare a GA. I due modelli di mouse più diffusi riguardano il trapianto di cuore eterotopico e arteria trapianto ortotopico 1. Le lesioni che si sviluppano nelle arterie dei trapianti di cuore eterotopico sono in gran parte costituiti da cellule ospiti, probabilmente di origine midollare, mentre le cellule intimale delle arterie a innesti cardiaci umani sono prevalentemente di origine innesto 5, 13, 19. Questa è una distinzione importante, che ha portato a sviluppare modelli alternativi del mouse. Interposizione diuna aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente mouse è ancora più limitata come modello per rigetto cronico nell&#39;uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte le cellule vascolari derivate dal donatore dal trapianto entro due-tre 19 settimane. Di conseguenza, le successive variazioni visti nel segmento del vaso interposto sono solo una risposta di cellule ospiti che hanno ripopolato il decellularized nave patibolo, creando una situazione estremamente artefatta di scarsa rilevanza come modello per i cambiamenti di vasi di innesto che si verificano nella clinica. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi modelli di mouse per aggirare questi problemi 21. Il primo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Il secondo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca della receptor per IFN-γ (IFN-γR-KO), seguito da somministrazione di IFN-γ del mouse (distribuito mediante infezione del fegato del topo con un vettore adenovirale. Qui, descriviamo protocolli dettagliati ed i vantaggi dei nostri modelli murini GA.

<table border="1" >
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the Reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C57BL/6J (H-2b)</td>
 <td>Jackson Laboratories 
 (Bar Harbor, ME)</td>
 <td>000664</td>
 <td>Donor (5 weeks) 
 Recipient (8-12weeks)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketamine Hydrochloride Injection </td>
 <td>Hospira Inc.</td>
 <td>NDC 0409-2053</td>
 <td>Storage Solution(50 mg/ml) 
 Working Solution(5 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Xylazine Sterile Solution</td>
 <td>Lloyd Inc.</td>
 <td>NADA# 139-236</td>
 <td>Storage Solution(100 mg/ml) 
 Working Solution(1 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ketoprofen</td>
 <td>Fort Dodge Animal Health</td>
 <td>NDC 0856-4396-01</td>
 <td>Storage Solution(100 mg/ml) 
 Working Solution-oral 
 (0.027 mg/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Heparin Sodium</td>
 <td>Sagent Pharmaceticals</td>
 <td>NDC 25021-400</td>
 <td>Storage Solution(1000 U/ml) 
 Working Solution(100 U/ml)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)</td>
 <td>CareFusion</td>
 <td>AL4109</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>0.9% Sodium Chloride Injection</td>
 <td>Hospira Inc.</td>
 <td>NDC 0409-4888-10</td>
 <td>To prepare the anesthetic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Petrolatum Ophthalmic Ointment </td>
 <td>Dechra Veterinary Products</td>
 <td>NDC 17033-211-38</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodine Prep Pads </td>
 <td>Triad Disposables, Inc.</td>
 <td>NDC 50730-3201-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Alcohol Prep Pads</td>
 <td>McKesson Corp.</td>
 <td>NDC 68599-5805-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MZ95</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Scissors</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-5693</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spring Scissors</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>15009-08</td>
 <td>To transect the aorta of donor or recipient </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Extra Narrow Scissors</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>14088-10</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Needle Holder/Forceps</td>
 <td>MICRINS</td>
 <td>MI1542</td>
 <td>To hold the needle</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fine Forceps</td>
 <td>F.S.T </td>
 <td>11254-20</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>11251-35</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Standard Pattern Forceps</td>
 <td>F.S.T</td>
 <td>11000-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forceps</td>
 <td>F.S.T </td>
 <td>13011-12</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LANCASTER Eye Speculum</td>
 <td>Zepf Medical Instruments</td>
 <td>42-1209-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Vascular Clip</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-6472</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Clip Applying Forceps With Lock</td>
 <td>Roboz Surgical Instrument Co.</td>
 <td>RS-5440</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Black Polyamide Monofilament Suture</td>
 <td>AROSurgical Instruments Corporation</td>
 <td>Cat #T4A10Q07</td>
 <td>10-0 suture, Needle=70 microns</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Black Monofilament Nylon Suture</td>
 <td>Syneture 
 (Covidien)</td>
 <td>SN-1956</td>
 <td>6-0 suture</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Non-Woven Songes</td>
 <td>McKesson Corp.</td>
 <td>Reorder No. 94442000</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309659</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309657</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml Syringe</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 309604</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>18G 1 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305196</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25G 7/8, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305124</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>27G 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305109</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>30G 1/2, 
 Hypodermic Needle</td>
 <td>BD</td>
 <td>REF 305106</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hearting Pad</td>
 <td>Sunbeam</td>
 <td>Z-1228-001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Trimmer</td>
 <td>Wahl</td>
 <td>9854-500</td>
 <td></td>
 </tr>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td>Table 2. Specific reagents and equipment.</td>
</tr>
 </tbody>
</table>

mouse models for graft arteriosclerosis

Arteriosclerois Graft (GA), chiamati anche vasculopatia allotrapianto, è una lesione patologica che si sviluppa nel corso di mesi o anni di organi trapiantati caratterizzate da diffusa, stenosi circonferenziale dell&#39;intero albero vascolare del trapianto. Il componente più critico di GA patogenesi è la proliferazione di cellule muscolari lisce-simili all&#39;interno dell&#39;intima. Quando un segmento di arteria coronaria umana è interposto nel aortae infra-renale di topi immunodeficienti, le intimas potrebbero essere espandono in risposta a cellule T umane adoptively trasferiti al donatore allogenico un&#39;arteria o esogena umana IFN-γ in assenza di cellule T umane. Interposizione di una aorta topo da un ceppo in un altro ceppo ricevente topo è limitato come modello per rigetto cronico nell&#39;uomo perché la risposta cellulo-mediata rigetto acuto in questo modello di topo elimina completamente tutte derivate dal donatore cellule vascolari del trapianto entro due-tre settimane. Abbiamo recentemente sviluppato due nuovi mOuse modelli per aggirare questi problemi. Il primo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento del vaso da un topo maschio in una femmina destinatario dello stesso ceppo inbred (C57BL/6J). Rigetto in questo caso è diretto solo contro antigeni di istocompatibilità minori codificate dal cromosoma Y (presente nel maschio, ma non la femmina) e la risposta di rifiuto che ne deriva è sufficientemente indolente di conservare le cellule muscolari lisce derivate dal donatore per diverse settimane. Il secondo modello prevede l&#39;interposizione di un segmento di arteria da un tipo donatore C57BL/6J topo selvatico in un topo ospite dello stesso ceppo e genere che manca il recettore per IFN-γ seguita da somministrazione di topo IFN-γ (distribuito mediante infezione del mouse fegato con un vettore adenovirale. Non c&#39;è rigetto in questo caso come donatore e topi riceventi sono dello stesso ceppo e genere ma donatori cellule muscolari lisce proliferano in risposta alla citochina mentre ospitanti cellule derivate, privo recettore perquesta citochina, non rispondono. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, entrambi i modelli possono essere utilizzati per valutare l&#39;effetto di geni specifici sulla progressione GA. Qui, descriviamo protocolli dettagliati per i nostri modelli di mouse GA.

Topo modello allotrapianto arteriosclerosi (GA): In questo modello, un donatore maschio aorta viene trapiantato nel ricevente femmina modo che l&#39;host induce risposte allo-mediate da cellule T alloreattive contro un antigene Y minore (il maschio-specifico minore di istocompatibilità HY) espressi sul l&#39;innesto 12, ed a sua volta prodotta da cellule T γ-IFN azionamenti VSMC proliferazione 20 come osservato in altri modelli di trapianto allogenico 2, 6, 8-10, 14. U...

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Mouse Models for Graft Arteriosclerosis

Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l&#39;interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l&#39;effetto di geni specifici in GA.

Modelli murini per l&#39;arteriosclerosi Graft

Graft arteriosclerois (GA),  also called allograft vasculopathy, is a pathologic lesion that develops over  months to years in transplanted organs ...

Research

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Medicine

13.6K Views.  Yale University School of Medicine. Descriviamo i protocolli per i nostri arteriosclerois innesto del mouse (GA) modelli che comportano l'interposizione di un segmento di vaso del mouse in un destinatario dello stesso ceppo inbred. Con backcrossing ulteriori cambiamenti genetici nella nave cedente, il modello è in grado di valutare l'effetto di geni specifici in GA.

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Models of Bone Metastasis

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible for significant morbidity and mortality1. Thus, there is a significant need to understand the molecular mechanisms controlling the establishment, growth and activity of tumors in bone. Several in vivo models have been established to study these events and each has specific benefits and limitations. The most commonly used model utilizes intracardiac inoculation of tumor cells directly into the arterial blood supply of athymic (nude) BalbC mice. This procedure can be applied to many different tumor types (including PC-3 prostate cancer, lung carcinoma, and mouse mammary fat pad tumors); however, in this manuscript we will focus on the breast cancer model, MDA-MB-231. In this model we utilize a highly bone-selective clone, originally derived in Dr. Mundy's group in San Antonio2, that has since been transfected for GFP expression and re-cloned by our group3. This clone is a bone metastatic variant with a high rate of osteotropism and very little metastasis to lung, liver, or adrenal glands. While intracardiac injections are most commonly used for studies of bone metastasis2, in certain instances intratibial4 or mammary fat pad injections are more appropriate. Intracardiac injections are typically performed when using human tumor cells with the goal of monitoring later stages of metastasis, specifically the ability of cancer cells to arrest in bone, survive, proliferate, and establish tumors that develop into cancer-induced bone disease. Intratibial injections are performed if focusing on the relationship of cancer cells and bone after a tumor has metastasized to bone, which correlates roughly to established metastatic bone disease. Neither of these models recapitulates early steps in the metastatic process prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. If monitoring primary tumor growth or metastasis from the primary site to bone, then mammary fat pad inoculations are usually preferred; however, very few tumor cell lines will consistently metastasize to bone from the primary site, with 4T1 bone-preferential clones, a mouse mammary carcinoma, being the exception 5,6.
This manuscript details inoculation procedures and highlights key steps in post inoculation analyses. Specifically, it includes cell culture, tumor cell inoculation procedures for intracardiac and intratibial inoculations, as well as brief information regarding weekly monitoring by x-ray, fluorescence and histomorphometric analyses.

Animal models are frequently utilized to study cancer metastasis to bone. In this protocol we will describe two common methods of tumor inoculation for bone metastasis studies and briefly describe some of the analyses utilized to monitor and quantify these models.

Modelli di metastasi ossee

Bone metastases are a common occurrence in several malignancies, including breast, prostate, and lung. Once established in bone, tumors are responsible ...

Ricerca

Medicina

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Production of Apolipoprotein C-III Knockout Rabbits using Zinc Finger Nucleases

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins (HDL). It has been recognized that high levels of plasma ApoCIII constitutea risk factor for cardiovascular diseases (CVD). Elevated plasma ApoCIII level often correlates with insulin resistance, obesity, and hypertriglyceridemia. Invaluable knowledge on the roles of ApoCIIIin lipid metabolisms and CVD has been obtained from transgenic mouse models including ApoCIII knockout (KO) mice; however, it is noted that the metabolism of lipoprotein in mice is different from that of humans in many aspects. It is not known until now whether elevated plasma ApoCIII is directly atherogenic. We worked to develop ApoCIII KO rabbits in the present study based on the hypothesis that rabbits can serve as a reasonablemodelfor studying human lipid metabolism and atherosclerosis. Zinc finger nuclease (ZFN) sets targeting rabbit ApoCIIIgene were subjected to in vitro validation prior to embryo microinjection. The mRNA was injected to the cytoplasm of 35 rabbit pronuclear stage embryos, and evaluated the mutation rates at the blastocyst state. Of sixteen blastocysts that were assayed, a satisfactory 50% mutation rate (8/16) at the targeting site was achieved, supporting the use of Set 1 for in vivo experiments. Next, we microinjected 145 embryos with Set 1 mRNA, and transferred these embryos to 7 recipient rabbits. After 30 days gestation, 21 kits were born, out of which five were confirmed as ApoCIII KO rabbits after PCR sequencing assays. The KO animal rate (#KO kits/total born) was 23.8%. The overall production efficiency is 3.4% (5 kits/145 embryos transferred). The present work demonstrated that ZFN is a highly efficient method to produce KO rabbits. These ApoCIII KO rabbits are novel resources to study the roles of ApoCIII in lipid metabolisms.

Recent development in gene targeting tools makes production of knockout (KO) rabbits possible. In the present work, we generated five Apolipoprotein (Apo) C-III KO rabbits using Zinc Finger Nucleases (ZFN). This work demonstrated that ZFN is a highly efficient method to produce KO rabbits.

La produzione di apolipoproteina C-III Conigli Knockout utilizzando zinco nucleasi dito

Apolipoprotein (Apo) C-III (ApoCIII) resides on the surface of plasma chylomicron (CM), very low density lipoprotein (VLDL) and high density lipoproteins ...

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

L&#39;impianto di Vena cava inferiore Interposizione Graft in modello murino

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Mouse trapianto renale: Modelli di Allograft Rifiuto

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Ad alta frequenza di Ecografia del mouse cervicali Linfonodi

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

Modello murino della alloimmune indotta Rifiuto vascolare e trapianto Arteriosclerosi

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Bioluminescence-Based Tumor Quantification Method for Monitoring Tumor Progression and Treatment Effects in Mouse Lymphoma Models

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. Here we describe a method for bioluminescence imaging to obtain a semi-quantitative analysis of tumor burden and treatment response. This method is based on the calculation of a luminoscore, a value that allows comparisons of two animals from the same or different experiments. Current BLI instruments enable the calculation of this luminoscore, which relies mainly on the acquisition conditions (back and front acquisitions) and the drawing of the region of interest (manual markup around the mouse). Using two previously described mouse lymphoma models based on cell engraftment, we show that the luminoscore method can serve as a noninvasive way to verify successful tumor cell inoculation, monitor tumor burden, and evaluate the effects of in situ cancer treatment (CpG-DNA). Finally, we show that this method suits different experimental designs. We suggest that this method be used for early estimates of treatment response in preclinical small-animal studies.

Bioluminescence imaging is a well-known tool for localizing tumors and metastases, but quantification of these images often requires complex calculations and particular instruments. We describe the easy-to-use luminoscore method, based on precise acquisition conditions, requiring no calculations, and enabling tumor burden and treatment response to be monitored in mouse models.

Bioluminescenza-Based Metodo Tumore quantificazione per il monitoraggio del tumore Progressione e gli effetti del trattamento in modelli murini linfoma

Although bioluminescence imaging (BLI) shows promise for monitoring tumor burden in animal models of cancer, these analyses remain mostly qualitative. ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Vein Interposition Model: A Suitable Model to Study Bypass Graft Patency

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Vena interposizione Modello: un modello adatto per studiare Bypass Graft pervietà

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. ...