The authors gratefully acknowledge the National Science Foundation (NSF) for financial support of this work through a CAREER award (CBET-0746210) and through award CBET-1159500. We would like to thank Dr. Turkson (Univ. of Hawaii Cancer Center) and Dr. Altomare (Univ. of Central Florida College of Medicine) for assistance with cell culture.

1. la coltura linee cellulari <ol><li> Disgelo TE 71 (cellule epiteliali del timo del mouse), MDA-MB-231 (le cellule del cancro al seno umano), A549 (le cellule tumorali del polmone umano) e OVCAR3 (cellule tumorali ovariche umane) tenendo le fiale criogeni in acqua tiepida per meno di 2 minuti . Aggiungere 10 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS per ciascuna linea cellulare e centrifugare per 6 min a 106 x g. </li><li> Aspirare la sospensione e aggiungere dei media da 3 ml al pellet. Mescolare le cellule correttamente pipettando più volte. Aggiungi questa soluzione cella per preriscaldata 7 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS in fiaschi T75 e tenere i flaconi in atmosfera umidificata al 95% di aria / 5% di CO 2 a 37 ° C. Etichettare questo fiasco come Passage 0. </li><li> Quando la confluenza delle celle raggiunge il 80%, raccogliere le cellule da essi incubazione con tripsina 0,05% per 10 min. Neutralizzare la tripsina aggiungendo uguali quantità di materiale. Centrifugare questa soluzione per 6 min a 106 x g. Togliere la sospensione e aggiungere 3 ml mezzi freschi per esso. Mescolare well e trasferire piccola quantità (100 l) per un pallone di coltura contenente 7 ml di mezzi di comunicazione. Incubare il pallone di coltura in incubatrice. Etichettare il pallone come passaggio 1. </li><li> Cultura linee cellulari fino passo 11 o 12. </li></ol> 2. Realizzazione di nanoparticelle <ol><li> Preparazione del ~ 10 -6 M (rettificato) non diluito soluzione madre MEH-PPV <ol><li> In una fiala aggiungere 1mg Poly [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV) con peso molecolare (Mn medio) 150,000-250,000 g / mol e 3 ml di tetraidrofurano (THF) . Mescolare la miscela per 2 ore durante il riscaldamento a 80 ° C su una piastra calda. </li><li> Filtrare la soluzione di cui sopra in una nuova fiala usando un filtro a siringa da 0,2 micron. Etichettare questa soluzione come &#39;MEH-PPV soluzione madre diluita&#39;. Questa soluzione sarà coinvolto nella preparazione di nanoparticelle dopo la messa a punto della concentrazione come descritto nei punti 2.1.3 e 2.1.4. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione madre MEH-PPV non diluito in 3 ml di THF. Etichettare questa soluzione come &#39;soluzione madre diluita MEH-PPV&#39;. Trasferimento a una cuvetta di quarzo 1 cm e misurare l&#39;assorbanza a 495 nm mediante spettroscopia UV-vis. </li><li> Se l&#39;assorbanza della soluzione madre MEH-PPV diluita è superiore a 0,17, diluire la soluzione madre MEH-PPV non diluito con l&#39;aggiunta di più THF 1 ml alla volta, e ripetere il punto 2.1.3 fino a quando l&#39;assorbanza misurata a 495 nm è nella gamma ,13-0,17. </li><li> Calcolare la molarità della soluzione madre MEH-PPV diluita utilizzando legge di Lambert-Beer, come illustrato di seguito. Qui 0,15 assorbanza viene utilizzato come esempio per il resto del protocollo (es., Regolare tutte le seguenti calcoli basati su assorbanza osservato), il coefficiente di estinzione MEH-PPV utilizzato è 10 7 M -1 cm -1 e la lunghezza del percorso utilizzato è 1 cm. A = ε xbxc (Eqn 1) (ε - il coefficiente di estinzione molare, A - assorbanza, b - lunghezza del percorso, c - concentrazione della soluzione) 0.15 = 10 7 M -1 cm -1 x 1 cm xc (Eqn 2) c = 1.5 x 10 -8 M (Eqn 3) Utilizzare questa concentrazione per trovare la concentrazione della soluzione madre MEH-PPV non diluito nel modo seguente: M 1 V 1 = M 2 V 2 (Eqn 4) 0,15 x 10 -7 M x 3050 ml = M 2 x 50 microlitri (Eqn 5) M 2 = 9.15 x 10 -7 M (Eqn 6) Questa è la concentrazione del &#39;rettificato diluito MEH-PPV soluzione madre&#39;. </li></ol></li><li> Calcolo di massa di MEH-PPV nella soluzione madre aggiustato MEH-PPV non diluito <ol><li> Calcolare la massa di MEH-PPV in 1 ml di soluzione madre diluita rettificato come indicato di seguito utilizzando la molarità ottenuto nella sezione 2.1.4 e il peso molecolare (M w) di MEH-PPV, che è 10 6 g / mol. M = n / V (n -. No di talpe, V - volume in L) (Eqn 7) Così, la massa di MEH-PPV in 1 ml di adeguati undiluted soluzione madre è 9,15 x 10 -4 g. </li></ol></li><li> Unendo PCBM in MEH-PPV <ol><li> Calcolare la massa di Fenil-C 61 -butyric estere metilico (PCBM) da aggiungere nella soluzione di riserva MEH-PPV di fare il 50% in peso PCBM soluzione MEH-PPV drogato, dove il 50% in peso PCBM è definito rispetto alla massa di MEH-PPV (vale a dire, la metà della massa di MEH-PPV). Usando il peso di MEH-PPV ottenuto nella sezione 2.2. Messa di PCBM / 9,15 x 10 -4 g di MEH-PPV x 100% = 50% in peso PCBM (Eqn 8) Messa di PCBM = 4,57 x 10 -4 g (Eqn 9) </li><li> Pesare 1 mg PCBM in un flaconcino e aggiungere 500 microlitri THF. Calcolare la concentrazione di PCBM in questa soluzione con il peso molecolare del PCBM come 910,88 g / mol Molarità di soluzione PCBM = 0,001 g / (910,88 g / mol * 500 microlitri) (Eqn 10) Molarità di soluzione PCBM = 2.19 x 10 -9 mol / ml (Eqn 11) </li><li> Calcolare il volume di soluzione PCBM bisogno di aggiungere alla regolare ME non diluitoH-PPV soluzione madre per ottenere la soluzione di PCBM drogato MEH-PPV del 50% in peso in THF utilizzando la molarità calcolata al punto 2.3.2 4,57 x 10 -4 g di PCBM x 1 mol / 910,88 gx 1 ml / 2.19 x 10 -9 mol = 229 microlitri (Eqn 12) Aggiungere 229 ml di soluzione PCBM in 1 ml di soluzione madre aggiustato MEH-PPV non diluito e mescolare bene. </li></ol></li><li> Preparazione di nanoparticelle con il metodo riprecipitazione <ol><li> Trasferimento 1 ml della soluzione MEH-PPV / PCBM mescolati nella siringa da 1 ml con l&#39;ago collegato ad esso. </li><li> Iniettare rapidamente 1 ml di soluzione MEH-PPV / PCBM miscelato in 4 ml di acqua deionizzata agitazione a 1.200 giri al minuto. Arrestare mescolando immediatamente dopo l&#39;iniezione. Utilizzare queste nanoparticelle come tali. </li></ol></li></ol> 3. Incubazione di linee cellulari con nanoparticelle di Imaging NOTA: Tutte le esperimenti di imaging sono stati completati nel 35 mm capsule di Petri <ol><li> Assorbimento di nanopartiCles in linee cellulari <ol><li> Linee cellulari Cultura fino al 12 ° passaggio. Al 12 ° passaggio cellule di coltura in 35 mm piastre di Petri. Regolare la concentrazione di cellule aggiunte ai 35 mm, piastre di Petri tali che, dopo 24 ore le cellule sono il 40% confluenti. </li><li> A questo punto rimuovere il supporto DMEM supplementato con il 10% FBS dalle capsule di Petri, lavare le cellule con 1x DPBS due volte, e aggiungere 100 ml di sospensione nanoparticelle in 2 ml di DMEM alle piastre di Petri. </li><li> Dopo 24 ore rimuovere il DMEM / nanoparticelle sospensione dalle piastre di Petri e lavare le cellule con 1x DPBS 3 volte. Poi fissare le cellule mediante incubazione con 4% paraformaldeide per 10 min. Lavare due volte con DPBS. Macchiare le cellule con 300 nM DAPI incubando con il colorante per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l&#39;imaging. </li></ol></li><li> Rilevamento di ROS <ol><li> Cultura A549 e linee cellulari OVCAR3 in piastre di Petri, 6 per la linea cellulare, come spiegato nella sezione 3.1.1. Etichettare ilPiastre Petri come mostrato nella Tabella 1. </li><li> Aggiungere 100 microlitri della sospensione nanoparticelle in 2 ml DMEM a tre delle capsule di Petri come mostrato nella Tabella 1 e incubare per 24 ore. Per le piastre di Petri che riceveranno le dosi di luce, lavare le cellule dopo 24 ore e sospendere le cellule in HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank) Dye media liberi. </li><li> Riscaldare la lampada del simulatore solare per 15 minuti. Posizionare filtro UV davanti alla lampada per filtrare la luce UV. Calibrare la lampada con una cella solare di riferimento regolando la potenza della lampada per ottenere 0,5 sole (50 mW / cm 2) intensità sulla superficie della capsula di Petri. In questa particolare configurazione che condizione è stata raggiunta con 218 W di alimentazione in dotazione alla lampada. </li><li> Porre le capsule petri sotto la lampada (coperchio aperto) per 60 min, che si traduce in un dosaggio di 180 J luce / cm 2 come mostrato nei calcoli indicati 50 mW / cm 2 x 3.600 sec / 1.000 = 180 J / cm 2 </li><li> Rimuovere HBSS e senza lavaggio aggiungere ulteriori 2 ml supporti DMEM supplementato con il 10% FBS alle piastre di Petri. Incubare le cellule per altri 2 ore. </li><li> Per il controllo positivo incubare le cellule con 100 mM di perossido di idrogeno (H 2 O 2) per 30 min. </li><li> Macchiare le cellule in tutte le capsule di Petri con una concentrazione finale di 5 mM di reagente rilevare ROS incubando le cellule con il colorante per 30 min a 37 ° C. </li><li> Fissare le cellule mediante incubazione con 4% paraformaldeide per 10 min. Lavare due volte con DPBS. Macchiare le cellule con 300 nM DAPI incubando con il colorante per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l&#39;imaging. </li></ol></li><li> Apoptosi e necrosi da PI e annessina V FITC <ol><li> Cultura ciascuna linea cellulare in 5 piastre di Petri. Tre di queste piastre di Petri saranno per l&#39;esperimento, mentre i restanti 2 capsule di Petri saranno campioni di controllo. Incubare le 3 capsule di Petri per sperimentare l&#39;e nanoparticelleXplained nella sezione 3.1.2. I campioni di controllo non vengono incubati con nanoparticelle. </li><li> Dopo 24 ore di incubazione seguire il passo 3.2.3. </li><li> Posizionare i 3 piatti sperimentali Petri sotto la lampada (coperchio aperto) e rimuovere uno a 20 minuti, uno a 40 minuti e uno a 60 min. Questo produce tre campioni che sono stati esposti a dosi di luce di 60, 120 e 180 J / cm 2, rispettivamente (calcolo nella sezione 3.2.4). Successivamente, somministrare una 180 J / cm 2 dosaggio luce per uno dei piatti Petri di controllo. Questo è il controllo con dose di luce applicata in assenza di nanoparticelle. Non applicare una quantità di luce per il campione di controllo rimanente (senza nanoparticelle e nessuna dose di luce applicato). </li><li> Sostituire il HBSS con i media DMEM supplementato con il 10% FBS e mantenere le capsule di Petri nell&#39;incubatrice per 4 ore. </li><li> Macchiare le cellule nel sperimentale e le piastre di Petri di controllo con 20 ml di annessina V FITC incubando le cellule con il colorante per 15 min. Lavare due volte con DPBS. Colorare il cells con 300 Nm DAPI nonché 300 nm PI (ioduro di propidio) incubando con i coloranti per 2 min. Lavare due volte con DPBS. Poi mantenere le cellule in DPBS per l&#39;imaging. </li></ol></li></ol> 4. intrinseca citotossicità di nanoparticelle <ol><li> Il conteggio delle cellule e di coltura in piastre da 96 pozzetti <ol><li> Raccogliere le cellule dalla cultura palloni rimuovendo media e lavare le cellule due volte con DPBS seguita da incubazione delle cellule con 0,05% tripsina per 10 min. Aggiungere 2 ml supporti DMEM supplementato con 10% FBS alla soluzione cellulare risultante. Mescolare la soluzione corretta per separare gruppi di cellule in canottiere. </li><li> Prendete 100 ml di sospensione cellulare e aggiungere 900 microlitri per i media DMEM supplementato con il 10% FBS. Mescolare bene. Trasferire 10 ml di questa sospensione su un emocitometro. Contare le cellule utilizzando l&#39;emocitometro e regolare la concentrazione della sospensione di cellule in 4.1.1 a 5 x 10 4 cellule / ml. </li><li> Take 5 piastre a 96 pozzetti etichettati come 0 h, 24 hR, 48 ore, 72 ore e 96 ore. Aggiungere 50 ml di i 5 x 10 4 cellule / ml soluzioni cellulari (TE 71 e A549) nei pozzetti come mostrato nella Tabella 2, la semina così 2.500 cellule / pozzetto. Fate lo stesso procedimento per linee cellulari OVCAR3 e MDA-MB-231. </li><li> Dopo 24 ore lavare i pozzetti con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri di concentrazioni crescenti di nanoparticelle nei pozzetti come mostrato nella Tabella 2. Preparare diverse concentrazioni di nanoparticelle aggiungendo 20, 100, e 180 microlitri di sospensione nanoparticelle da 2.4.2 a DMEM a ottenere un volume finale di 2 ml, che produce concentrazioni di nanoparticelle di 0,4 x 10 -4 mg / ml, 2,0 x 10 -4 mg / ml e 3,6 x 10 -4 mg / ml, rispettivamente. Ogni linea cellulare è triplicato per ciascuna concentrazione di nanoparticelle. </li></ol></li><li> Misurazione della vitalità cellulare nel buio <ol><li> Aggiungere 10 microlitri MTT alla piastra 0 ore subito dopo l&#39;aggiunta di nanoparticelle. Incubare la piastra per 4 ore per cryst formazanoals per formare. Aggiungere la soluzione solubilizzazione 50 microlitri nei pozzetti. Incubare la piastra per 6 ore per sciogliere i cristalli di formazano. </li><li> Misurare la vitalità cellulare della piastra 0 ora registrando l&#39;assorbanza a 570 nm con lettore di piastre. </li><li> Per 24 ore piatto, lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri dei media in ogni incubazione bene dopo 24 ore con le nanoparticelle. Aggiungere MTT e leggere il piatto come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Per 48 ore, 72 ore, e 96 lastre hr, lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri supporti nei pozzetti dopo 24 ore di incubazione con le nanoparticelle. Incubare le cellule per i periodi di tempo rimanenti. </li><li> 4.2.5) Misurare la vitalità cellulare in particolari momenti come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2. </li><li> Ripetere l&#39;esperimento completo per 3 volte (n = 3) </li></ol></li></ol> 5. misurare la vitalità cellulare dopo PDT <ol><li> Contare le cellule e coltura in piastre da 96 pozzetti. <ol><li> Etichettare una serie di 96 pozzetti come indicato nella tabella 3, sia per i TE 71 piastre + A549 e OVCAR3 + MDA-MB-231 piatti. La disposizione delle piastre sarà uguale a quello mostrato in 4.1.3. </li><li> Seme le piastre a 96 pozzetti come spiegato nel paragrafo 4.1 con lo stesso layout come mostrato nella tabella 2 alla sezione 4.1.2. </li><li> Dopo 24 ore aggiungere nanoparticelle alle piastre come spiegato in 4.1.4. </li><li> 24 ore dopo l&#39;aggiunta di nanoparticelle lavare le cellule con 1x DPBS e aggiungere 50 microlitri HBSS in ciascun pozzetto. </li><li> Irradiare le piastre con le rispettive dosi di luce come spiegato in 3.2.3. </li><li> Sostituire il HBSS con 50 microlitri i media DMEM supplementato con il 10% FBS e incubare le piastre per i rispettivi periodi di tempo dopo la PDT. </li><li> Dopo ogni periodo di tempo misurare la vitalità cellulare come spiegato in 4.2.1 e 4.2.2. </li></ol></li></ol> 6. microscopia a fluorescenza <ol><li> Assorbimento di nanoparticelle <ol><li> Accendere le luci del microscopio unnd laser 30 minuti prima di imaging. Mettere la capsula di Petri contenente le cellule fisse (come spiegato nella sezione 3.1) sul palco del microscopio. </li><li> Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle e DAPI utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre la fase di contrasto, nanoparticelle e le immagini DAPI nel software ImageJ. </li></ol></li><li> Rilevamento di ROS <ol><li> Accendere le lampade del microscopio 30 min prima di imaging. Mettere la capsula di Petri contenente le cellule (come spiegato nella sezione 3.2) sul palco del microscopio. </li><li> Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle, DAPI, e il ROS rilevamento reattivo utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre il contrasto di fase, nanoparticelle, DAPI e ROS rilevamento immagini reagenti nel software ImageJ. </li></ol></li><li> Apoptosi e necrosi da PI e annessina V FITC <ol><li> Accendere le lampade del microscopio 30 min prima di imaging. Mettere la piastra di Petri contenente le cellule (come spiegato insezione 3.3) sul palco del microscopio. </li><li> Raccogliere la fluorescenza da nanoparticelle, DAPI, PI, e annessina V FITC utilizzando i filtri, come illustrato nella tabella 4. Sovrapporre il contrasto di fase, nanoparticelle, DAPI, PI e immagini annessina V FITC nel software ImageJ. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors have nothing to disclose.

Per ottenere nanoparticelle assorbimento era necessario mantenere alcune misure critiche mentre fabbricare nanoparticelle. A 10 -6 M soluzione MEH-PPV (miscelato con il 50% in peso PCBM) in THF era disposto per iniettare in acqua DI, come è stato osservato che la concentrazione di questa soluzione ha un ruolo importante nel determinare le dimensioni di nanoparticelle in formazione. Concentrazione è stata verificata mediante spettroscopia UV-vis. Si noti che nel passaggio 2.1.3 protocollo era necessario dilu...

In Terapia fotodinamica (PDT) fotosensibilizzanti vengono somministrati al tessuto bersaglio, e in seguito all&#39;esposizione alla luce il fotosensibilizzante genera specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS). Specie ROS come l&#39;ossigeno singoletto e superossido possono indurre lo stress ossidativo e la conseguente danno strutturale alle cellule e tessuti 1-4. Grazie alla sua facilità di applicazione questo metodo è stato attivamente indagato e gli studi clinici hanno avuto luogo 5,6. Tuttavia, le questioni rilevanti quali la tossicità scuro dei sensibilizzanti, la sensibilità del paziente alla luce (a causa della distribuzione non selettiva della sensibilizzante), e idrofobicità dei sensibilizzanti (che porta a ridurre la biodisponibilità e la potenziale tossicità acuta) rimangono. Qui riportiamo un metodo per la fabbricazione e la valutazione in vitro di condurre nanoparticelle polimeriche miscelati con fullerene come fotosensibilizzatori prossima generazione per PDT. Le nanoparticelle sono formate da auto-aggregazione diil polimero semiconduttore MEH-PPV (poli [2-metossi-5- (2-etilesilossi) -1,4-phenylenevinylene]) con il PCBM fullerene (fenil-C 61 -butyric metil estere) quando questi materiali sciolti in un compatibile solvente stanno rapidamente iniettati in un solvente non compatibile (Figura 1A). La scelta di MEH-PPV come il polimero host è motivata dal suo elevato coefficiente di estinzione che porta ad alti tassi di formazione tripletta, e sia efficiente e ultraveloce carica e trasferimento di energia al PCBM fullerene 7. Queste proprietà sono ideali per la sensibilizzazione di ossigeno singoletto e formazione superossido in PDT. Fullerene è stato infatti applicato nel PDT sia in forma molecolare e nanoparticelle 8-13. Tuttavia, una grave citotossicità ha ostacolato un ulteriore sviluppo 12. Qui mostriamo che incapsulando il fullerene in una matrice serie di MEH-PPV cedere compositi nanoparticelle MEH-PPV / PCBM risultati in un materiale sensibilizzare PDT che hoNon è citotossico intrinsecamente, mostra specificità verso le cellule tumorali a causa delle dimensioni delle nanoparticelle e carica di superficie, e le rese di trattamento altamente efficace PDT a dosi di luce scarsa a causa delle proprietà fotofisiche di cui sopra.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MEH-PPV)</td>
			<td>Sigma Aidrich</td>
			<td>536512-1G</td>
			<td>average Mn&#160;150,000-250,000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[6,6]-Phenyl C61&#160;butyric acid methyl ester (PCBM)</td>
			<td>Sigma Aidrich</td>
			<td>684449-500MG</td>
			<td>&#62; 99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetrahydrofuran (THF)</td>
			<td>EMD</td>
			<td>TX0284-6</td>
			<td>Drisolv</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>National Scientific Company</td>
			<td>37510-1</td>
			<td>For filtration of MEH-PPV solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28145-495</td>
			<td>25 mm, 0.2 &#181;m, PTFE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81320</td>
			<td>For injection of MEH-PPV solution into water to make nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium/Ham&#39;s F-12 50/50 Mix (DMEM)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution without phenol red (HBSS)</td>
			<td>Quality Biological (VWR)</td>
			<td>10128-740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline, 1X without calcium and magnesium (DPBS)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, Regular (Heat Inactivated) (FBS)</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 1X 0.25%</td>
			<td>Corning (VWR)</td>
			<td>45000-664</td>
			<td>Trypsin/2.21 mM EDTA in HBSS without sodium bicarbonate, calcium and magnesium Porcine Parvovirus Tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences&#160;</td>
			<td>15710</td>
			<td>16% paraformaldehyde is diluted to 4% by adding PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>&#160;Biotium VWR</td>
			<td>89139-054</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 culture flask</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-856</td>
			<td>for culturing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-771</td>
			<td>for MTT assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dishes with Vents</td>
			<td>Greiner Bio-One (VWR)</td>
			<td>82050-538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide</td>
			<td>Molecular probes</td>
			<td>P3566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A13199</td>
			<td>dye for apoptosis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celltiter 96 non-R 1000 assays</td>
			<td>Promega (VWR)</td>
			<td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td>
			<td>MTT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellROX Green Reagent, for oxidative stress detection</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10444</td>
			<td>For ROS detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-vis spectrometer</td>
			<td>Agilent 8453</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectrometer</td>
			<td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic light scattering</td>
			<td>PD2000DLS, Precision detector</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NuAir DH Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss Axioskop2</td>
			<td></td>
			<td>63X oil immersion objective lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epiluminescence microscope</td>
			<td>Olympus IX71</td>
			<td></td>
			<td>60X water immersion objective lens, Andor Zyla sCMOS camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solar Simulator</td>
			<td>Newport 67005 Oriel Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reference solar cell</td>
			<td>Oriel&#160;</td>
			<td></td>
			<td>VLSI Standards Incorporated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>BioTek Ex808</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Hausser Scientific Partnership</td>
			<td>3200</td>
			<td>For counting cells</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodynamic therapy with blended conducting polymer/fullerene nanoparticle photosensitizers

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT) is reported. The nanoparticles are formed by hydrophobic interaction of the semiconducting polymer MEH-PPV (poly[2-methoxy-5-(2-ethylhexyloxy)-1,4-phenylenevinylene]) with the fullerene PCBM (phenyl-C61-butyric acid methyl ester) in the presence of a non-compatible solvent. MEH-PPV has a high extinction coefficient that leads to high rates of triplet formation, and efficient charge and energy transfer to the fullerene PCBM. The latter processes enhance the efficiency of the PDT system through fullerene assisted triplet and radical formation, and ultrafast deactivation of MEH-PPV excited stated. The results reported here show that this nanoparticle PDT sensitizing system is highly effective and shows unexpected specificity to cancer cell lines.

Assorbimento e citotossicità intrinseca di nanoparticelle Il 50% in peso di blended nanoparticelle MEH-PPV / PCBM sono state incubate con TE 71, MDA-MB-231, A549 e linee cellulari OVCAR3. Il livello PCBM fusione è stato scelto come il 50% in peso PCBM, che ha dimostrato di fornire carica e trasferimento di energia proprietà ideali tra polimeri coniugati e fullereni 14. Immagini di fluorescenza di nanoparticelle assorbimento sono mostrati in figura 1B. Le cellul...

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Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT).

Terapia fotodinamica con Blended Condurre Polimero / Fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

8.4K Views.  University of Central Florida. This protocol describes a method for the fabrication of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene. These nanoparticles were investigated for their potential use as a next generation photosensitizers for Photodynamic Therapy (PDT). 

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Conducting Miller-Urey Experiments

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the primordial Earth&#39;s atmosphere-ocean system. Miller introduced 200 ml of water, 100 mmHg of H2, 200 mmHg of CH4, and 200 mmHg of NH3 into the apparatus, then subjected this mixture, under reflux, to an electric discharge for a week, while the water was simultaneously heated. The purpose of this manuscript is to provide the reader with a general experimental protocol that can be used to conduct a Miller-Urey type spark discharge experiment, using a simplified 3 L reaction flask. Since the experiment involves exposing inflammable gases to a high voltage electric discharge, it is worth highlighting important steps that reduce the risk of explosion. The general procedures described in this work can be extrapolated to design and conduct a wide variety of electric discharge experiments simulating primitive planetary environments.

The Miller-Urey experiment was a pioneering study regarding the abiotic synthesis of organic compounds with possible relevance to the origins of life. Simple gases were introduced into a glass apparatus and subjected to an electric discharge, simulating the effects of lightning in the primordial Earth&#8217;s atmosphere-ocean system. The experiment was conducted for one week, after which, the samples collected from it were analyzed for the chemical building blocks of life.

Condurre esperimenti Miller-Urey

In 1953, Stanley Miller reported the production of biomolecules from simple gaseous starting materials, using an apparatus constructed to simulate the ...

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Chimica

A Technique to Functionalize and Self-assemble Macroscopic Nanoparticle-ligand Monolayer Films onto Template-free Substrates

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and scalable technique efficiently functionalizes metallic nanoparticles with thiol-ligands in a miscible water/organic solvent mixture allowing for rapid grafting of thiol groups onto the gold nanoparticle surface. The hydrophobic ligands on the nanoparticles then quickly phase separate the nanoparticles from the aqueous based suspension and confine them to the air-fluid interface. This drives the ligand-capped nanoparticles to form monolayer domains at the air-fluid interface.&#160; The use of water-miscible organic solvents is important as it enables the transport of the nanoparticles from the interface onto template-free substrates.&#160; The flow is mediated by a surface tension gradient3,4 and creates macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle-ligand films.&#160; This self-assembly technique may be generalized to include the use of particles of different compositions, size, and shape and may lead to an efficient assembly method to produce low-cost, macroscopic, high-density, monolayer nanoparticle films for wide-spread applications.

A simple, robust and scalable technique to functionalize and self-assemble macroscopic nanoparticle-ligand monolayer films onto template-free substrates is described in this protocol.

Una tecnica di funzionalizzare e Self-montare macroscopiche nanoparticelle-ligando monostrato Films su substrati privi di modello

This protocol describes a self-assembly technique to create macroscopic monolayer films composed of ligand-coated nanoparticles1,2. The simple, robust and ...

Synthesis and Testing of Supported Pt-Cu Solid Solution Nanoparticle Catalysts for Propane Dehydrogenation

A convenient method for the synthesis of bimetallic Pt-Cu catalysts and performance tests for propane dehydrogenation and characterization are demonstrated here. The catalyst forms a substitutional solid solution structure, with a small and uniform particle size around 2 nm. This is realized by careful control over the impregnation, calcination, and reduction steps during catalyst preparation and is identified by advanced in situ synchrotron techniques. The catalyst propane dehydrogenation performance continuously improves with increasing Cu:Pt atomic ratio.

A convenient method for the synthesis of 2 nm supported bimetallic nanoparticle Pt-Cu catalysts for propane dehydrogenation is reported here. In situ synchrotron X-ray techniques allow for the determination of the catalyst structure, which is typically unobtainable using laboratory instruments.

Sintesi e test di sostanza solida Pt-Cu sostenuta Catalizzatori di nanoparticelle per la deidrogenazione del propano

A convenient method for the synthesis of bimetallic Pt-Cu catalysts and performance tests for propane dehydrogenation and characterization are ...

Liquid-cell Transmission Electron Microscopy for Tracking Self-assembly of Nanoparticles

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully understood. We have traced the trajectories of individual nanoparticles using liquid-cell transmission electron microscopy (TEM) to investigate the mechanism of the assembly process. Herein, we present the protocols used for liquid-cell TEM studies of the self-assembly mechanism. First, we introduce the detailed synthetic protocols used to produce uniformly sized platinum and lead selenide nanoparticles. Next, we present the microfabrication processes used to produce liquid cells with silicon nitride or silicon windows and then describe the loading and imaging procedures of the liquid-cell TEM technique. Several notes are included to provide helpful tips for the entire process, including how to manage the fragile cell windows. The individual motions of nanoparticles tracked by liquid-cell TEM revealed that changes in the solvent boundaries caused by evaporation affected the self-assembly process of nanoparticles. The solvent boundaries drove nanoparticles to primarily form amorphous aggregates, followed by flattening of the aggregates to produce a 2-dimensional (2D) self-assembled structure. These behaviors are also observed for different nanoparticle types and different liquid-cell compositions.

Here we introduce experimental protocols for the real-time observation of a self-assembly process using liquid-cell transmission electron microscopy.

Microscopia elettronica in trasmissione di liquidi-cellula per l'inseguimento auto-assemblaggio delle nanoparticelle

Drying a nanoparticle dispersion is a versatile way to create self-assembled structures of nanoparticles, but the mechanism of this process is not fully ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

Segnale Nanosonda rapido aumento di sintesi di nanoparticelle di oro In Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Methionine Functionalized Biocompatible Block Copolymers for Targeted Plasmid DNA Delivery

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers via RAFT polymerization. Firstly, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-aminopropyl)methacrylamide (BNHEMA-b-APMA, BA) was synthesized via RAFT polymerization using 4,4&#8217;-azobis(4-cyanovaleric acid) (ACVA) as an initiating agent and 4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CTP) as the chain transfer agent. Subsequently, N,N-bis(2-hydroxyethyl)methacrylamide-b-N-(3-guanidinopropyl)methacrylamide (methionine grafted BNHEMA-b-GPMA, mBG) was prepared by modifying amine groups in APMA with methionine and guanidine groups. Three kinds of block polymers, mBG1, mBG2, and mBG3, were synthesized for comparison. A ninhydrin reaction was used to quantify the APMA content; mBG1, mBG2, and mBG3 had 21%, 37%, and 52% of APMA, respectively. Gel permeation chromatography (GPC) results showed that BA copolymers possess molecular weights of 16,200 (BA1), 20,900(BA2), and 27,200(BA3) g/mol. The plasmid DNA (pDNA) complexing ability of the obtained block copolymer gene carriers was also investigated. The charge ratios (N/P) were 8, 16, and 4 when pDNA was complexed completely with mBG1, mBG2, mBG3, respectively. When the N/P ratio of mBG/pDNA polyplexes was higher than 1, the Zeta potential of mBG was positive. At an N/P ratio between 16 and 32, the average particle size of mBG/pDNA polyplexes was between 100-200 nm. Overall, this work illustrates a simple and convenient protocol for the block copolymer carrier synthesis.

This work presents the preparation of methionine functionalized biocompatible block copolymers (mBG) via the reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) method. The plasmid DNA complexing ability of the obtained mBG and their transfection efficiency were also investigated. The RAFT method is very beneficial for polymerizing monomers containing special functional groups.

Meticolosina Sistemi colatori di blocchi biocompatibili per la consegna mirata del DNA plasmide

Reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization integrates the advantages of radical polymerization and living polymerization. This ...

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in physiological fluids induce denaturation and degradation of self-assembled DNA nanostructures. In non-viral gene delivery, enzymatic degradation of DNA is overcome by the encapsulation of the negatively charged DNA in a cationic shell. Herein, inspired by gene delivery advancements, a simple, one-step and robust methodology is presented for the stabilization of DNA origami nanostructures by coating them with chitosan and linear polyethyleneimine. The polycation coating efficiently protects DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media. This method also preserves the full addressability of enzyme- and aptamer-based functionalization of DNA nanostructures.

Here, a protocol for the protection of DNA origami nanostructures in Mg-depleted and nuclease-rich media using natural cationic polysaccharide chitosan and synthetic linear polyethyleneimine (LPEI) coatings is presented.

Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

Gold Nanoparticle Modified Carbon Fiber Microelectrodes for Enhanced Neurochemical Detection

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into glass capillaries, pulled to a fine taper, and then sealed using an epoxy to create electrode materials that are used for fast scan cyclic voltammetry testing. The use of bare CFMEs has several limitations, though. First and foremost, the carbon fiber contains mostly basal plane carbon, which has a relatively low surface area and yields lower sensitivities than other nanomaterials. Furthermore, the graphitic carbon is limited by its temporal resolution, and its relatively low conductivity. Lastly, neurochemicals and macromolecules have been known to foul at the surface of carbon electrodes where they form non-conductive polymers that block further neurotransmitter adsorption. For this study, we modify CFMEs with gold nanoparticles to enhance neurochemical testing with fast scan cyclic voltammetry. Au3+ was electrodeposited or dipcoated from a colloidal solution onto the surface of CFMEs. Since gold is a stable and relatively inert metal, it is an ideal electrode material for analytical measurements of neurochemicals. Gold nanoparticle modified (AuNP-CFMEs) had a stability to dopamine response for over 4 h. Moreover, AuNP-CFMEs exhibit an increased sensitivity (higher peak oxidative current of the cyclic voltammograms) and faster electron transfer kinetics (lower &#916;EP or peak separation) than bare unmodified CFMEs. The development of AuNP-CFMEs provides the creation of novel electrochemical sensors for detecting fast changes in dopamine concentration and other neurochemicals at lower limits of detection. This work has vast applications for the enhancement of neurochemical measurements. The generation of gold nanoparticle modified CFMEs will be vitally important for the development of novel electrode sensors to detect neurotransmitters in vivo in rodent and other models to study neurochemical effects of drug abuse, depression, stroke, ischemia, and other behavioral and disease states.

In this study, we modify carbon-fiber microelectrodes with gold nanoparticles to enhance the sensitivity of neurotransmitter detection.

Microelettrodi in fibra di carbonio modificati con nanoparticle d'oro per una migliore rilevazione neurochimica

For over 30 years, carbon-fiber microelectrodes (CFMEs) have been the standard for neurotransmitter detection. Generally, carbon fibers are aspirated into ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Characterization needs to be thorough and the technique chosen should be well-suited to the property to be determined, the material being analyzed and the medium in which it is present. Furthermore, the instrument operation and methodology need to be well-developed and clearly understood by the user to avoid data collection errors. Any discrepancies in the applied method or procedure can lead to differences and poor reproducibility of obtained data. This paper aims to clarify the method to measure the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). This study was carried out as an inter-laboratory comparison (ILC) amongst seven different laboratories to validate the standard operating procedure&#8217;s performance and reproducibility. The results obtained from this ILC study reveal the importance and benefits of detailed standard operating procedures (SOPs), best practice updates, user knowledge, and measurement automation.

The protocol described here aims to measure the hydrodynamic diameter of spherical nanoparticles, more specifically gold nanoparticles, in aqueous media by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The latter involves tracking the movement of particles due to Brownian motion and implementing the Stokes-Einstein equation to obtain the hydrodynamic diameter.

Analisi del tracciamento delle nanoparticelle di nanoparticelle d'oro nei media acquosi attraverso un confronto tra laboratori

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.