Questo studio è un sistema semplice, versatile e facile per esaminare diversi effetti fotodinamici su vari microrganismi e cellule. In questo sistema, il LED può essere inserito in una disposizione diversa a seconda del design dell'esperimento. Diverse condizioni di PDT possono essere calcolate in una piastra a 96 pozzetti o anche in una piastra a 384 pozzetti in un esperimento.
Questa tecnica può essere utilizzata per trattare la cheratite fungina a causa della quale a livello globale, circa 150.000 persone perdono gli occhi nonostante i trattamenti intensivi. Per iniziare, tagliare quattro LED verdi da una striscia LED e allinearli con tre pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. Misurare la frequenza di fluenza del LED a 540 nanometri con un misuratore di potenza luminosa.
Mantenere una temperatura costante a 25 gradi Celsius con un ventilatore elettrico che è stato assemblato accanto alla piastra durante l'irradiazione. Con un anello sterile, scegli una singola colonia di Candida albicans da una piastra di agar e aggiungila a un tubo di vetro sterilizzato contenente tre millilitri di mezzo YPD. Incubare il tubo a 25 gradi Celsius ad una velocità di rotazione di 155 RPM per 14-16 ore per far crescere la coltura del lievito.
Quindi diluire la coltura notturna con il mezzo YPD a un valore OD 600 di 0,5. Incubare a 30 gradi Celsius con rotazione a 155 RPM per quattro ore per raggiungere la fase di crescita del log. Ripetere la diluizione della coltura in fase logaritmica con mezzo YPD fresco ad un valore OD 600 di 0,65, per ottenere circa una volta 10 alla settima unità formante colonia per millilitro.
Contemporaneamente preparare una soluzione stock al 4% di rose bengal in 1X PBS. Filtro sterilizzare con un filtro da 0,22 micrometri. Aggiungere 111 microlitri di soluzione di rose bengal al 2% a un millilitro di coltura in fase logaritmica e co-coltura in diversi punti temporali a temperatura ambiente per comprendere l'assorbimento di RB nelle cellule.
Centrifugare a 16, 100 volte G per 2 minuti e mezzo a temperatura ambiente e lavare la co-coltura tre volte con un millilitro di 1X PBS. Dopo il lavaggio, risospensionare la coltura candida albicans in un millilitro di 1X PBS. Per ogni condizione, distribuire la coltura in tre diversi pozzetti in una piastra da 96 pozzetti.
Allineare i pozzetti con l'array di LED. Nei gruppi esposti alla luce, accendere la ventola elettrica e la luce. Dopo l'irradiazione, eseguire due diluizioni seriali dieci volte prendendo 20 microlitri della soluzione di co-coltura da un pozzo e aggiungendolo a un tubo contenente 180 microlitri di 1X PBS.
Quindi rilascia 20 microlitri di ogni diluizione seriale in un quadrante di una piastra di agar YPD per ottenere colonie numerabili sulla piastra. La microscopia fluorescente ha mostrato una colorazione immediata di Candida albicans con rosa bengala sotto fluorescenza rossa. Dopo 15 minuti di incubazione, la maggior parte delle cellule sono state macchiate con rosa bengala, indicando che entra nelle cellule in modo dipendente dal tempo.
Inoltre, l'attivazione del rose bengal con la luce genera radicali liberi e ossigeno singoletto nelle cellule, con conseguente morte cellulare. In assenza di rosa bengala o irradiazione, non è stata osservata alcuna morte cellulare. La Candida albicans è stata inibita dopo irradiazione di luce verde in presenza dello 0,2% di rosa bengala in modo leggero dose-dipendente.
È importante che prima la piastra a 96 pozzetti sia allineata con il centro del LED. In secondo luogo, la piastra di agar utilizzata deve essere asciugata accuratamente per impedire la miscelazione di colonie separate. La Candida albicans che è cresciuta sulla piastra può essere ulteriormente inviata per l'analisi genica, che può rispondere a come la PDT influenza l'espressione genica delle cellule.
Queste tecniche aprono la strada per esaminare come funziona la PDT su diversi tipi di cellule, cellule tumorali, batteri, funghi o virus con una piattaforma facile, economica e versatile.
