This work was supported by National Institutes of Health (NIH) Grant number: NIH P50DC00422 (H.L.); NIH R01DC12058 (H.L.). This work also benefitted from the South Carolina Clinical and Translational Research Institution (SCTR) Clinical and Translational Science Award (NIH/NCRR UL1RR029882). The funders had no role in study design, data collection, and/or analysis. The authors would like to thank Lonnie E. Brown Jr. for his artistic and graphic contributions.

Tutti gli aspetti della ricerca sugli animali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Istituzionale adeguata cura degli animali e Usa. Tutte le procedure sperimentali su animali vertebrati qui descritti sono stati approvati in base alle direttive della Medical University di comitato (MUSC) Istituzionale cura degli animali e Usa della Carolina del Sud (IACUC). Selezione 1. Modello <ol><li> Mantenere il modello animale in un vivaio a basso rumore con custodia di routine per i protocolli istituzionali fino al momento dell&#39;uso. Nella ricerca animale strutture (ARFs), mantenere la stabilità delle vibrazioni, il rumore di smorzamento, l&#39;illuminazione diurna, lo spazio di preparazione, finiture di superficie, di tenuta e coibentazione e ventilazione in grado di soddisfare gli standard NIH. Nota: National Institutes of Health (NIH) linee guida per la ARFs e il mantenimento di un basso rumore vivaio possono essere riveduti su: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/ </li><li> Per tutti gli esperimenti, utilizzare l&#39;orecchio destro come l&#39;orecchio sperimentale. L&#39;orecchio sinistro serve da controllo intra-animale e non viene alterata chirurgicamente. </li><li> Controllare il modello animale pre-operatoria per segni di infezione medio o esterno dell&#39;orecchio. Potenziali segni possono includere drenaggio del liquido o pus dall&#39;orecchio, tessuto infiammato pinna, e / o letargia dell&#39;animale. Questo è insolito, ma se osservato, evitare ulteriori interventi chirurgici e trattare l&#39;animale in modo appropriato. </li></ol> 2. Procedure preoperatori <ol><li> Anestetizzare l&#39;animale 30 min prima dell&#39;intervento e procedure perioperatorie via intraperitoneale (IP) iniezione di ketamina (100 mg / kg IP) e xilazina (20 mg / kg IP). Supplemento anestesia se necessario, come giudicato da una punta pinch reflex positivo, con un dosaggio inferiore di ketamina (25 mg / kg IP) e xilazina (5 mg / kg IP). Determinare il dosaggio in conformità con i protocolli istituzionalmente consentiti per topi con età opportuni aggiustamenti del dosaggio. </li><li> Controllare per la piena sedation del modello. Verificare la presenza di una fase 3 piano di anestesia per la totalità del protocollo descritto segnata da un tasso di respirazione normale, la mancanza del riflesso di raddrizzamento (nei topi), e la mancanza di pedale e palpebrale (toe-pinch) riflessi. Mantenere l&#39;animale a questo livello di anestesia. Questo è fondamentale per la minimizzazione del dolore e del movimento intraoperatorio, sanguinamento, e la perdita di liquidi interstiziali durante l&#39;intervento chirurgico. </li><li> Mantenere la temperatura corporea dell&#39;animale a 37,5 ° C con una piastra elettrica a ciclo chiuso. </li><li> Somministrare l&#39;analgesia per via sottocutanea di buprenorfina. Invia buprenorfina (0,1 mg / kg una volta SQ 30 min prima della chirurgia) come analgesico per ridurre al minimo qualsiasi disagio chirurgica. Dosaggio di base e le alternative adatte al modello selezionato su protocolli istituzionalmente approvati. Antibiotici uso non è necessario se buona tecnica asettica è stata praticata. Gli animali ricevono analgesia post-operatoria se ci sono segni di dolore e angoscia. </li><li> Eseguire phTest ysiologic prima dell&#39;intervento. Esecuzione uditivo risposta tronco (ABR) prova e / o la distorsione prodotto test emissioni optoacustica (DPOAE) sia pre-operatorio e appena prima del sacrificio dell&#39;animale serve come una misurazione oggettiva per l&#39;effetto dell&#39;agente ototossica scelta sulla uditiva del mouse. </li></ol> 3. Preparazione chirurgica e Posizionamento <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti di pre-operatorio per gli standard istituzionali. Preparare strumenti chirurgici e campo in modo coerente, sterili, e organizzata per evitare sforzi inutili e il movimento durante la procedura. Tipici strumenti necessari include forbici dissezione taglienti, diverse paia di pinze metalliche con punte del gioielliere, un prelievo otologica, una curette otologica, e una unità di elettrocauterizzazione bipolare (Figura 1). </li><li> Preparare e sterilizzare stoppini di carta a base di labwipes in anticipo, tagliando un pezzetto triangolare della wipe (~ 0,7 x 1,25 x 1.75 in) e torsione saldamente tra il pollice e l&#39;indice di una mano (~ 1,25 in). Creazione di un strettamente intrecciato, stoppino estremamente sottile è fondamentale per il successo della procedura. Preparare un totale di 15-20 stoppini prima dell&#39;intervento (Figura 2). </li><li> Utilizzare un trapano dentistico per perforare rapidamente l&#39;osso del bolla timpanica in modo controllato. L&#39;utilizzo di un trapano a mano dentale a cinghia con una punta di 1 o 2 mm rastremato è preferibile. Un microscopio operatorio è necessario per completare il protocollo. (vedi punto 4.7) </li><li> Pre-disegnare 0,2 ml di una soluzione acquosa contenente l&#39;agente ototossica selezionato in una siringa da 1 ml con tubercolina 28 G, 1/2 &#39;ago. Tipicamente 1 goccia (~ 10 ml) dell&#39;agente è sufficiente a riempire completamente la RWN mouse. Un metallico, smussato ago della siringa punta facilita la consegna di un agente, evitando danni alle strutture sottostanti da una punta smusso tagliente. Espellere l&#39;aria all&#39;interno della siringa come bolle possono inavvertitamente riempire il RWN e / o ostacolare la correttaapplicazione dell&#39;agente alla finestra rotonda stessa. </li><li> Rimuovere la pelliccia dalla pelle post-atriale utilizzando Clippers governare elettrici. Rimuovere pelliccia in una zona che si estende dalla piega atrio-cefalica rostralmente al caudalmente cingolo scapolare. Estendere depilazione dalla dorsale, linea mediana sagittale l&#39;angolo mandibolare laterale. Rimozione pelliccia corretta è fondamentale per il mantenimento di un campo chirurgico pulito e chiaro. Spazzolare delicatamente ritagli dal sito chirurgico. </li><li> Sterilizzare pelle della zona preparata per protocolli istituzionali. Applicare betadine (povidone / iodio) alternati con etanolo topica in modo circolare per 2 minuti. Altri agenti possono essere sostituite da linee guida istituzionali. </li><li> Posto l&#39;animale su una superficie piana per mantenere costante posizionamento del corpo durante la procedura. Utilizzare un piccolo rilievo di riscaldamento posto sotto il corpo sulla piattaforma di controllo della temperatura corporea durante la procedura per mantenere la temperatura corporea dell&#39;animale a 36-38 ° C. Non il sobriorheat l&#39;animale in quanto ciò potrebbe causare lievi a seri danni alla pelle e / o all&#39;inizio eutanasia. <ol><li> Fissare la testa dell&#39;animale mediante un apparato di supporto morso / testa. Utilizzare un 0,5 cm di due centimetri morso lavorato da ottone con fori di diametro 2-4 mm forati attraverso di essa ad intervalli di 5 mm lungo l&#39;asse longitudinale. Aprire la bocca dell&#39;animale intorno a questo apparecchio e montare gli incisivi centrali superiori in uno dei fori a seconda delle dimensioni dell&#39;animale. Stringere delicatamente una piccola pinza sopra il dorso della muso dell&#39;animale per tenerlo in posizione (Figura 3). </li><li> Verificare che il supporto blocchetto / testa morso è rigidamente collegato al centro di un braccio articolato a forma di U (figura 3). Fissare un&#39;asta larga 1 centimetro al braccio sinistro della &quot;U&quot; e utilizzare stelo come una testa di riposo sul lato sinistro (lato destro è sempre il lato operativo). </li><li> Una volta saldamente nel supporto testa, ruotare il mouse in una posizione di decubito laterale sinistro. Posizionare il corpo carefully sulla superficie piatta di funzionamento per assicurare che possa essere stabile durante tutta la procedura ed evitare lo stress torsionale eccessivo per le vertebre cervicali. </li></ol></li><li> Posizionare un microscopio operatorio capace di 4x, 10x e 20x il campo chirurgico. Verificare che il microscopio possa mantenere la sua posizione in modo mani libere come questo è l&#39;ideale per il protocollo chirurgico a due mani discussi di seguito. </li><li> Posizionare una unità cauterizzazione bipolare-abilitato con parte della mano multa gioielliere a punta in una posizione che è immediatamente disponibile per l&#39;assistenza in cauterizzazione di piccoli vasi e la dissezione dei tessuti. Ciò può anche essere necessario dovrebbe essere rilevato sanguinamento più pesante. </li></ol> 4. approccio chirurgico <ol><li> Sotto ingrandimento microscopico, usare forbici affilate o una lama di bisturi per creare una incisione retroauricolare 1-1,5 cm, di circa 6-8 mm caudale alla piega auriculocephalic. Nel topo adulto, un&#39;incisione dalla linea mediana dorsalelateralmente ad un punto vicino l&#39;angolo della mandibola è adeguata. Evitare accuratamente il taglio in profondità per preservare le strutture vascolari sottostanti. </li><li> Effettuare un&#39;attenta smussa attraverso lo strato di grasso sottocutaneo che può essere di spessore variabile. Grasso può essere rimosso in sicurezza, se necessario, ad una migliore esposizione. Fare attenzione quando sezionare in una direzione ventrale-mediale come la vena giugulare esterna attraversa questa zona e danni a questa struttura possono provocare grandi quantità di perdita di sangue e allagamento del campo chirurgico. Controllare qualsiasi sanguinamento eccessivo con spugne di gelatina assorbibili e / o pellet di cotone. Utilizzare cauterizzazione bipolare di sanguinamento più pesante. </li><li> Una volta che lo strato di grasso è correttamente divisa, esporre la muscolatura cervicale. Nota strutture importanti, tra cui il grande corpo muscolare dei cleidomastoideus centrale all&#39;interno del campo chirurgico esposto, la vena giugulare esterna ventrale, e il tessuto parotide rostralmente sovrastante l&#39;angolo della mandibola. Un importante punto di riferimento è un piccolo branc nervih (del nervo craniale XI) che avvolge il margine posteriore / dorsale della cleidomastoideus estendere rostralmente verso la pinna (Figura 4). </li><li> Estrarre con cautela il corpo cleidomastoideus muscolare in direzione posteriore / dorsale (figure 4, 5). Dividere delicatamente la fascia trasparente che avvolge il corpo muscolare. In modo simile, estrarre con cautela la parotide e vena giugulare esterna in (anteriore / ventrale) direzione opposta (figura 5). </li><li> Con buona retrazione del corpo cleidomastoideus muscolare, la cupola lucido della bolla timpanica periostio entrerà in vista (Figura 6). Alla parte caudale della bolla, l&#39;inserimento di un muscolo cervicale profonda, la sternomastoideus, sarà visibile (Figura 6). Preservare il nervo facciale, che diventa visibile alla dorsale e aspetti rostrale della cupola bulla. Posizionare un divaricatore di auto-mantenimento (titanio sterile shaft-- incorporato in silicone e gettaincollare) prima della perforazione. </li><li> Con la tecnica a due mani, dividere delicatamente il periostio bulla con diatermia bipolare per esporre l&#39;osso sottostante. Utilizzando pinze o una curette otologica, elevare delicatamente e spingere il periostio in una direzione periferica ampiamente esporre la cupola bulla. Nota: Passo 4.6 è fondamentale per massimizzare la vista chirurgico dello spazio dell&#39;orecchio medio. Utilizzare manipolazione dei tessuti molli meticoloso e delicato per evitare emorragie e / o perdite di liquido interstiziale nella cavità bulla dopo la foratura. </li><li> C&#39;era una cupola bulla correttamente esposta, praticare un foro pilota 2 millimetri attraverso l&#39;osso bulla con un trapano chirurgico dentale tra il margine caudale della cupola e la linea visibilmente opaca (che rappresenta la membrana timpanica) si estende attraverso l&#39;aspetto rostrale della bolla (Figura 7). Fare attenzione a praticare solo attraverso l&#39;osso per conservare le strutture sottostanti, quali l&#39;arteria stapediale. Praticare un secondo foro pilota vicino per facilitare un-copertura dell&#39;osso bulla (&lt;strong&gt; Figura 7). </li><li> Utilizzando un paio di pinze punta del gioielliere, stappando l&#39;osso bulla in una dorsale e caudale (Figura 8). Rimuovere l&#39;osso in maniera frammentaria sotto alto ingrandimento. Non forare l&#39;arteria stapediale, che si trova direttamente sotto il tappo bulla, come sanguinamento da questa arteria può compromettere la procedura. Minimizzare la quantità di osso rimosso per prevenire un eccessivo ingresso fluido nell&#39;orecchio medio, pur consentendo ottimale visualizzazione e accesso alla finestra nicchia rotonda (Figura 8). </li></ol> 5. Finestra rotonda Applicazione di ototossiche agente <ol><li> Effettuare sottili regolazioni di rotazione al supporto della testina per portare il RWN esattamente in vista. Il RWN si trova in genere la dorsale e parte caudale dello spazio dell&#39;orecchio medio e appare come un rientro a bicchiere del otico capsula di tessuto osseo. Nella maggior parte dei casi, l&#39;arteria stapediali corre 1-2 mm ventrale / rostrale a questo. Il RWN a volte può essere tucked perifericamente sotto un&#39;angolazione acuta della cupola bulla. In questi casi, un attento posizionamento della testa dell&#39;animale è fondamentale. <ol><li> Utilizzando gli stoppini documento preparato prima dell&#39;intervento, rimuovere tutto il liquido visibile nell&#39;orecchio medio e RWN fino arida viene visualizzata. Nota: Questa è la fase più critica dell&#39;intero protocollo, come ~ 10 microlitri (1 goccia) dell&#39;agente ototoxic applicato al RWN facilmente diluito con questo fluido. </li></ol></li><li> Sotto ingrandimento massimo, utilizzare un ago calibro fine su una siringa da tubercolina 1 ml di applicare una goccia (~ 10 ml) di agente ototossica direttamente al RWN, riempiendolo completamente. Fare attenzione a non interrompere l&#39;arteria stapediale e osservare da vicino per la sostituzione di una piccola riflessione della luce alla base di una nicchia a secco con un sordo e nebuloso menisco fluide come un indicatore che la nicchia si sta riempiendo in modo corretto. <ol><li> Lasciare che l&#39;agente di riposare all&#39;interno del RWN per circa 10 minuti il ​​tempo di esposizione. Dopo questo, completamente wick l&#39;agente e sostituirla con una nuova applicazione dello stesso agente. Determinare ripetizioni di applicazione secondo le specifiche degli agenti. Tempo totale di esposizione in questa procedura varia tipicamente da 30 a 60 min. </li><li> Al termine della procedura, completamente allontanare il dell&#39;agente un&#39;ultima volta e applicare agente fresco al RWN. Lasciare la bulla ridotti e di utilizzare pinze per chiudere il tessuto molle sul sito chirurgico. </li></ol></li><li> Sigillare sito chirurgico a livello della cute con un 4-0, non assorbibile sutura monofilamento. Posto l&#39;animale in una gabbia di recupero / stazione. Monitorare condizioni cliniche dell&#39;animale in seguito regolarmente l&#39;operazione. Mantenere l&#39;animale in appropriate condizioni ambientali, inclusi gli alloggi con biancheria da letto morbido e supplementazione con cibi morbidi, per ridurre al minimo lo stress. Determinare le procedure e le condizioni future post-operatorie secondo i protocolli istituzionali IACUC. </li><li> Utilizzare i protocolli istituzionali IACUC per sterilizzare strumentis prima dell&#39;uso sul prossimo animale. Lasciare per tempo di raffreddamento adeguato tra l&#39;uso dello strumento. </li></ol> 6. Procedure postoperatorie e Cochlear Tissue raccolta <ol><li> Come descritto al punto 2.5, eseguire test fisiologico di udito dopo l&#39;intervento nei punti desiderati e prima del sacrificio. Eseguire le procedure postoperatorie secondo scopi sperimentali. Sacrifica l&#39;animale in qualsiasi giorno postoperatorio desiderato. </li><li> Su pieno anestesia mediante iniezione IP, come richiesto per i protocolli istituzionali IACUC, sacrifica l&#39;animale. Utilizzando forbici affilate, decapitare animale appena caudalmente all&#39;occipite. Aprire notevolmente la volta cranica con le forbici lungo la dorsale e linea mediana ventrale e diffondere ampiamente. Scavare delicatamente tessuto cerebrale per esporre le ossa temporali. Nota: Un certo numero di procedure per la ricerca di cambiamenti post-esposizione nella coclea può ramificarsi da questo punto e verrà menzionato nella sezione di discussione. Determinare il metodo di indagine più relevant agli scopi sperimentali. Se microscopia elettronica è prevista dopo la coclea sono sezionato, utilizzare cateterizzazione cardiaca per pre-fissare il tessuto. Questo va oltre lo scopo di questa discussione ed è stato coperto in modo approfondito altrove. 13 </li><li> Tagliare le ossa temporali fuori della base del cranio con le forbici e subito messo in soluzione fissativa. Immergere le ossa direttamente in paraformaldeide al 4% per 1,5 ore a temperatura ambiente. Monitorare il tempo di fissazione, come la maggior durata può limitare l&#39;esito di analisi istologica a passi successivi. Decalcificare sezionato ossa per un periodo di tempo variabile tramite immersione in uno acido etilendiamminotetracetico mm (EDTA). </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+changes+for+antioxidants+pathways+in+the+mouse+cochlea:+relations+to+age-related+hearing+deficits.">Gene expression changes for antioxidants pathways in the mouse cochlea: relations to age-related hearing deficits.</a> PloS one. 9, e90279 (2014).</li><li>Lang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox2+up-regulation+and+glial+cell+proliferation+following+degeneration+of+spiral+ganglion+neurons+in+the+adult+mouse+inner+ear.">Sox2 up-regulation and glial cell proliferation following degeneration of spiral ganglion neurons in the adult mouse inner ear.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology : JARO. 12, 151-171 (2011).</li></ol>

Nessuna competizione interessi finanziari. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I risultati di protocollo e di rappresentanza di cui sopra sono stati ottenuti in un modello CBA / caj topo tra cui entrambi i sessi. Questo ceppo inbred è ben definito come standard &quot;buon udito&quot; e il modello &quot;normale invecchiamento&quot; nel sentire ricerca. 16-23 Descrizione di uso di questo protocollo in altri modelli di mammiferi va oltre lo scopo di questo testo. Il lettore dovrebbe notare, tuttavia, che la tecnica di applicazione RWN offre diversi vantaggi per studiare l&#39;orecchio interno mammiferi. Di questi, il più notevole è che evita interruzioni diretta della struttura anatomica delicata e gradienti biochimici che esistono all&#39;interno delle mura della capsula otica. Procedure come cocleostomia e l&#39;impianto di pompe di infusione hanno la propensione a violare direttamente strutture dell&#39;orecchio interno che portano a cambiamenti di soglia permanenti; un fatto che deve essere preso in considerazione quando si analizzano i risultati. Turbativa di strutture murarie laterali cocleari da metho invasivads può anche limitare l&#39;uso di agenti ototossici quali furosemide o eptanolo, la cui specifica zona di effetto è limitata a quella posizione. 15,24 alternativi approcci non invasivi come l&#39;iniezione trans-timpanica e iniezione parenterale sono stata colpita da risultati inaffidabili e / o tossicità sistemica al modello animale. Questo metodo di applicazione ha dimostrato di evitare sia di queste carenze, raggiungere un livello di consistenza si avvicina a quella dei metodi più invasivi discussi sopra. Altri vantaggi di questa tecnica sono è la sua ampia applicabilità ad una serie di modelli animali e della fattibilità di incorporare in un&#39;infrastruttura di laboratorio esistente. Per quanto riguarda quest&#39;ultimo, senza reagenti specializzati o prodotti chimici sono tenuti a parte le scelte ototossiche agenti, anestetici e analgesici. Agenti ototossici sono tipicamente utilizzati ad una concentrazione fissa e mescolati in un grande volume sufficiente di soluzione di (5 ml) per durare lunghi periodi di tempo in considerazioneing ogni applicazione utilizza circa 10 ml (nei topi). Così, dopo l&#39;acquisto iniziale di forniture e di strumenti, gli investigatori sono relativamente liberi da tempo di preparazione soluzione o frequente sostituzione dei materiali. Questa tecnica offre anche riduzioni di tempo operatorio, che possono essere significativi rispetto alle procedure che coinvolgono l&#39;impianto di pompe di infusione perilinfatici o cochleostomies. Dopo aver raggiunto un livello di competenza tecnica, il nostro tempo medio di completamento dall&#39;incisione iniziale alla chiusura era tipicamente 20 min a 1,5 ore a seconda della lunghezza di esposizione desiderata per l&#39;agente ototossici. Tre o quattro interventi chirurgici possono essere espletate con facilità in un solo giorno, consentendo una maggiore efficienza e una maggiore possibilità di ottenere risultati di successo. Come descritto sopra, questa tecnica può essere facilmente applicata ad una varietà di modelli di roditori cui topi, ratti, cavie e gerbilli. Limitazioni di questo metodo sono centrati sullamoderatamente ripido curva di apprendimento necessaria per dominarlo e diminuito risultati attesi fino a raggiungere competenza tecnica. Come verrà discusso più dettagliatamente in seguito, piccoli errori durante l&#39;approccio chirurgico o visualizzazione insufficiente del campo chirurgico saranno quasi invariabilmente portare ad un risultato povero. Risultati sottili che un novizio può riuscire a riconoscere, come un sub-millimetro di spessore bolle d&#39;aria bloccando l&#39;accesso dell&#39;agente alla membrana della finestra rotonda o liquido interstiziale diluire l&#39;agente, prendere tempo per apprezzare e sviluppare le competenze psicomotorie necessarie per correggerli. Tuttavia, con la prestazione ripetuta la procedura di questi ostacoli sono facilmente superabili e costituiscono una sfida tecnica meno scoraggiante per gli investigatori che alcuni dei metodi invasivi di cui sopra. Infine, questa tecnica è associata con la limitazione relativa che il pregiudizio cocleare può essere indotta solo in un singolo punto nel tempo durante l&#39;esposizione chirurgica. Questo può essere superato in una certa misura, Riempiendo il RWN con assorbibile spugna di gelatina imbevuto l&#39;agente come è stato descritto da Heydt et al. 10 La spugna di gelatina assorbibile sarà resorb nel tempo, ma può consentire un periodo di esposizione più lungo è ottenibile attraverso l&#39;applicazione di una soluzione acquosa da solo. Affinché un ricercatore di realizzare tutti i vantaggi di questa tecnica ed evitare eventuali insidie, è fondamentale riconoscere i due elementi critici di questa tecnica: 1) mantenere costantemente la visualizzazione dello spazio dell&#39;orecchio medio e RWN; e 2) la capacità di mantenere campo operatorio privo di liquido interstiziale e / o di sangue. Nel realizzare il primo di questi, l&#39;importanza di una testa porta-corretto non può essere troppo enfatizzata. Fissaggio sicuro della testa dell&#39;animale assicura una vista stabile al microscopio; la cui importanza diventa facilmente evidente quando strumentazione sottile cambia drasticamente il posizionamento delle strutture sotto ingrandimento. Un buon htitolare ead che può ruotare attorno all&#39;asse rostrale-caudale dell&#39;animale facilita anche importanti cambiamenti dinamici nella linea del ricercatore del sito. Spesso, pochi millimetri di rotazione intorno a questo asse può significare la differenza tra la visualizzazione del RWN e visualizzazione della sola capsula otica osso. La capacità di cambiare costantemente punto di vista è anche fondamentale per garantire liquido interstiziale viene correttamente rimosso dalle profondità della nicchia e anche che l&#39;agente ototossici è completamente rimosso tra le applicazioni, come discusso nella parte 5. Secondo la nostra esperienza, il sangue, la condensazione, o liquido interstiziale che entra nello spazio dell&#39;orecchio medio ha la capacità di interferire con intero esperimento. Ciò non è sorprendente, come la piccola quantità di agente ototoxic applicata alla finestra rotonda (~ 10 microlitri) può essere facilmente diluito entrando in contatto con anche piccole quantità di liquidi estranei. Per questo motivo, dissezione chirurgica meticolosa, stappatura frammentario della bolla timpanica e attenta corrion dell&#39;arteria stapediale sono equivale a un successo i risultati sperimentali. Se si osservano le fasi critiche di cui sopra ed i risultati attesi non sono ancora raggiunti, la risoluzione dei problemi deve iniziare. Nella nostra esperienza, è spesso utile per effettuare variazioni di prova di due elementi procedurali. Il primo è quello di modificare la frequenza con cui l&#39;agente ototossica viene rifornito nella finestra rotonda. Seconda dell&#39;agente utilizzato, tempo di esposizione totale è compresa tra 30 min e 1 ora, con assorbimento completo e successiva sostituzione dell&#39;agente ogni 10 min. Se esponendo per durate più brevi, aumentando l&#39;esposizione complessiva può consentire all&#39;agente più tempo per diffondere attraverso la membrana della finestra rotonda. Esposizione aggiuntiva e reintegro possono anche aiutare a evitare la diluizione indesiderati dell&#39;agente ototossici di sangue, condensazione, o interstiziale come discusso in precedenza. L&#39;attenzione dovrebbe essere mantenuta quando si utilizza questo approccio, tuttavia, in quanto tende ad aumentare il rischio di accidentalely ferendo l&#39;arteria stapediale e / o l&#39;introduzione di liquido interstiziale al RWN. Questa tecnica è significativo in ciò che offre alle indagini di fisiologia cocleare e fisiopatologia. Questa tecnica minimamente invasiva consente studio dettagliato dei processi biochimici delicati ed è stato equivalente a promuovere la nostra ricerca volta a valutare cocleare potenziale rigenerativo. 12,24 Tale approccio chirurgico e l&#39;esposizione è anche riprodotto attraverso una varietà di altre tecniche propaggine, e risultati positivi con questo metodo sono stati riportati in studi di impianto cocleare cellule staminali. 14 Molto rimane sconosciuto circa la coclea, però, questa tecnica, insieme con il più ampio armamentario a disposizione di ricercatori, sarà di aiuto nel ridurre tale gap di conoscenza.

Gli investigatori hanno utilizzato una vasta gamma di modelli animali per studiare la funzione normale del sistema uditivo e la fisiopatologia della perdita dell&#39;udito. Questi modelli sono anche molto utili per lo svolgimento di studi di intervento contro vari processi patologici e servono come base per le applicazioni traslazionali in soggetti umani. Per la maggior parte della ricerca che coinvolge la coclea ed i suoi percorsi uditivi associati, un certo grado di danno o rottura deve essere introdotto nel sistema. Spesso, il danno è intenzionalmente prova a creare una lesione specifica, consentendo ai ricercatori di studiare l&#39;effetto di tale lesione sulla normale funzione, così come la capacità cocleare di recuperare da esso. Quando si seleziona un particolare modello animale e / o tecnica (s) per introdurre danni, un certo numero di fattori devono essere considerati per ottenere i migliori risultati possibili. Vari modelli animali possono rispondono in modo diverso agli interventi, mentre gli effetti diretti e indiretti di una tecnica può essereinteramente deleterio per il risultato desiderato. Nella maggior parte dei casi, il protocollo danni orecchio interno ideale sarebbe evitare tossicità sistemica, rapidamente e produrre in modo affidabile danni, creare una lesione precisa e costante, ed essere sopravvivere per consentire un ulteriore studio delle variazioni funzionali, cellulari e molecolari. Idealmente, questi metodi potrebbero anche preservare i delicati microarchitettura e elettrochimici pendenze della coclea, per quanto possibile. Fino ad oggi, i ricercatori sono riusciti a stabilire una serie di tecniche per indurre lesioni dell&#39;orecchio interno. La maggior parte di queste comportano esporre la coclea di un agente ototossica sia sistemica o attraverso approccio chirurgico. Le tecniche includono iniezione parenterale, iniezione intra-peritoneale, iniezione trans-timpanica, iniezione sacco endolinfatico, e cocleostomia con perfusione perilinfatico. Queste tecniche sono state usate per introdurre una varietà di agenti ototossici quali furosemide, gentamicina, ouabain e eptanolo. 1-5Mentre successo a creare lesioni cocleari specifiche, le tecniche sopra anche hanno riconosciuto limitazioni. Iniezioni sistemici possono essere altamente tossici per l&#39;animale e possono essere associati con insulti cocleari non intenzionali e risultati inconsistenti. Quest&#39;ultima lacuna è stata anche associata con iniezioni di trans-timpanica. Tecniche come cocleostomia e perfusione perilinfatica, mentre in grado di indurre lesioni rapide e altamente affidabili, sono direttamente invasivo per struttura dell&#39;orecchio interno e la funzione. Molti degli approcci chirurgici sono anche associati con un alto grado di difficoltà tecnica e possono richiedere lasciando oggetti estranei nella animale, come un infusore micropompa. 2-4,6-8 Nessuna singola tecnica è libera di difetti, e gli investigatori devono scegliere metodi accuratamente per soddisfare le loro esigenze sperimentali. Qui, descriviamo in dettaglio, la finestra di nicchia rotonda (RWN) tecnica di applicazione per la consegna topica di agenti ototossici in topi adulti. Fiprima descritto da Husmann et al nel 1998 studiando effetto di gentamicina sulla sensoriale degenerazione cellulare capelli in un modello aviario, questa tecnica è stata trovata per essere in grado di produrre lesioni significativamente più affidabili rispetto all&#39;applicazione gentamicina sistemica, evitando tossicità. 9 Da allora, numero di altri ricercatori, tra cui il nostro laboratorio, hanno utilizzato questa tecnica per un grande successo. Nel 2004, Heydt et al. adattato ad un modello di topo e descritta una maggiore capacità di controllare le dimensioni della lesione riempiendo il RWN con assorbibile spugna di gelatina imbevuto in concentrazioni variabili di gentamicina. 10 Palmgren et al., nel 2010, hanno studiato gli effetti ototossici di beta-bungarotossina, un potente elemento nel veleno dei taiwanesi banded cassa, mediante l&#39;applicazione di una forma acquosa al RWN di ratti adulti. 11 Inoltre, un certo numero di studi precedenti ottenuti nel nostro laboratorio hanno utilizzato l&#39;approccio finestra rotonda per studiare gli effetti ototossici di furosemidee, ouabain, e eptanolo. 5,6,12-15 I risultati di questi studi hanno dimostrato l&#39;importanza di fluido cocleare e l&#39;omeostasi di ioni in un udito normale, scoperta cellula capacità proliferativa nel ganglio spirale e parete laterale cocleare, e favorito la nostra comprensione di età-correlate perdita di udito. L&#39;approccio seguito consiste chirurgicamente accesso dell&#39;orecchio medio tramite un&#39;incisione retroauricolare e a decapitazione parziale del timpanica bulla ossea. Ciò consente un&#39;ottima esposizione del RWN e la membrana a cui un agente ototossico selezionato può essere applicato direttamente. L&#39;agente liquido poi piscine nel cavo a bicchiere del RWN (o lentamente drena da un vettore spugna di gelatina riassorbibile saturi confezionato in RWN) e diffonde attraverso la finestra della membrana intorno nello spazio perilinfatico del vestibolo cocleare. Nessun cocleostomia diretta è fatto in questo approccio. I vantaggi di questa tecnica sono la conservazione di dell&#39;orecchio interno microarchitettura, evitamentodi tossicità sistemica, l&#39;assegno di un controllo orecchio intra-animale, veloce insorgenza dell&#39;effetto, degenerazione selettiva in alcuni tipi di cellule cocleare (ad es., di tipo I spirale neuroni gangliari con esposizione ouabain e tipo cocleare II fibrociti indotte dal trattamento di eptanolo), e / risultati affidabili e riproducibili. Questa tecnica può essere applicata con alcune modifiche tra le altre specie di roditori, tra cui ratti, cavie, e gerbilli. Svantaggi includono una curva di apprendimento ripida tecnica e la relativa limitazione di insulto ototossico che è costretto ad un singolo punto nel tempo.

&#160;
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">1-Heptanol 98%</td>
			<td rowspan="2">Sigma-Aldrich</td>
			<td>H2805&#160;</td>
			<td rowspan="2"><a>PubChem Substance ID 24895536</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaset Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-803-6637&#160;</td>
			<td>Concentrate 100mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Ketamine HCl)</td>
			<td>10ml</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anased Injectable</td>
			<td rowspan="2">Lloyd Laboratories</td>
			<td>NADA# 139-236</td>
			<td rowspan="2">Concentrate 20mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Xylazine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenex Injectable&#160;</td>
			<td rowspan="2">Patterson Veterinary</td>
			<td>07-850-2280&#160;</td>
			<td>Concentrate 0.3mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Buprenorphine HCl)</td>
			<td>5 ampules per box</td>
			<td>Schedule CIII controlled substance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Skin Prep Solution</td>
			<td rowspan="2">Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDS093941;ecomsessionid=1UZWKxhkYkuy9vK2NXBaBA__">MDS093941&#160;</a></td>
			<td rowspan="2">1 Quart screw top bottle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(Povidone-Iodine)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% Sterile Saline</td>
			<td>Variable</td>
			<td>N/A</td>
			<td>For mixing solutions and injections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Table of Equipment, Surgical Instruments, and Specific Techniques</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>32192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled Acoustics Environment Sound Booth</td>
			<td>Industrial Acoustics Company</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Surgical Head Holder</td>
			<td>Custom Made &#8211;&#160;</td>
			<td rowspan="2">Please see Figure 3</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medical University of South Carolina</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75inch</td>
			<td rowspan="3">World Precision Instruments</td>
			<td rowspan="3">555801L</td>
			<td>Maximum spread 20mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90N Dental Belt Driven Hand Drill&#160;</td>
			<td>Emesco</td>
			<td>N/A (Vintage Item)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Handle Size6</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td>MEDC-011990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade&#160;</td>
			<td>Bard-Parker</td>
			<td rowspan="2">SKU: 097-7215</td>
			<td rowspan="2">50 Blades/Box</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Via ACE Surgical Supply Code</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Tip Jewelers Forceps&#160;</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>MIL17304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Curved</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04026;ecomsessionid=ozXzkfIx-tj0MIi8FkGQ0A__">DYND04026&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPDYND04025;ecomsessionid=+43JREOby+Mfz6IIgoSg5A__">DYND04025&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stevens Tenotomy Scissors Straight</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="http://www.medline.com/sku/item/MDPMDG3222111">MDG3222111&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.00</td>
			<td>Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip</td>
			<td>MytaMed</td>
			<td>Item# 6.56.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Kimwipes Delicate Task Wipers&#160;</td>
			<td rowspan="2">Kimtech Science</td>
			<td rowspan="2">CODE 34155&#160;</td>
			<td rowspan="2">White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.</td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td>House Ear Curette, 6&#8221; shaft, light angle</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPMDG0396486">MDG0396486&#160;</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100</td>
			<td>Medline</td>
			<td><a href="https://www.medline.com/sku/item/MDPIIS34201">IIS34201&#160;</a></td>
			<td>Substitutions may be made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton pellets #3 4mm</td>
			<td>Richmond</td>
			<td>Manufacturer Code 100108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ElectroSurgical Unit 100 E M/M</td>
			<td>Elmed</td>
			<td>List No. 52-5770</td>
			<td>Bipolar and Monopolar Capable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5&#8221; length needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>Product Number: 329410</td>
			<td>Optional for delivery of Ototoxic agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23G, blunt tip, 1&#8221; length needle</td>
			<td>Kendall</td>
			<td>Product Code 8881202397</td>
			<td>For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Mask</td>
			<td>U-line</td>
			<td>S-10478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exam Grade Nitrile Surgical Gloves</td>
			<td>U-line</td>
			<td><a href="http://www.uline.com/Product/Detail/S-12549/Nitrile-Gloves/Nitrile-Exam-Gloves-Powder-Free">S-12549</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Hair Clippers</td>
			<td>Wahl</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Multiple models may be substituted</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1&#160;13mm 3/8 circle needle</td>
			<td>Ethilon</td>
			<td>1855G</td>
			<td>Substitutions may be made.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Instant Sealing Sterilization Pouch</td>
			<td rowspan="2">Fisher</td>
			<td rowspan="2">01-812054</td>
			<td rowspan="2"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Dry Sterilizer</td>
			<td rowspan="3">ROBOZ</td>
			<td rowspan="3">Germinator TM 500</td>
			<td rowspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
		<tr>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the mouse round-window approach for ototoxic agent delivery: a rapid and reliable technique for inducing cochlear cell degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

In un recente studio di Stevens et al utilizzando il protocollo di cui sopra, per adulti topi CBA / caj di entrambi i sessi sono stati esposti attraverso la finestra diffusione turno contro eptanolo. 15 eptanolo un gap giunzione non-accoppiatore noto per la produzione mirata, lesioni recuperabili per le cellule del parete laterale cocleare. Lo scopo dello studio è stato quello di produrre un modello affidabile per danno cocleare mirata, consentendo di investigazione di rigenerazione post-chirurgica di eventuali elementi danneggiati. Soglie uditive pre-chirurgica e post-chirurgiche servito come endpoint funzionale. Microscopia e tecniche di colorazione immunoistochimica sono stati usati per studiare i cambiamenti morfologici. Aumenti significativi soglie ABR sono stati osservati nei topi trattati con eptanolo (Figura 9). Gli animali di controllo trattati con chirurgia simulata, con la consegna di soluzione salina invece di eptanolo, non hanno dimostrato significative variazioni di soglia a qualsiasi frequenza testate. Immunostaining contro un interiormente rettificazionecanale del potassio (Kir) 4.1 servito come un metodo indiretto per la visualizzazione di danni / recupero di strutture cocleari. Ciò ha dimostrato differenze altamente riproducibili tra trattamento e di controllo orecchie. Intensità complessiva colorazione era marcatamente ridotta nel vascularis stria (STV) e tra fibrociti del legamento spirale (SLF) 1-3 giorni dopo l&#39;esposizione eptanolo, che denota una grande quantità di danni diretti a tali aree. C&#39;era un particolare diminuzione dell&#39;intensità Kir 4.1 colorazione nelle aree di tipo II e tipo IV RIFOS (Figura 10) e STV (Figura 11). La prova di integrità nucleare perturbato e cromosomico condensazione / vesciche tipici di apoptosi cellulare è stato anche visto in controcolorazioni nucleari in queste aree cocleari (Figura 10). Vacuolate zone di Kir 4.1 macchiatura risolti nettamente a 7 giorni e erano assenti del tutto a 14 giorni. Quando Kir 4.1 intensità di colorazione è stata quantificata nelle aree di STV, orecchie trattati hanno dimostrato un initial trogolo seguito da uno spostamento significativo (p &lt;0.05) verso intensità controllo 7 giorni dopo l&#39;esposizione eptanolo (Figura 12). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig1.jpg" /> Figura 1. Strumento impostato. Rappresentazione della pre-chirurgica set-up di strumentazione. Tutte le attrezzature devono essere facilmente accessibile all&#39;interno del campo chirurgico sterile. Strumentazione tipica comprende 2 forbici affilate dissezione, 2-3 dritto e / o pinze curvo punta del gioielliere con Curettes auricolari, manico curvo scelte otologici (poi sostituito con Rosen prende - non mostrato), e un gruppo elettro-bisturi con una pinza sottile curvo punta del gioielliere copricapo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt = &quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 53131 / 53131fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Materiali di consumo chirurgici. Ulteriori forniture per mantenere l&#39;ambiente RWN. Ritagli labwipe sterilizzati per la formazione della carta stoppino (a sinistra), la carta strettamente formata Wicks realizzati con salviette sterilizzati laboratorio (centro), e 4 palline mm cotone (a destra) sono utilizzati per pulire il liquido in eccesso e le inondazioni di sangue nella finestra nicchia rotonda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig3.jpg" /> Figura 3. supporto della testina di animale. Immagine raffigurante il titolare testa e blocca-morso. I fori nel blocco in forma e fissare i incisivi centrali superiori. Un morsetto è leggermente stretto sopra il muso dorsale per fissare l&#39;animale in luogo. L&#39;utilizzo di un supporto testa è fondamentale per il successo outc chirurgicoome. Idealmente, questo dovrebbe essere in grado di ruotare intorno all&#39;asse rostrale-caudale dell&#39;animale per ottimizzare viste chirurgiche della bulla durante la procedura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig4.jpg" /> Figura 4. Cleidomastoideus m.. Grafico Schema raffigurante l&#39;anatomia di base del roditore muscolatura cervicale e la sua associazione con la vena giugulare esterna. Il muscolo cleidomastoideus è il muscolo più facilmente identificato durante l&#39;approccio chirurgico. Rilascio della fascia avvolgente seguito da retrazione posteriore / dorsale del corpo muscolo dirigerà dissezione chirurgica verso la bolla timpanica (cerchio nero). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere al</a>Versione Arger di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig5.jpg" /> Figura 5. area di esposizione chirurgica. Rappresenta l&#39;esposizione dopo la dissezione attraverso gli strati di grassi cutanei e sottocutanei. Punti di riferimento strutturale di nota sono un ramo del nervo craniale XI sovrastante il muscolo cleidomastoideus (A), la vena giugulare esterna (B), e il tessuto parotide esposta (C). Il ramo del nervo cranico XI è spesso associata a una piccola nave e deve essere diviso prima di procedere. Destra a sinistra sull&#39;immagine corrisponde all&#39;asse rostrale-caudale dell&#39;animale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig6.jpg" /> Figura 6. Esporre la bulla. L&#39;esposizione della bolla timpanica, dopo un ritorno della cleidomastoideus e strutture circostanti. Punti di riferimento importanti sono il corpo cleidomastoideus muscolare (A) riflette posteriormente / dorsale, il nervo facciale (B), e la cupola lucida del periostio bolla timpanica (C). Inoltre, nota l&#39;inserzione del muscolo sternomastoideus all&#39;aspetto caudale sinistro della bolla timpanica (asterisco). La presenza del nervo facciale alla parte dorsale e rostrale della bolla è un punto di riferimento fondamentale per una vera identificazione del bulla. Destra a sinistra sull&#39;immagine corrisponde all&#39;asse rostrale-caudale dell&#39;animale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig6large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig7.jpg" /> Figura 7. Esposizione finestra rotonda nicchia io. Immagine raffigurante il tympanic bulla completamente esposto dopo la dissezione del periostio sovrastante. Il foro pilota è nella posizione migliore a metà strada tra il bordo caudale della cupola bulla e una linea sottile opaca visualizzato all&#39;interno l&#39;aspetto rostrale della bolla (che rappresenta la membrana timpanica). Un secondo foro pilota adiacente può facilitare facile non-copertura dell&#39;osso bulla. Evitare di foratura profonda dovrebbe essere presa in modo da non danneggiare l&#39;arteria stapediale sottostante. L&#39;oggetto metallico scuro in fondo l&#39;immagine è l&#39;arrotolatore tessuto molle in titanio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig8.jpg" /> Figura 8. Esposizione finestra rotonda nicchia II. Uncapped bolla timpanica con l&#39;esposizione della finestra nicchia circolare (freccia) e l&#39;arteria stapediale (rosso struttura1-2 mm lateralmente alla nicchia) come visto sotto ingrandimento 20x. La nicchia spesso pone in una posizione nascosta sotto l&#39;angolo acuto formato dalla cupola bulla con capsula otica all&#39;aspetto caudale della cupola. È indispensabile che la visualizzazione completa della nicchia avvenire prima dell&#39;applicazione dell&#39;agente ototossici o traspirazione. Rimozione di osso eccessivo durante stappatura dovrebbe anche essere evitata come liquido interstiziale / sangue tendeva ad inondare la cavità in cui sono state create grandi fori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig9.jpg" /> Figura 9. Risultati rappresentativi -. Eptanolo perdita dell&#39;udito indotta e recupero medio di risposta uditivi del tronco encefalico (ABR) soglie (dB SPL) riportati in funzione del tono pipfrequenza. Le misure sono raggruppati in base alla pre-esposizione (nero-Control) e il giorno post-operatorio (POD) 1, 7, e 14 (rosso). Barre di errore rappresentano SEM. Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al. 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig9large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig10.jpg" /> Figura 10. Risultati rappresentativi - mirati danno cocleare dopo parte l&#39;esposizione eptanolo I. Variazioni di potassio raddrizzatore interno (Kir) Canale 4.1 colorazione all&#39;interno vascularis stria (STV) delle orecchie trattati con eptanolo e controllare le orecchie. (A) Normale Kir 4.1 colorazione tipica delle orecchie di controllo con forte affinità cella striale per Kir 4.1 (verde). (B) Il trattamento orecchio su Pod1. Ampie zone di vacuolized decrfacilitato Kir 4.1 affinità sono visti all&#39;interno della STV (frecce) con un calo complessivo di STV Kir 4.1 intensità della colorazione. I nuclei sono di contrasto con propidio iodio (rosso) (B). Barra di scala = 15 micron. Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig10large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 11" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig11.jpg" /> Figura 11. Rappresentante Risultati - mirati danno cocleare dopo l&#39;esposizione eptanolo parte II Le variazioni del legamento spirale (SL) di eptanolo orecchio trattato rispetto al controllo orecchio.. (A) Normal Kir 4.1 colorazione (verde) nel SL tipica di orecchio di controllo con normale Tipo II appaiono fibrociti legamento spirale (II). (B) eptanolo torecchio reated con marcata diminuzione Kir intensità 4.1 della colorazione nella zona di tipo II fibrociti legamento spirale, interruzione nucleare e cromosomica condensazione / vesciche coerenti con l&#39;apoptosi (Arrows). I nuclei sono di contrasto con propidio iodio (rosso). Barra di scala = 15 micron. Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al, 2014 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig11large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/53131/53131fig12.jpg" /> Figura 12. Rappresentante Risultati -. Il recupero di intensità di colorazione cocleare in seguito all&#39;esposizione eptanolo significano luminanza relativa di Kir 4.1 colorazione grafico in funzione del giorno post-esposizione. Luminanza relativa è calcolata come Kir 4.1 intensità riflettente sotto microscopio confocale a eptanolo sorpresaorecchie Ed presi come percentuale della stessa nelle orecchie controllo. Nota POD14-28 dati vengono raggruppati come un singolo punto sulla curva. Cerchi pieni rappresentano valori medi, mentre le barre di errore rappresentano l&#39;errore standard della media. Un significativo recupero di luminanza relativa è stata dimostrata tra il POD 7 e le date successive (del test t di Student p &lt;0.05, asterisco). Figura è stato nuovamente tracciata da Stevens et al., 2014. 15 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53131/53131fig12large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.0K Views.  Medical University of South Carolina. Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible. 

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The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

The Social Trier Protocollo di prova dello stress per indurre stress psicologico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Ricerca

Medicina

The &alpha;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time and temperature restrictions, technical sophistication, and cost of reagents, in particular monoclonal antibodies to measure CD4 on blood cells, the only currently acceptable method. A commonly used cost-saving and time-saving laboratory strategy is to calculate, rather than measure certain blood values. For example, LDL levels are calculated using the measured levels of total cholesterol, HDL, and triglycerides1. Thus, identification of cell-free correlates that directly regulate the number of CD4+ T cells could provide an accurate method for calculating CD4 counts due to the physiological relevance of the correlates.
The number of stem cells that enter blood and are destined to become circulating CD4+ T cells is determined by the chemokine CXCL12 and its receptor CXCR4 due to their influence on locomotion2. The process of stem cell locomotion into blood is additionally regulated by cell surface human leukocyte elastase (HLECS) and the HLECS-reactive active &alpha;1proteinase inhibitor (&alpha;1PI, &alpha;1antitrypsin, SerpinA1)3. In HIV-1 disease, &alpha;1PI is inactivated due to disease processes 4. In the early asymptomatic categories of HIV-1 disease, active &alpha;1PI was found to be below normal in 100% of untreated HIV-1 patients (median=12 &mu;M, and to achieve normal levels during the symptomatic categories4, 5. This pattern has been attributed to immune inactivation, not to insufficient synthesis, proteolytic inactivation, or oxygenation. We observed that in HIV-1 subjects with &gt;220 CD4 cells/&mu;l, CD4 counts were correlated with serum levels of active &alpha;1PI (r2=0.93, p&lt;0.0001, n=26) and inactive &alpha;1PI (r2=0.91, p&lt;0.0001, n=26) 5. Administration of &alpha;1PI to HIV-1 infected and uninfected subjects resulted in dramatic increases in CD4 counts suggesting &alpha;1PI participates in regulating the number of CD4+ T cells in blood 3.
With stimulation, whole saliva contains sufficient serous exudate (plasma containing proteinaceous material that passes through blood vessel walls into saliva) to allow measurement of active &alpha;1PI and the correlation of this measurement is evidence that it is an accurate method for calculating CD4 counts. Briefly, sialogogues such as chewing gum or citric acid stimulate the exudation of serum into whole mouth saliva. After stimulating serum exudation, the activity of serum &alpha;1PI in saliva is measured by its capacity to inhibit elastase activity. Porcine pancreatic elastase (PPE) is a readily available inexpensive source of elastase. PPE binds to &alpha;1PI forming a one-to-one complex that prevents PPE from cleaving its specific substrates, one of which is the colorimetric peptide, succinyl-L-Ala-L-Ala-L-Ala-p-nitroanilide (SA3NA). Incubating saliva with a saturating concentration of PPE for 10 min at room temperature allows the binding of PPE to all the active &alpha;1PI in saliva. The resulting inhibition of PPE by active &alpha;1PI can be measured by adding the PPE substrate SA3NA. (Figure 1). Although CD4 counts are measured in terms of blood volume (CD4 cells/&mu;l), the concentration of &alpha;1PI in saliva is related to the concentration of serum in saliva, not to volume of saliva since volume can vary considerably during the day and person to person6. However, virtually all the protein in saliva is due to serum content, and the protein content of saliva is measurable7. Thus, active &alpha;1PI in saliva is calculated as a ratio to saliva protein content and is termed the &alpha;1PI Index. Results presented herein demonstrate that the &alpha;1PI Index provides an accurate and precise physiologic method for calculating CD4 counts.

The &amp;#945;-test: Rapid Cell-free CD4 Enumeration Using Whole Saliva

A CD4 enumeration method, the &#x03B1;-test, is described which uses whole saliva to provide rapid and accurate CD4 counts. The &alpha;-test costs pennies and eliminates the need for technical training, costly reagents such as monoclonal antibodies, instrumentation, refrigeration, transport of samples, as well as collection and handling of blood.

La α-test: Rapid cell-free CD4 Enumeration Uso Saliva Whole

There is an urgent need for affordable CD4 enumeration to monitor HIV disease. CD4 enumeration is out of reach in resource-limited regions due to the time ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caratterizzazione di cellule staminali adulte Engineered per consegna di fattori terapeutici per le strategie neuroprotettive

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

A Surgical Procedure for Resecting the Mouse Rib: A Model for Large-Scale Long Bone Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation of the animal for surgery, opening the thoracic body wall, exposing the desired rib from the surrounding intercostal muscles, excising the desired section of rib without inducing a pneumothorax, and closing the incisions. Compared to the bones of the appendicular skeleton, the ribs are highly accessible. In addition, no internal or external fixator is necessary since the adjacent ribs provide a natural fixation. The surgery uses commercially available supplies, is straightforward to learn, and well-tolerated by the animal. The procedure can be carried out with or without removing the surrounding periosteum, and therefore the contribution of the periosteum to repair can be assessed. Results indicate that if the periosteum is retained, robust repair occurs in 1 - 2 months. We expect that use of this protocol will stimulate research into rib repair and that the findings will facilitate the development of new ways to stimulate bone repair in other locations around the body.

The overall goal of this procedure is to successfully resect a portion of bone from the rib of a mouse. The procedure was developed as a model to study large-scale long bone repair.

Una procedura chirurgica per la resezione Rib Mouse: Un modello per le grandi ossa lunghe Repair

This protocol introduces researchers to a new model for large-scale bone repair utilizing the mouse rib. The procedure details the following: preparation ...

Busulfan as a Myelosuppressive Agent for Generating Stable High-level Bone Marrow Chimerism in Mice

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct biomarker isolated from donor mice. This technique allows for identification of donor-derived hematopoietic cells within the recipient mice, and can be used to isolate and characterize donor cells using various biochemical techniques. BMT typically relies on myeloablative conditioning with total body irradiation to generate niche space within the BM compartment of recipient mice for donor cell engraftment. The protocol we describe here uses myelosuppressive conditioning with the chemotherapeutic agent busulfan. Unlike irradiation, which requires the use of specialized facilities, busulfan conditioning is performed using intraperitoneal injections of 20 mg/kg busulfan until a total dose of 60-100 mg/kg has been administered. Moreover, myeloablative irradiation can have toxic side effects and requires successful engraftment of donor cells for survival of recipient mice. In contrast, busulfan conditioning using these doses is generally well tolerated and mice survive without donor cell support. Donor BM cells are isolated from the femurs and tibiae of mice ubiquitously expressing green fluorescent protein (GFP), and injected into the lateral tail vein of conditioned recipient mice. BM chimerism is estimated by quantifying the number of GFP+ cells within the peripheral blood following BMT. Levels of chimerism&nbsp;>80% are typically observed in the peripheral blood 3-4 weeks post-transplant and remain established for at least 1 year. As with irradiation, conditioning with busulfan and BMT allows for the accumulation of donor BM-derived cells within the central nervous system (CNS), particularly in mouse models of neurodegeneration. This busulfan-mediated CNS accumulation may be more physiological than total body irradiation, as the busulfan treatment is less toxic and CNS inflammation appears to be less extensive. We hypothesize that these cells can be genetically engineered to deliver therapeutics to the CNS.

We describe a protocol whereby busulfan conditioning permits the bone marrow of a recipient mouse to be replaced with bone marrow cells from donor mice ubiquitously expressing green fluorescent protein, in the absence of irradiation. This technique is useful to study bone marrow cell accumulation in the central nervous system.

Busulfan come mielosoppressiva agente per la generazione stabile ad alto livello di midollo osseo chimerismo nei topi

Bone marrow transplantation (BMT) is often used to replace the bone marrow (BM) compartment of recipient mice with BM cells expressing a distinct ...

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent re-oxygenation of the tissues (reperfusion). In the skin, ischemia-reperfusion (IR) is the main contributing factor to the pathophysiology of pressure ulcers. While the cascade of events leading up to the inflammatory response has been well studied, the spatial and temporal responses of the different subsets of immune cells to an IR injury are not well understood. Existing models of IR using the clamping technique on the skin flank are highly invasive and unsuitable for studying immune responses to injury, while similar non-invasive magnet clamping studies in the skin flank are less-than-ideal for intravital imaging studies. In this protocol, we describe a robust model of non-invasive IR developed on mouse ear skin, where we aim to visualize in real-time the cellular response of immune cells after reperfusion via multiphoton intravital imaging (MP-IVM).

This protocol describes the induction of an ischemia-reperfusion (IR) model on mouse ear skin using magnet clamping. Using a custom-built intravital imaging model, we study in vivo inflammatory responses post-reperfusion. The rationale behind the development of this technique is to extend the understanding of how leukocytes respond to skin IR injury.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

Posterior Semicircular Canal Approach for Inner Ear Gene Delivery in Neonatal Mouse

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of inner ear gene therapy is to find a delivery method which results in consistent transduction efficiency of targeted cell types while minimizing hearing loss. In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a viable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear. The easy anatomic identification of the posterior semicircular canal, as well as minimal manipulation of the temporal bone required, make this surgical approach an attractive option for inner ear gene delivery.

In this study, we describe the posterior semicircular canal approach as a reliable method for inner ear gene delivery in neonatal mice. We show that gene delivery through the posterior semicircular canal is able to perfuse the entire inner ear.

Approccio del canale semicircolare posteriore per consegna del Gene dell'orecchio interno in Mouse neonatale

Inner ear gene therapy offers great promise as a potential treatment for hearing loss and dizziness. One of the critical determinants of the success of ...

Updated Technique for Reliable, Easy, and Tolerated Transcranial Electrical Stimulation Including Transcranial Direct Current Stimulation

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of brain stimulation presents several potential advantages compared to other techniques, as it is noninvasive, cost-effective, broadly deployable, and well-tolerated provided proper equipment and protocols are administered. Even though tDCS is apparently simple to perform, correct administration of the tDCS session, especially the electrode positioning and preparation, is vital for ensuring reproducibility and tolerability. The electrode positioning and preparation steps are traditionally also the most time consuming and error-prone. To address these challenges, modern tDCS techniques, using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes, reduce complexity and setup time while also ensuring that the electrodes are consistently placed as intended. These modern tDCS methods present advantages for research, clinic, and remote-supervised (at home) settings. This article provides a comprehensive step-by-step guide for administering a tDCS session using fixed-position headgear and pre-assembled sponge electrodes. This guide demonstrates tDCS using commonly applied montages intended for motor cortex and dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) stimulation. As described, selection of the head size and montage-specific headgear automates electrode positioning. Fully assembled pre-saturated snap-electrodes are simply affixed to the set position snap-connectors on the headgear. The modern tDCS method is shown to reduce setup time and reduce errors for both novice and expert operators. The methods outlined in this article can be adapted to different applications of tDCS as well as other forms of transcranial electrical stimulation (tES) such as transcranial alternating current stimulation (tACS) and transcranial random noise stimulation (tRNS). However, since tES is application specific, as appropriate, any methods recipe is customized to accommodate subject, indication, environment, and outcome specific features.

When administering transcranial direct current stimulation (tDCS), reproducible electrode preparation and placement are vital for a tolerated and effective session. The purpose of this article is to demonstrate updated modern setup procedures for the administration of tDCS and related transcranial electrical stimulation techniques, such as transcranial alternating current stimulation (tACS).

Tecnica aggiornata per una stimolazione elettrica transcranica affidabile, facile e tollerata, inclusa la stimolazione a corrente diretta transcranica

Transcranial direct current stimulation (tDCS) is a noninvasive method of neuromodulation using low-intensity direct electrical currents. This method of ...

A Revised Method for Inducing Secondary Lymphedema in the Hindlimb of Mice

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore potential treatment options. This mouse model allows researchers to induce significant lymphedema lasting at least 8 weeks. Lymphedema is induced using a combination of fractioned radiotherapy and surgical ablation of lymphatics. This model requires that the mice get a dose of 10 Gray (Gy) radiation before and after surgery. The surgical part of the model involves ligation of three lymph vessels and extraction of two lymph nodes from the mouse hindlimb. Having access to microsurgical tools and a microscope is essential, due to the small anatomical structures of mice. The advantage of this model is that it results in statistically significant lymphedema, which provides a good basis for evaluating different treatment options. It is also a great and easily available option for microsurgical training. The limitation of this model is that the procedure can be time consuming, especially if not practiced in advance. The model results in objectively quantifiable lymphedema in mice, without causing severe morbidity and has been tested in three separate projects.

This animal model enables researchers to induce statistically significant secondary lymphedema in the hindlimb of mice, lasting at least 8 weeks. The model can be used to study the pathophysiology of lymphedema and to investigate novel treatment options.

Un metodo rivisto per indurre il linfomal secondario nell'Hindlimb dei topi

Animal models are of paramount importance in the research of lymphedema in order to understand the pathophysiology of the disease but also to explore ...