Funding for this research was provided by the US Army Medical Research and Materiel Command (Grant account no. W81XWH-11-1-0700) and the Stem Cell Research Fund. PAB and EMP were recipients of Ames Laboratory Summer Undergraduate Laboratory Internships (SULI).

1. Preparazione del supporto per le piastre con 96 pozzetti <ol><li> Creare una mappa della piastra a 96 pozzetti illustra i diversi substrati e tipi di cellule da esaminare (Figura 1). </li><li> Ottenere le soluzioni madre di diversi substrati [poli-L-lisina, fibronectina, collagene di tipo I, laminina, e Entactina-collagene IV-laminina (ECL)], una piastra a 96 pozzetti pozzetti e preparare una stazione di lavoro in una coltura cellulare sterile Cappuccio. </li><li> Preparare singoli substrati diluendo magazzino sterile tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione finale di 5 mg / ml (questa concentrazione è stata precedentemente determinata sulla base di un test concentrazione-dipendente substrato per la crescita e la proliferazione delle cellule). Mescolare con un vortice prima di versare in un serbatoio sterile. </li><li> Aggiungere 100 ml di soluzione di substrato in ogni pozzetto secondo la mappa 96 pozzetti (Figura 1) (una micropipetta 12 o 8 canali è conveniente per micropipetting in una piastra a 96 pozzetti). Sigillare il coperchio alla piastra a 96 pozzetti utilizzando una striscia di Parafilm e memorizzare una notte a 4 ° C. </li></ol> 2. Cella placcatura e Time-lapse imaging NOTA: Mouse cellule staminali mesenchimali sono state isolate dal midollo osseo di adulti C57BL / 6 topi e mantenuto come una linea di cellule aderenti. MSC sono stati infettati con vettori lentivirali per progettare loro di secernere cervello-derived neurotrophic factor (BDNF; cDNA umani) e gliali cellule fattore neurotrofico derivato (GDNF; cDNA umano) utilizzando di vettori lentivirali codifica BDNF (LV-BDNF; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), e la proteina verde fluorescente (GFP, LV-GFP, CMV-GFP). NOTA: Mezzi di coltura per cellule staminali del mouse mesenchimali (MSC) è modificato medio Dulbecco di Iscove contenente il 10% siero fetale ibridoma qualificato bovina, siero equino del 10%, 2 mM L-glutammina, e 10.000 U / ml di penicillina, 10 mg / streptomicina ml . I cinque diversi tipi di cellule staminali mesenchimali di topo (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC e BDNF / GDNF-GFP-MSC) sono state placcate a circa 30% di confluenza in T75 fiasche di coltura cellulare. <ol><li> Cella placcatura <ol><li> Il giorno seguente, rimuovere le soluzioni del substrato mediante aspirazione e lavare ogni pozzetto con circa 200 ml di PBS sterile, due volte. Aggiungi mezzi di coltura cellulare (200 ml / pozzetto) per ciascun bene dopo la PBS risciacquo finale. Posizionare la piastra a 96 pozzetti in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO 2 per equilibrazione. </li><li> Mentre la piastra a 96 pozzetti è equilibrante in incubatrice, raccogliere le cellule (cellule staminali mesenchimali in palloni T75 dovrebbe essere circa il 70% confluenti al momento della raccolta / placcatura) raccogliendo i mezzi di crescita (di cui i media come condizionata) dal pallone T75 e memorizzazione in un tubo da 15 ml in condizioni sterili (questo mezzi condizionati verrà utilizzato nel passaggio 2.1.4). </li><li> Aggiungere 8 ml di PBS sterile al pallone e mescolare delicatamente e poi pipetta al largo della PBS e aggiungere 1 ml di 0,05% tripsina e 0,01%Soluzione EDTA staccare le cellule dalla superficie del pallone di coltura T75. Monitorare distacco cellulare visualizzando il pallone con un microscopio invertito equipaggiato con ottica a contrasto di fase. </li><li> Quando le cellule sono distaccato, aggiungere immediatamente 8 ml di mezzi condizionati (raccolte nella fase 2.1.2) al pallone. Raccogliere la sospensione cellulare e trasferirli in un 15 ml conica provetta da centrifuga e centrifugare per 4 min a 450 xg per far sedimentare le cellule. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 ml di fresca e riscaldata (37 ° C), mezzi di coltura cellulare. </li><li> Determinare il numero di cellule in sospensione cellulare eseguendo un trypan blue conteggio delle cellule vitali utilizzando un emocitometro. Piastra le cellule ad una densità di circa 300 cellule / pozzetto nei pozzetti, all&#39;interno della piastra a 96 pozzetti. </li><li> Ripetere questi passaggi per ogni popolazione di cellule. </li></ol></li><li> Time-lapse imaging <ol><li> Una volta che tutte le cellule staminali mesenchimali sono stati placcati, luogola piastra a 96 pozzetti in un incubatore per 2 ore per consentire le MSC da allegare al substrato. </li><li> Avviare il sistema HCS e attendere 2 ore per il sistema si riequilibri. Impostare il controller ambientale a 37 ° C e collegare una bombola di gas misto contenente 5% di CO 2 in aria al sistema camera ambientale HCS fornire una fonte di aria costante. </li><li> Rimuovere la piastra a 96 pozzetti dall&#39;incubatore successivo al periodo di equilibrazione 2 hr e posizionare direttamente nella camera di crescita delle cellule del sistema HCS. Lasciare 30 minuti per il raggiungimento dell&#39;equilibrio di compensare qualsiasi dilatazione termica della lastra e quindi avviare il software di acquisizione e analisi delle immagini per configurare le impostazioni della piastra. </li><li> Selezionare l&#39;obiettivo 20X per l&#39;imaging. Selezionare due pozzi per condizione [cioè, GFP-MSC su fibronectina ecc (6 substrati x 5 sottotipi MSC per un totale di 30 condizioni x 2 repliche = 60 pozzi in totale)] per l&#39;impostazione di time-lapse imaging. Scegli due siti per l&#39;imaging conin ciascun pozzetto. </li><li> Scegli le lunghezze d&#39;onda della luce corretti per l&#39;imaging. NOTA: due diverse lunghezze d&#39;onda (contrasto di fase e fluorescenza GFP) sono stati selezionati per l&#39;imaging time-lapse. </li><li> Focus sul fondo e con l&#39;autofocus laser e prendere immagini di prova per più siti e più pozzi di trovare un piano focale ottimizzato. </li><li> Una volta che il fuoco è stato stabilito, iniziare l&#39;acquisizione immagini ogni 5 minuti per 48 ore per tutti i 60 pozzi (120 siti). </li><li> Feed cellule ogni 24 ore rimuovendo la piastra a 96 pozzetti dal sistema HCS. Rimuovere 75 ml di supporti da ciascun pozzetto e aggiungere 100 ml di terreno fresco in ciascun pozzetto (equilibrare questo mezzo fresco a 37 ° C e 5% CO 2). </li><li> Alla fine dell&#39;esperimento time-lapse, rimuovere la piastra a 96 pozzetti dal sistema HCS. In condizioni sterili, raccogliere i campioni dei media condizionati da ogni bene e trasferire questi campioni a un&#39;altra piastra da 96 pozzetti. NOTA: Questi campioni possono essere utilizzati per ulteriori analysè eseguendo ELISA per fattori neurotrofici. </li><li> Preparare la piastra a 96 pozzetti con MSC coltivate per test aggiuntivi come la proliferazione cellulare Ki67 test o ioduro di propidio vivo test colorazione / morti (vedi dettagli sotto). </li><li> Eseguire l&#39;analisi time-lapse imaging per la cella di monitoraggio della migrazione / cella come descritto nella sezione 5. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 proliferazione cellulare e ioduro di propidio Live / Assay Morto <ol><li> Ki67 Cell Proliferation Assay (Immunocytochemistry) <ol><li> Sciacquare le colture cellulari con 0,1 M di fosfato (PO 4) tampone per un minuto due volte. Fissare la coltura con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere la PFA e lavare i pozzetti con PBS per sette minuti tre volte. </li><li> Dopo il risciacquo finale, aggiungere 100 ml di soluzione bloccante (tampone fosfato salino, siero asino normale 5%, albumina sierica bovina 0,4% e 0,2% Triton X-100) a ciascun pozzetto unnd incubare a temperatura ambiente per 1 ora. Preparare l&#39;anticorpo primario, coniglio anti-Ki67, diluendo in soluzione bloccante con un rapporto di lavoro di 1: 200. </li><li> Rimuovere la soluzione bloccante e applicare 100 microlitri della soluzione di anticorpo primario a ciascun pozzetto. Coprire la piastra a 96 pozzetti e incubare i campioni a 4 ° C durante la notte. </li><li> Il giorno seguente, rimuovere la soluzione di anticorpi e risciacquare con PBS per 7 minuti, 3 volte. </li><li> Preparare l&#39;anticorpo secondario, asino anti-coniglio Cy3 nel bloccare soluzione con un rapporto di lavoro di 1: 500. Aggiungere DAPI colorazione nucleare alla soluzione di anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 100. Dopo la rimozione dell&#39;ultimo risciacquo PBS, applicare 100 microlitri della soluzione di anticorpo / DAPI secondario in ciascun pozzetto. Incubare a temperatura ambiente al buio per 90 min. </li><li> Rimuovere l&#39;anticorpo soluzione secondaria / DAPI e sciacquare ogni bene con PBS per 7 minuti, 3 volte. Coprire la piastra a 96 pozzetti e conservare a 4 ° C fino imaging. </li></ol></li><li> Propidium ioduro Live / Assay Morto <ol><li> Misurare la morte cellulare mediante ioduro di propidio (PI) test di esclusione come descritto di seguito. </li><li> Preparare la soluzione di colorazione con ioduro di propidio ad una concentrazione di 1,5 mM in coltura. </li><li> Aggiungere 100 ml di etanolo al 70% ad un pozzetto della MSC per 2 minuti con l&#39;intenzione di uccidere le cellule. Questo pozzo serve come controllo positivo per la macchia PI. La maggior parte del MSC sarà PI-tinto indicando morte cellulare. Rimuovere la soluzione di etanolo. </li><li> Aggiungere 100 pl di soluzione di ioduro di propidio macchia a ciascun pozzetto e incubare per 20 min a 37 ° C in un incubatore CO 2 5%. </li><li> Risciacquare le cellule con tampone fosfato 0,1 M per 1 minuto, 2 volte. Fissare le cellule con 4% PFA in 0.1 M P0 4 buffer per 20 min a temperatura ambiente. Rimuovere la PFA e risciacquare con PBS per tre volte per 7 min. </li><li> Incubare con la soluzione DAPI (1:50) diluito in soluzione bloccante per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare tutti i pozzetti conPBS per 7 minuti, 3 volte. </li><li> Rimuovere la soluzione DAPI e sciacquare ogni bene con PBS per 7 minuti, 3 volte. Coprire la piastra a 96 pozzetti e conservare a 4 ° C fino imaging. </li></ol></li></ol> Analisi 4. Automated Imaging e Multiwavelength Scoring <ol><li> Caricare una piastra a 96 pozzetti (precedentemente trattati per Ki67 immunomarcatura o ioduro di propidio tinto) nel sistema HCS e lasciare la piastra per equilibrare per 20 minuti Aprire il software di acquisizione delle immagini di sistema e l&#39;analisi HCS. </li><li> Scegliere le impostazioni di acquisizione per l&#39;obiettivo 10X con fotocamera binning a 1 e un&#39;impostazione di guadagno pari a 2. Trovare la Z-piano in cui le cellule risiedono utilizzando la funzione Auto Exposure e calcolare l&#39;offset per ogni lunghezza d&#39;onda di interesse. Per questa analisi, catturare immagini per DAPI (W1), Cy3 (W2), e FITC (W3). Scegliere il livello massimo di intensità con cui i pozzetti di controllo negativo mostrano alcun segnale per l&#39;acquisizione delle immagini. Confermare questa impostazione è appropriata per la pospozzi itive. </li><li> Acquisire piatto. Catturare immagini e memorizzarli nella acquisizione delle immagini e il database del software di analisi. </li><li> Una volta che le immagini sono state acquisite, un&#39;immagine aperta acquisizione e l&#39;analisi di software offline e piastra revisione dei dati dalle immagini acquisite in precedenza. </li><li> Selezionare l&#39;analisi punteggio Multi-lunghezza d&#39;onda. Configurare l&#39;intensità minima e massima per ogni lunghezza d&#39;onda. NOTA: rilevazione DAPI dovrebbe segnare la colorazione intorno ad ogni nucleo visibile. Cy3 dovrebbe rilevare le cellule positive con Ki67 immunoreattività (IR) e non dovrebbe rilevare IR nelle controlli negativi. Per Cy3 Ki67 IR, la larghezza minima approssimativa era 7 micron, approssimata larghezza massima è stata di 30 micron, l&#39;intensità sopra lo sfondo locale era 150 livelli di grigio, e l&#39;area minima macchiata era 50 um 2. </li><li> Eseguire l&#39;analisi per tutte le posizioni. Esportare i dati da visualizzare nel foglio di calcolo. </li></ol> Monitoraggio 5. cellulare <ol><li> Apri immagine acquisition e programma di analisi e cliccare su &quot;Review targhetta [DB] ...&quot;, selezionando il piatto di interesse. </li><li> Visualizza i dati come &quot;Time vs Well&quot;. </li><li> Scegli uno dei siti dalla sezione &quot;Siti&quot; cliccando a sinistra sulla selezione desiderata. Selezionare &quot;trasmesso ...&quot; sotto il &quot;lunghezze d&#39;onda:&quot;. Fare clic destro sul target ben nel modello a 96 pozzetti e fare clic su &quot;Carica immagini&quot;. </li><li> Traccia le cellule facendo clic su &quot;Apps&quot; e quindi &quot;Traccia oggetti&quot;. </li><li> Utilizzare &quot;Dynamic Data Exchange (DDE)&quot; per scegliere il formato di esportazione dei dati, ad esempio, Microsoft Excel. </li><li> Scegli i dati di tracciamento delle esportazioni, ad esempio, il tempo trascorso, il numero di oggetti, la distanza, l&#39;intervallo di tempo, velocità, angolo di assoluto, distanza origine, delta x e y delta. </li><li> Tag ogni cella di interesse con &quot;Ctrl + click sinistro&quot; sulle cellule bersaglio. </li><li> Cellule pista. Se necessario, interrompere / modificare tracciamento improprio delle cellule con il tasto &quot;Esc&quot; e quindi regolare le impostazioni. </li><li> Dopo il monitoraggio delle cellule è completa, salvare i dati con &quot;Data Log&quot;. </li></ol>

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Spese di pubblicazione di questo articolo il video sono stati sostenuti da Molecular Devices, LLC.

Le cellule staminali mesenchimali adulte (MSC) sono un tipo di cellula interessante per lo sviluppo di una strategia sperimentale che combina una terapia a base di consegna cellulare e genica. MSC sono multipotenti, in grado di differenziarsi in cellule della linea mesodermal, e mostrano una notevole plasticità, differenziando / transdifferentiating in lignaggi neuronali e gliali con l&#39;induzione appropriata paradigmi 17,18. Inoltre, MSC sono stati trapiantati e dimostrata efficace in studi preclinici per una serie di disturbi, tra cui le condizioni neurodegenerative 19. L&#39;efficacia terapeutica delle cellule staminali mesenchimali è ben noto a causa della loro benefici anti-proliferativi, attività anti-infiammatori e anti-apoptotici 20. MSC sono anche noti per produrre e secernere diversi fattori neurotrofici e di crescita, che probabilmente contribuisce alle qualità neuroprotettivi associati MSC ingenui dopo il trapianto in siti di lesioni o malattie 21. Importantly, MSC possono essere geneticamente modificati per la consegna costante di fattori neurotrofici per applicazioni combinate a base di terapia genica, cellulare e e sono stati utilizzati in un certo numero di modelli animali di lesioni o malattie al sistema nervoso centrale 11,19,22. Nello sviluppo di una strategia basata terapia cellulare e genica combinato, è importante che la salute delle cellule è attentamente valutato prima del loro ampio uso in vitro, e in particolare in applicazioni in vivo. Come prova di concetto, abbiamo studiato diverse popolazioni di linee progettate e controllo MSC per studiare le conseguenze delle modificazioni genetiche per la salute cellulare e fitness utilizzando un approccio di screening ad alto contenuto (HCS). In generale, HCS si riferisce a un&#39;immagine basata su cellulare ad alta velocità di screening 14. Questo approccio di screening permette una valutazione quantitativa dei fenotipi cellulari a più livelli di spazio (cellulari per subcellulare) e temporali (millisecondi per giorni) resoluzione attraverso varie condizioni sperimentali. Utilizzando questo approccio abbiamo accedessimo possibili differenze di substrato preferenza sui seguenti parametri: proliferazione cellulare, espressione della proteina fluorescente verde (GFP), morte cellulare, e la motilità cellulare / migrazione. Gli esperimenti sono stati progettati in 96 pozzetti formato piastra di coltura cellulare. All&#39;interno di un singolo piatto che abitualmente studiato le possibili differenze di substrato legati rispetto a ciascun parametro per le diverse popolazioni di cellule MSC lentivirali-trasdotte e confrontato le MSC ingegnerizzate con l&#39;originale, MSC non trasdotte. Questo ha fornito un mezzo per confrontare direttamente i risultati dei diversi sottotipi MSC con una batteria di test in vitro, come la proliferazione cellulare utilizzando Ki67 immunomarcatura, dal vivo / morto test vitalità cellulare tramite ioduro di propidio colorazione, e il comportamento delle cellule effettuando digital imaging time-lapse . Come estensione di questo HCS si può anche effettuare test ELISA su campioni di media condizionati raccolti da individuo wells per determinare quantitativamente la secrezione di fattori neurotrofici. Supporti condizionata da diversi sottotipi MSC può essere utilizzato anche in biosaggi in vitro per determinare l&#39;attività biologica di fattori secreti 11,23. Questo tipo di piattaforma HCS può essere utilizzato anche per misurazioni in vitro di crescita dei neuriti da colture neuronali primarie e linee cellulari staminali neurali 24. Nel complesso, i nostri risultati dimostrano che le sottopopolazioni delle MSC geneticamente modificati visualizzati comportamenti simili rispetto ai MSC non modificati. L&#39;influenza di diversi substrati di coltura sulla crescita cellulare e la migrazione delle cellule non era notevolmente diversa tra i sottotipi MSC, così come substrati di coltura. Come tale, i substrati della matrice extracellulare testati non sembrano giocare un ruolo critico nel modulare questi aspetti del comportamento delle cellule per queste diverse MSC ingegnerizzati. Questo studio dimostra l&#39;uso di un sistema per l&#39;analisi HCS differenAspetti t del comportamento delle cellule. Tuttavia, non è raro incontrare limitazioni associate analisi dell&#39;immagine. Occasionalmente, analizzando le immagini di fluorescenza, era alquanto difficile determinare il valore di soglia corretto sopra del quale immunolabeled o cellule colorate saranno contati come positivamente etichettata / macchiato. Così, per minimizzare i bias personale, la determinazione dei valori di soglia è dipendente da una rispetto ai controlli (controlli negativi per l&#39;imaging di fluorescenza sono state effettuate in parallelo durante tutte le elaborazioni per l&#39;omissione degli anticorpi primari o secondari). Un altro limite è stato rilevato durante l&#39;analisi della migrazione cellulare utilizzando time-lapse imaging digitale. In alcuni casi, il software di imaging non era in grado di distinguere tra movimento casuale browniano di una cella contro una cella realtà migrazione solo una breve distanza. Ulteriori limitazioni erano evidenti in situazioni in cui il software di analisi non è stato in grado di distinguere la presenza di multipLe cellule in stretta vicinanza l&#39;uno-all&#39;altro. Per superare questa limitazione necessaria selezione manuale delle cellule durante l&#39;analisi piuttosto che un&#39;analisi completamente automatizzato. Densità di placcatura cellulare può anche provocare inclinazione dati di migrazione cellulare tra le popolazioni di cellule che mostrano una maggiore preferenza a crescere in ciuffi contro cellule che crescono in isolamento da ogni altro. Questi tipi di differenze sono in parte probabilmente un riflesso di cellula-substrato rispetto preferenze cellula-cellula. L&#39;utilizzo di un sistema HCS per acquisire immagini e di eseguire l&#39;analisi dei dati fornisce un mezzo efficace e rapido per valutare parametri di cella multiple. Inoltre, i video digitali time-lapse per 30 diverse condizioni (6 substrati e 5 diversi sottotipi MSC) sono stati regolarmente acquisiti per periodi variabili da ore a giorni (48 ore) durante l&#39;uso della camera ambientale. Questi dati sono stati poi utilizzati per calcolare e determinare differenze nei tassi di migrazione delle cellule attraverso varie linee cellulari su diversi ECMmolecole. In questa relazione abbiamo evidenziato la realizzazione di un alto contenuto di piattaforma di screening per valutare la salute e la funzione delle cellule. Questo tipo di analisi è utile per sviluppare strategie razionali per la progettazione di tipi di cellule, così come substrati polimerici per facilitare la crescita cellulare e la rigenerazione neuronale diretto. Questo è un passo essenziale verso l&#39;applicazione della fornitura a base di cellule staminali, di fattori terapeutici prima estesa in studi preclinici in vivo che utilizzano strategie di trapianto di cellule.

Un grosso problema con l&#39;attuazione di terapie per il trattamento di disturbi del sistema nervoso è in sviluppo di metodi efficaci che impediscono un&#39;ulteriore degenerazione e anche a favorire il recupero della funzione. Una strategia innovativa è geneticamente le cellule staminali ingegnere ex vivo, per la produzione di fattori neuroprotettivi, prima della loro trapianto. Questa combinazione di terapia cellulare, accoppiato con un tipo di terapia genica, fornisce un metodo efficace per il trattamento della malattia o morte neuronale indotta da lesioni del sistema nervoso. Fattori neurotrofici sono essenziali per la crescita e la sopravvivenza dei neuroni in via di sviluppo, così come la manutenzione e la plasticità dei neuroni maturi. Numerosi studi hanno dimostrato un ruolo significativo di fattori neurotrofici nel promuovere la crescita iniziale e la differenziazione dei neuroni nel sistema nervoso centrale e periferico (CNS e PNS) e possono anche stimolare la rigenerazione in vitro ed inmodelli Nimal di danno neuronale 1. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) è altamente espresso nel SNC e svolge un ruolo importante nel regolare lo sviluppo neurale, la plasticità sinaptica e riparazione 2. Line-derivato cellule gliali fattore neurotrofico (GDNF) promuove la sopravvivenza di molti tipi di neuroni dopaminergici e compreso motoneuroni 3. Così, una strategia importante per la riparazione neurale è di fornire fonti esogene di fattori neurotrofici alle regioni lese o malate del sistema nervoso. Cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo multipotenti (MSC) tengono un grande potenziale per la consegna di proteine ​​terapeutiche per curare il sistema nervoso danneggiato o malato. Il trapianto di cellule staminali mesenchimali ha attirato notevole attenzione negli sforzi per sviluppare terapie cellulari compatibili paziente dal momento che hanno una serie di vantaggi tra cui, 1) relativa facilità di isolamento e di manutenzione, 2) capacità multipotenziale, 3) piccole preoccupazioni etiche, 4) Capacità di sopravvivere e migrare dopo il trapianto e 5) possibilità di trapianto autologo di 4,5. Risultati promettenti sono stati riportati con l&#39;uso di cellule staminali mesenchimali ingenui e geneticamente in modelli animali per un certo numero di diverse malattie neurodegenerative, tra cui lesioni del midollo spinale 6,7, 8,9 ictus, deficit di mielina 10, e la degenerazione della retina 11-13. Accoppiamento trapianto di cellule con la consegna di fattori neurotrofici da cellule staminali geneticamente modificate è un nuovo e importante strategia di riparazione neurale. Un passo essenziale per lo sviluppo di sistemi di lancio di fattore terapeutico a base di cellule è quello di determinare la normale salute delle cellule ingegnerizzate. Come tale, lo scopo principale di questo studio era quello di valutare i parametri di crescita generali di cellule staminali adulte geneticamente. Un approccio importante per valutare rapidamente i parametri di celle è di impiegare basata sull&#39;immagine cellulari high-through screening (HTS), spesso indicato come alto contenuto di screening (HCS) procedure 14. Questa tecnologia permette l&#39;acquisizione automatica e analisi, e questo approccio è particolarmente adatto per applicazioni di ricerca sulle cellule staminali. In questo progetto abbiamo sviluppato una piattaforma di profiling che consente per la caratterizzazione rapida e l&#39;ottimizzazione delle preferenze substrato cellulare e funzioni cellulari con cellule staminali adulte geneticamente impiegando un sistema HCS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well plates</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655090</td>
			<td>96 well plates selected for use in ImageXpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Ki67 antibody</td>
			<td>Abcam (Cambridge, MA)</td>
			<td>Ab16667</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>C7661</td>
			<td>Collagen from rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Rabbit Cy3</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL(Entactin-Collagen-Laminin)</td>
			<td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td>
			<td>08-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Chemistry Store (Ames, IA)</td>
			<td>12003510</td>
			<td>100%, 200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>CB-40008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#8217;s Modified Dulbeccos Medium (IMDM)</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P285</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>P288</td>
			<td>For PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminine (mouse)</td>
			<td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td>
			<td>3400-010-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MSCs of adult C57BL/6 mice</td>
			<td>Tulane Cent for Gene Therapy (New Orleans, LA)</td>
			<td></td>
			<td>Isolated from bone marrow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genetically modified MSCs (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/GDNF)</td>
			<td>These cells were obtained from our previous study : Ye et. al. (in preparation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum (NDS)</td>
			<td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&#160;</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td>
			<td>O4042</td>
			<td>4% PFA in 0.1M PO4 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium iodide (PI)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>P1304MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05% (EDTA 1X)</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium</td>
			<td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td>
			<td>12440&#8211;046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridoma-qualified FBS</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>Hyclone (Logan, UT)</td>
			<td>SH3007403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>ImageXpress micro</td>
			<td>High content screening system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Molecular devices (Sunnyvale, CA)</td>
			<td>MetaXpress 4.0</td>
			<td>Image acquisition and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high throughput characterization of adult stem cells engineered for delivery of therapeutic factors for neuroprotective strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Parametri di crescita MSC sono stati esaminati coltivando le diverse popolazioni di MSC su substrati diversi. Le cinque diverse popolazioni di sottotipi MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, e BDNF / GDNF-GFP-MSC) sono stati placcati in piastre da 96 pozzetti colture di tessuti pre-rivestiti con il diverso substrati come illustrato in figura 1. Dopo quattro giorni di coltura, le piastre sono state fissate e immunolabeled e / o colorati con i reagenti appropriati e poi esaminati usando il sistema HCS e analisi condotte con l&#39;acquisizione delle immagini e il programma software di analisi. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1:. Template piastra a 96 pozzetti per il disegno sperimentale piastre a 96 pozzetti sono stati rivestiti con vari substrati e pozzi sono stati seminati con cellule staminali ingegnerizzate come mostrato nel modello. Ad esempio, solo wells nelle righe BF sono stati usati in questo esperimento. Righe A, G e H sono stati lasciati vuoti. Abbreviazioni - MSC: cellule staminali mesenchimali; GFP-MSC: MSC-proteina fluorescente verde che esprime; BDNF-GFP-MSC: cervello derivato MSC-factor-GFP che esprimono neurotrofici; GDNF-GFP-MSC; Glial derivato dalle cellule MSC-factor-GFP che esprimono neurotrofici; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF e GDNF--GFP che esprimono MSC; ECL: Entactina-collagene IV-laminina). Anti-Ki67 immunomarcatura, seguito da DAPI di contrasto, è stato utilizzato per valutare se i diversi substrati influenzato la proliferazione delle diverse popolazioni di MSC ingegnerizzate (Figura 2a). Espressione dell&#39;antigene Ki67 avviene preferenzialmente durante fasi tardive G 1, S, G 2 e M del ciclo cellulare, e non viene rilevato in cellule nella fase di riposo (G 0), e quindi è utile come marcatore di proliferazione cellulare 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) è un nu comunemente usatocontrasto chiaro e cromosoma che emette fluorescenza blu su legame con AT regioni del DNA 16. Il numero totale di cellule in un campo può essere determinata contando il numero di nuclei DAPI colorati. Come illustrato nella Figura 2B, anche se c&#39;era variazione delle percentuali di MSC proliferanti, tutti i substrati comunque supportate notevole proliferazione cellulare per ciascuno dei sottotipi MSC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: Ki67 saggio di proliferazione cellulare. (A) Fusa, doppio-fluorescente immagine di Ki67 immunomarcatura (rosso) e DAPI (blu) colorazione nucleare. Molte delle cellule staminali mesenchimali sono state immunolabeled con l&#39;anticorpo Ki67 (rosso). Bar Scala = 50 micron. (B) Grafico a barre che illustra le percentuali di Ki67 immunolabeled sottotipi MSC coltivate su polistirolo (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, collagenetipo I, laminina, o Entactina-collagene IV-laminina (ECL) substrati per 5 giorni in vitro (DIV). N = un esperimento. Ogni barra rappresenta la media dei dati raccolti da 8 siti impressi da 2 pozzi per ogni condizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Propidio ioduro (PI) colorazione è stato usato per valutare se differenti substrati influenzati sopravvivenza cellulare (Figura 3). Propidio ioduro è un contrasto nucleare e cromosoma rosso fluorescenti comunemente utilizzati. Propidio ioduro è membrana impermeant e generalmente esclusi dalla cellule vitali, e quindi è utile per rilevare le cellule morte in una popolazione. La percentuale di cellule morte entro una data condizione può essere determinata quando combinato con un&#39;etichetta nucleare generale come DAPI per identificare tutte le celle all&#39;interno di un campo. La percentuale di cellule PI-positivi era bassa su tutte le superfici esaminati (Figura 3). Come controllo positivo per il reagente PI, alcuni pozzetti contenenti cellule staminali mesenchimali sono stati incubati in 70% di etanolo, una condizione nota per uccidere maggior parte delle cellule, risultante in una elevata percentuale di cellule PI-etichettato come illustrato in Figura 3B e 3C (etanolo trattata positiva controllo). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: ioduro propidio test morte cellulare. (A) Fusa, immagine doppia fluorescente per ioduro di propidio (rosso) e DAPI (blu) colorazione. Sebbene i nuclei di tutte le cellule vitali sono state colorate con DAPI (blu), nessuna colorazione ioduro di propidio è stato rilevato nel MSC. (B) Virtualmente tutti MSC sono state colorate con ioduro di propidio seguito all&#39;esposizione al 70% di etanolo. Bar Scala in A e B = 100 micron. (C) Grafico a barre che illustra le percentuali di ioduro di propidio (PI) macchiato MSC sottotipos coltivate su polistirene (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, collagene di tipo I, laminina, o Entactina-collagene IV-laminina (ECL) substrati per 5 giorni in vitro (DIV). Etanolo Controllo: Questa condizione servito come controllo positivo per il reagente PI colorazione. La maggior parte delle cellule sottoposte a colorazione PI dopo il trattamento etanolo sono morti e quindi colorate positivamente per il reagente PI. N = un esperimento. Ogni barra rappresenta la media dei dati raccolti da 8 siti impressi da 2 pozzi per ogni condizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Per studiare la possibile influenza di diversi substrati sul comportamento di MSC ingegnerizzate, la migrazione delle cellule è stato analizzato usando la microscopia digitale time-lapse e il sistema di trasmissione della luce / ambientale da camera sul sistema HCS (vedi Supplemental Video 1). Più siti / e sono stati time-lapse ripresoe utilizzato per calcolare i tassi di migrazione delle cellule per le diverse sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali che crescono sui diversi substrati utilizzando il programma software di acquisizione e analisi delle immagini. In generale, come mostrato nella Figura 4C, tutti i sottotipi di MSC mostrano il tasso di migrazione più rapida sulle superfici della matrice extracellulare rivestite (fibronectina, collagene, laminina e ECL) e il più lento su superfici non rivestite polistirene. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. Monitoraggio delle cellule e la migrazione MSC monitorati con l&#39;acquisizione delle immagini e software di analisi. Immagini sovrapposto di luce e fluorescenza immagini trasmesse da (A) l&#39;inizio del time-lapse imaging e (B) a 29 ore più tardi al termine della sessione di imaging time-lapse (vedi Supplemental Video 1). Tracce di migrazione cellulare sono indicati dal li coloratanes. Scala bar:. 50 graph micron (C) Bar illustrare i tassi medi di migrazione (espressa in micron / h) per i sottotipi MSC coltivate su polistirene (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, collagene di tipo I, laminina, o Entactina-collagene IV-laminina (ECL) substrati per 2 giorni in vitro (DIV). N = un esperimento. Ogni barra rappresenta la media di almeno 10 celle impressi da 2 pozzi per ogni condizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Presi insieme, questi risultati forniscono la prova preliminare che tali sottopopolazioni di cellule staminali mesenchimali geneticamente visualizzare le proprietà di crescita simili. Questi risultati forniscono prove convincenti che la lentiviral mediata modificazioni genetiche di queste cellule staminali mesenchimali indotte non drammatici effetti deleteri rilevabili sui parametri di crescita indagati utilizzando questa piattaforma di screening. Supplemental Video 1. Time-lapse video digitale di MSC monitoraggio utilizzando il programma software di acquisizione e analisi delle immagini. Il percorso di migrazione è per due MSC [indicati come 1 (linea di tracciamento verde) e 2 (Blu linea di inseguimento)] sono illustrati. Video catturato nel corso di un periodo di 29 ore. Le immagini sono state catturate ogni 5 min. Immagini di fluorescenza di MSC-GFP che esprimono è stato utilizzato per l&#39;imaging time-lapse in preparazione del video. Bar Calibration = 50 micron. Questo tipo di analisi è utile per studiare comportamenti cellulari, compresa la migrazione cellulare e la divisione cellulare.

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High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

High Throughput Caratterizzazione di cellule staminali adulte Engineered per consegna di fattori terapeutici per le strategie neuroprotettive

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

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Medicine

10.7K Views.  Iowa State University. This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Video: High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

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Stem Cell Transplantation Strategies for the Restoration of Cognitive Dysfunction Caused by Cranial Radiotherapy

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation can induce a progressive and debilitating decline in cognition that may, in part, be caused by the depletion of neural stem cells. Given the increased survival of patients diagnosed with brain cancer, quality of life in terms of cognitive health has become an increasing concern, especially in the absence of any satisfactory long-term treatments.
To address this serious health concern we have used stem cell replacement as a strategy to combat radiation-induced cognitive decline. Our model utilizes athymic nude rats subjected to cranial irradiation. The ionizing radiation is delivered as either whole brain or as a highly focused beam to the hippocampus via linear accelerator (LINAC) based stereotaxic radiosurgery. Two days following irradiation, human neural stem cells (hNSCs) were stereotaxically transplanted into the hippocampus. Rats were then assessed for changes in cognition, grafted cell survival and for the expression of differentiation-specific markers 1 and 4-months after irradiation. Our cognitive testing paradigms have demonstrated that animals engrafted with hNSCs exhibit significant improvements in cognitive function. Unbiased stereology reveals significant survival (10-40%) of the engrafted cells at 1 and 4-months after transplantation, dependent on the amount and type of cells grafted. Engrafted cells migrate extensively, differentiate along glial and neuronal lineages, and express a range of immature and mature phenotypic markers.
Our data demonstrate direct cognitive benefits derived from engrafted human stem cells, suggesting that this procedure may one day afford a promising strategy for the long-term functional restoration of cognition in individuals subjected to cranial radiotherapy. To promote the dissemination of the critical procedures necessary to replicate and extend our studies, we have provided written and visual documentation of several key steps in our experimental plan, with an emphasis on stereotaxic radiosurgey and transplantation.

Brain tumor patients routinely undergo cranial radiotherapy, and while beneficial, this treatment often results in debilitating cognitive dysfunction. This serious unresolved problem has at present, no clinical recourse, and has driven our efforts to devise stem cell based therapies for the recovery of radiation-induced cognitive decrements.

Strategie di trapianto di cellule staminali per il Restauro di disfunzione cognitiva causata da radioterapia craniale

Radiotherapy often provides the only clinical recourse for those afflicted with primary or metastatic brain tumors. While beneficial, cranial irradiation ...

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve diagnostic and prognostic testing in a clinical setting and may help guide therapeutic interventions. When large numbers of candidate proteins are identified, it may be difficult to validate candidate biomarkers in a timely and efficient fashion from patient plasma samples that are event-driven, of finite volume and irreplaceable, such as at the onset of acute graft-versus-host disease (GVHD), a potentially life-threatening complication of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT).
Here we describe the process of performing commercially available ELISAs for six validated GVHD proteins: IL-2R&alpha;5, TNFR16, HGF7, IL-88, elafin2, and REG3&alpha;3 (also known as PAP1) in a sequential fashion to minimize freeze-thaw cycles, thawed plasma time and plasma usage. For this procedure we perform the ELISAs in sequential order as determined by sample dilution factor as established in our laboratory using manufacturer ELISA kits and protocols with minor adjustments to facilitate optimal sequential ELISA performance. The resulting plasma biomarker concentrations can then be compiled and analyzed for significant findings within a patient cohort. While these biomarkers are currently for research purposes only, their incorporation into clinical care is currently being investigated in clinical trials.
This technique can be applied to perform ELISAs for multiple proteins/cytokines of interest on the same sample(s) provided the samples do not need to be mixed with other reagents. If ELISA kits do not come with pre-coated plates, 96-well half-well plates or 384-well plates can be used to further minimize use of samples/reagents.

High throughput validation of multiple candidate biomarkers can be performed by sequential ELISA in order to minimize freeze/thaw cycles and use of precious plasma samples. Here, we demonstrate how to sequentially perform ELISAs for six different validated plasma biomarkers1-3 of graft-versus-host disease (GVHD)4 on the same plasma sample.

High Throughput sequenziale ELISA per la convalida dei biomarcatori di acuta Graft-versus-host disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human pulp-derived stem cells (hDPSCs) possess high proliferation potential with multi-lineage differentiation capacity compare to the ordinary source of adult stem cells1-8; therefore, hDPSCs could be the good candidates for autologous transplantation in tissue engineering and regenerative medicine. Along with these benefits, possessing the mesenchymal stem cells (MSC) features, such as immunolodulatory effect, make hDPSCs more valuable, even in the case of allograft transplantation6,9,10. Therefore, the primary step for using this source of stem cells is to select the best protocol for isolating hDPSCs from pulp tissue. In order to achieve this goal, it is crucial to investigate the effect of various isolation conditions on different cellular behaviors, such as their common surface markers &amp; also their differentiation capacity.
Thus, here we separate human pulp tissue from impacted third molar teeth, and then used both existing protocols based on literature, for isolating hDPSCs,11-13 i.e. enzymatic dissociation of pulp tissue (DPSC-ED) or outgrowth from tissue explants (DPSC-OG). In this regards, we tried to facilitate the isolation methods by using dental diamond disk. Then, these cells characterized in terms of stromal-associated Markers (CD73, CD90, CD105 &amp; CD44), hematopoietic/endothelial Markers (CD34, CD45 &amp; CD11b), perivascular marker, like CD146 and also STRO-1. Afterwards, these two protocols were compared based on the differentiation potency into odontoblasts by both quantitative polymerase chain reaction (QPCR) &amp; Alizarin Red Staining. QPCR were used for the assessment of the expression of the mineralization-related genes (alkaline phosphatase; ALP, matrix extracellular phosphoglycoprotein; MEPE &amp; dentin sialophosphoprotein; DSPP).14

The method described isolation and characterization of human Dental Pulp Stem Cells (hDPSCs) by using either enzymatic dissociation of pulp (DPSC-ED) or direct outgrowth of stem cells from pulp tissue explants (DPSC-OG). Then followed by in vitro comparative differentiation of both types of hDPSCs into odontoblasts.

Differenziazione Isolamento, caratterizzazione e comparata delle cellule umane Dental Pulp staminali derivate da denti permanenti mediante due diversi metodi

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Un sistema organotipica High Throughput per la caratterizzazione di droga sensibilità di primaria multicampo cellule del mieloma

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene and cell therapies are highly promising alternative approaches for CVD treatment. However, the broad clinical application of gene therapy is greatly limited by the lack of suitable gene delivery systems. The development of appropriate gene delivery vectors can provide a solution to current challenges in cell therapy. In particular, existing drawbacks, such as limited efficiency and low cell retention in the injured organ, could be overcome by appropriate cell engineering (i.e., genetic) prior to transplantation. The presented protocol describes the efficient and safe transient modification of endothelial cells using a polyethyleneimine superparamagnetic magnetic nanoparticle (PEI/MNP)-based delivery vector. Also, the algorithm and methods for cell characterization are defined. The successful intracellular delivery of microRNA (miR) into human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) has been achieved without affecting cell viability, functionality, or intercellular communication. Moreover, this approach was proven to cause a strong functional effect in introduced exogenous miR. Importantly, the application of this MNP-based vector ensures cell magnetization, with accompanying possibilities of magnetic targeting and non-invasive MRI tracing. This may provide a basis for magnetically guided, genetically engineered cell therapeutics that can be monitored non-invasively with MRI.

Preparation and In Vitro Characterization of Magnetized miR-modified Endothelial Cells

This manuscript describes the efficient, non-viral delivery of miR to endothelial cells by a PEI/MNP vector and their magnetization. Thus, in addition to genetic modification, this approach allows for magnetic cell guidance and MRI detectability. The technique can be used to improve the characteristics of therapeutic cell products.

preparazione e<em&gt; In Vitro</em&gt; Caratterizzazione di magnetizzato miR-modificato cellule endoteliali

To date, the available surgical and pharmacological treatments for cardiovascular diseases (CVD) are limited and often palliative. At the same time, gene ...

Intranasal Delivery of Therapeutic Stem Cells to Glioblastoma in a Mouse Model

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of therapeutic stem cells via the intranasal route is a recently discovered alternative strategy, with strong potential for clinical translation, due to its non-invasive nature compared to intracranial implantation or delivery via systemic routes. The lack of blood brain barrier further strengthens the therapeutic potential of stem cells undergoing intranasal brain entry. This article summarizes the essential techniques utilized in our studies and outlines the basic principles of intranasal strategy for stem cell delivery using a mouse model of intracranial glioma xenografts. We demonstrate the optimized procedures that generate consistent and reproducible results with specific predetermined experimental parameters and offer guidelines for streamlined work flow that ensure efficient execution and reliable experimental outcome. The article is designed to serve as a baseline for further experimental customization based on hypothesis, stem cell types, or tumor specifics.

Stem cells are promising therapeutic carriers to treat brain tumors due to their intrinsic tumor tropism. Non-invasive intranasal stem cell delivery bypasses the blood brain barrier and demonstrates strong potential for clinical translation. This article summarizes the basic principles of intranasal stem cell delivery in a mouse model of glioma.

Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

The intrinsic tropism towards brain malignancies renders stem cells as promising carriers of therapeutic agents against malignant tumors. The delivery of ...