Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Royal Victorian Eye and Ear Research &amp; Ethics Comitato Animal Hospital (RVEEH AEC; # 10-199AB). I soggetti sono stati trattati secondo il National Health e &quot;Codice di condotta australiano per la cura e l&#39;uso di animali a scopi scientifici&quot; del Medical Research Council (2013) e la &quot;Prevenzione della Crudeltà verso gli Animali Act&quot; (1986; e modifiche). Tutte le procedure di valutazione e di elettrofisiologia chirurgiche, cliniche sono state effettuate sotto anestesia e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. 1. enucleazione e Fixation NOTA: Seguire la procedura enucleazione e la fissazione descritto in dettaglio nel manoscritto compagno di 16, facendo attenzione in più verso cavi di dispositivi o porte vitrectomia, se presente. Brevemente, ciò comporta: <ol><li> Transcardiaca profumato il soggetto con soluzione salina calda seguita da buffe neutra a freddoformalina rosso. </li><li> Legare suture al bulbo oculare per servire come punti di riferimento. </li><li> Enucleare l&#39;occhio 16, mantenendo i cavi del dispositivo e qualsiasi attacco patch / schede. </li><li> Post-fix l&#39;occhio in soluzione di Davidson per 18 - 36 ore. </li><li> Trasferimento al 50% di etanolo per 6 - 8 ore. </li><li> Trasferimento a 70% di etanolo e conservare in frigorifero (4 ° C) fino dissezione. </li></ol> 2. Rimozione elettrodi e dissezione. NOTA: Non tutti gli impianti epiretiniche avranno lo stesso fattore di forma, ma in generale ci sarà un array di elettrodi e una qualche forma di materiale di supporto flessibile e adattabile. I dispositivi che sono collocati assieme alla retina presentano un foro in cui il tack tack metallo penetra la matrice e la parte posteriore dell&#39;occhio, mantenendo queste insieme. <ol><li> Visualizzate l&#39;impianto e il punto in cui è fissato alla retina. <ol><li> Utilizzando una lama di 15 gradi fa un&#39;incisione trans-corneale circonferenziale e togliere il tappo corneale a expose l&#39;iride e lente sottostanti. </li><li> Utilizzando una lama 15 gradi, il disinserimento fibre zonular della lente e rimuovere la lente in toto, esponendo camera posteriore con l&#39;impianto e il epiretinal tack metallo in situ. </li></ol></li><li> A seconda dell&#39;impianto e lo studio in corso di esecuzione, rimuovere i componenti estranei prima di ulteriori dissezione. NOTA: Nel presente esempio, l&#39;array epiretinal corso di valutazione costituito da un elettrodo di diamante ermetica pacchetto ed elettronica prototipo ospitato all&#39;interno di un vettore di silicone conforme (prodotto in casa, vedi 20). <ol><li> Qui, estrarre con cautela il pacchetto elettrodo diamante da dissezione fine con un bisturi. Lasciare il corpo silicone dell&#39;impianto insieme al tack retina e resti del cablaggio di platino (Figura 2). Se un array / contenitore incorporato non è parte del design del dispositivo in esame, quindi omettere questo passaggio (2.2). </li></ol></li><li> Attentamentesezionare un campione che comprende l&#39;aderenza e tessuto circostante nell&#39;orientamento desiderato. Usare bene le forbici dissezione per tagliare le strisce di spessore pieno dalla parte posteriore dell&#39;occhio, tra cui sclera, coroide e della retina. Prelevare un campione, che dà una sezione longitudinale del tack, che mostra tutti gli strati retinici adiacenti alla tack (Figura 2) NOTA: L&#39;orientamento desiderato per il campione può variare a seconda del particolare risultato desiderato. Ad esempio, se si vuole esaminare la vicinanza del danno virata al disco ottico poi il disco ottico deve essere inclusa nel campione. </li></ol> 3. Disidratazione, Embedding, montaggio, Macinare, colorazione, e Imaging <ol><li> Disidratare il campione in tre giorni in fasi progressive di etanolo: <ol><li> Disidratare il campione in etanolo al 70% per 2 ore due volte. </li><li> Disidratare il campione in 80% di etanolo per 2 ore due volte e poi O / N. </li><li> Disidratare il campione in etanolo al 90% per 2 ore TWICe. </li><li> Disidratare il campione in 100% di etanolo per 2 ore due volte e poi O / N. </li></ol></li><li> Disidratare il campione in 100% acetone per 2 ore due volte. <ol><li> Togliere il campione dal acetone e osservare al microscopio luce che aria-asciuga a temperatura ambiente. Trasferire il campione di resina epossidica (fare riferimento al punto 3.4) poco prima che inizi ad arricciarsi / crollo. NOTA: La rimozione del liquido dai tessuti molli risultati in cellule crollati e ritiro. Un apprezzamento di quando si verifica l&#39;arricciatura del tessuto / crollo è sviluppato con l&#39;esperienza. </li></ol></li><li> Preparare resina epossidica grado medico secondo le istruzioni del produttore. Per curare la resina, utilizzare 55 ° C per 1 ora o 24 ore a RT. Porre in una camera a vuoto per ~ 5 min a ~ 50 mbar per la rimozione di bolle d&#39;aria. Regolare il vuoto manualmente come un vuoto eccessivo causerà la miscela epossidica a bollire e degasaggio non si verifichi effettivamente NOTA: Eseguire il passaggio 3.3 in concomitanza con la fase 3.2. </li><li> Incorpora la sample in resina epossidica trasparente. Immergere il tessuto oculare in resina epossidica degasata in un apposito contenitore sigillabile e lasciare O / N a RT per curare. </li><li> Fare attenzione a incorporare il campione con l&#39;orientamento desiderato (Figura 2) ridimensionando e ri-embedding blocco resina catalizzata. Re-incorporare il blocco ridimensionata contenente il tessuto oculare tale che l&#39;asse lungo della mura è orientato parallelamente al fondo dello stampo (giallo tazza - Figura 3A). </li><li> Montare la resina in supporto del campione di macinazione e macinare il campione (230-250 giri con acqua, rettifica manuale) con carta carburo di silicio (a partire da 800 rete; Figure 3C e 3E). </li><li> Per la colorazione, immergere la superficie del terreno in toluidina colorazione blu per 3-5 minuti, o fino a quando si sviluppa macchia (Figura 3F). </li><li> Risciacquare con acqua di rubinetto (Figura 3G). </li><li> Immagine la superficie del terreno del campione con una portata elevata potenza dissezione per visualizzare gli strati cellulari delretina (Figura 3H). Applicare una goccia di acqua distillata sulla superficie superiore della resina epossidica sopra il campione per lisciare la diffrazione all&#39;interfaccia aria-epossi. Utilizzare una fibra &#39;collo d&#39;oca&#39; sorgente luminosa ottica per illuminare il campione. </li><li> Ripetere i passaggi 3,6-3,9, ogni tempo di macinazione di distanza uno spessore prefissato di campione (minimo incremento molatura preciso e riproducibile di portacampioni è 20 micron). </li></ol>

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Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Tecniche istologiche standard sono in grado di elaborare le protesi in metallo duro in situ a causa di limitazioni nel taglio di questi oggetti di metallo, vetro o anche dischi diamantati. Nel nostro compagno di carta 16, abbiamo dimostrato che l&#39;uso di una tecnica di fissazione intero-eye modificato potrebbe ridurre artefatti delaminazione della retina. Nel manoscritto corrente, un consolidato smerigliatura e lucidatura tecnica per la visualizzazione di impianti cocleari 21-23 in situ è stato modificato per protesi retiniche. Una virata di titanio, utilizzato per proteggere una matrice di elettrodi alla retina, epiretinally, è stato incorporato in resina epossidica con il tessuto oculare circostante. Questo blocco di resina è stata poi orientato in modo appropriato e terra / progressivamente lucido per rivelare la morfologia del tessuto immediatamente adiacente alla virata di metallo. Immagini della superficie lucida del blocco a varie profondità sono state prese con un potente microscopio di dissezione. Questa tecnica è utile per: Visualizzazione e evaluating la risposta del tessuto adiacente all&#39;impianto epiretinal; per valutare il trauma chirurgico associato con l&#39;impianto della protesi; per determinare la reazione biologica ai componenti in metallo duro; e per misurare la distanza tra l&#39;impianto e la superficie della retina. Questa tecnica sarà utile in studi di sicurezza per future in situ visualizzazione della regione adiacente ad una virata retina o altri (ad esempio metallico) oggetti duri nell&#39;occhio. Questo ha applicazione diretta nella valutazione della sicurezza preclinica di protesi virato alla retina epiretinally. Può anche essere utile per valutare il danno tissutale in regioni retina a contatto con impianti situati in posizione sub-retinica. Ci sono diversi modi per verificare che la tecnica è stata eseguita correttamente. In ogni fase, la retina dovrebbe rimanere aderente agli strati esterni dell&#39;occhio. Se vi è il distacco di retina artefatta lordo, ciò può indianemangiato un problema con il fissaggio. Quando il campione è incorporato e ri-orientato nella resina finale bloccare la retina deve essere vicino ortogonale alla faccia di macinazione del blocco; Questo ridurrà al minimo il taglio obliquo. È utile per verificare che il numero di passaggi di macinazione incrementali (noto di step size) necessaria per attraversare un oggetto (quale un tack retinica) correlare conseguenza con le dimensioni dell&#39;oggetto. La tecnica può essere ottimizzato in diversi modi. Graffi sulla superficie del blocco epossidica associato al processo di macinazione possono essere ridotti con progressiva lucidatura grado più fine. Per questo studio, abbiamo utilizzato 800, 1000, 1200, 2400, e 4000 carta al carburo di silicio. Pasta diamante potrebbe essere utilizzato anche per migliorare la finitura superficiale. Una finitura superficiale più fine dà un&#39;immagine di qualità superiore, ma a costo di tempo lucidatura supplementare. Un&#39;altra considerazione importante per migliorare l&#39;esito di questa tecnica è la scelta e la qualità del optics e l&#39;illuminazione utilizzati per la cattura delle immagini. Altre macchie istologiche di base - in particolare le macchie di Nissl, possono essere utilizzati al posto del blu di toluidina, ma potrebbero richiedere un&#39;ulteriore ottimizzazione. Alcuni macchie si macchia la resina e il tessuto (ad esempio, eosina), quindi uno smalto superficiale può essere richiesto dopo la colorazione per rimuovere sfondo scolorimento. Macchie specializzati, coloranti fluorescenti e colorazione immunoistochimica non è stato tentato, ma a meno che un risultato molto specifica è desiderato, il tempo richiesto per eseguire queste macchie a ciascun livello di macinazione è probabile che sia proibitivi. Tuttavia, può essere possibile macchiare il tessuto nel suo insieme prima della fase di incorporamento (passo 3.4) 24. Il limite principale di questa tecnica è che una volta che la regione di interesse è stato macinato distanza, non può essere recuperato, pertanto, è prudente catturare molte immagini (eventualmente ridondanti) in una varietà di ingrandimenti in ogni fase di levigatura e lucidatura. Èanche importante utilizzare piccoli incrementi per ogni regolazione della profondità di macinazione. Un altro limite di questa tecnica è che la ingrandimento ottico e risoluzione rispetto a tessuto montato su un vetrino e visualizzato con uno standard (trasmissione) microscopio ottico. Ai fini della prototipazione e valutazione della sicurezza di un dispositivo di impianto romanzo, la valutazione patologica lordo è di interesse primario. Questa tecnica offre un metodo efficiente per osservare i danni clinicamente rilevanti associati con una virata retina. Con la pratica, il tempo complessivo necessario per raccogliere grind, polacco e fotografare un dato campione (una volta integrati) è paragonabile al tempo che ci vuole per la sezione di un blocco di paraffina o sezioni congelate. Vi è anche la possibilità per le attuali tecniche per essere esteso alle applicazioni al di fuori dell&#39;ambito di impianti retinici. Questa tecnica è adatta per valutare il tessuto adiacente ad un impianto fisso, in cui l&#39;estrazione dell&#39;impianto non feasible o danneggerebbero l&#39;interfaccia. Ad esempio, questa tecnica può essere espansa per valutare protesi in metallo (ad esempio, platino, nitinol, etc.) che non può essere tagliato con tecniche istologiche convenzionali, come alcuni cerebrale profonda o elettrodi nervose periferiche, cannule per la somministrazione di farmaci, stent vascolari o protesi ortopediche.

Retinite pigmentosa (RP) è una malattia ereditaria che provoca perdita diffusa dei fotorecettori, che sono le cellule nello strato più esterno della retina responsabile trasduzione luce, sotto forma di fotoni, in attività neurale. È importante sottolineare che i pazienti con RP hanno tipicamente neuroni residui negli altri strati della loro retina che sono ancora funzionali. Protesi retiniche sono in grado di ripristinare una certa visione limitata a questi pazienti di mira questi neuroni superstiti con stimolazione elettrica per attivare il loro percorso di 1,2 visiva. Esiti percettivi da studi clinici hanno mostrato promettenti risultati iniziali e recentemente alcuni dispositivi sono stati approvati per l&#39;uso commerciale. Attualmente, ci sono tre principali sedi anatomiche in cui sono state posizionate le protesi retiniche clinici: epiretinally 3,4, 5,6 e subretinally suprachoroidally 7,8. Dispositivi diversi utilizzano diversi materiali e la loro forma è personalizzatoalla posizione in cui sono impiantati. Tuttavia, tutti creano percezioni visive attivando i neuroni residui della retina con impulsi elettrici. Vi è la possibilità di qualsiasi protesi mediche per danneggiare il tessuto circostante a causa di effetti meccanici del collocamento iniziale o successive forze in corso. In caso di stimolatori impiantabili, quali protesi retiniche, vi è la considerazione aggiuntiva che i parametri elettrici devono essere entro limiti di sicurezza. La sicurezza del paziente è fondamentale, quindi i dispositivi deve essere rigorosamente testato in studi preclinici prima di passare alla creazione di una clinica 9-15. Nel nostro articolo compagno, abbiamo descritto un metodo per la valutazione della istopatologia localizzata dell&#39;occhio circostante un impianto posizionato nello spazio sovracoroideale 16. Nel presente manoscritto, si descrive una tecnica per la visualizzazione dei tessuti oculari che circonda una matrice di elettrodi appiccicato alla retina epiretinally, in un preclinico (feline) Modello (Figura 1). La posizione epiretinal è la posizione più comunemente utilizzato per localizzare una protesi visiva. Array elettrodi situati qui sono tipicamente apposte alla retina con una virata metallo che penetra tutti gli strati dell&#39;occhio 17-20. Prima le tecniche descritte nella presente manoscritto era difficile valutare con precisione la retina e altri tessuti immediatamente circostanti una virata. Fissazione dell&#39;occhio standard con formalina tamponata neutra provocato danni alla retina artefatta a causa del movimento differenziale della retina e sclera contro il punto fisso della mura. Pertanto i danni reali causati dalla virata e la matrice epiretinal non poteva essere osservato con precisione. Inoltre, sezionando il tessuto oculare non poteva essere eseguita con l&#39;aderenza della retina in situ come oggetti metallici non possono essere isolate con le apparecchiature tradizionali istologica; rimuovere la virata prima della trasformazione istologica era ancheindesiderabile in quanto ciò ha comportato anche danni alla retina artefatta. Lo scopo del presente studio è stato duplice: 1) per ridurre il distacco della retina manufatto in modo che eventuali danni causati dalla virata e l&#39;array dell&#39;impianto epiretinal può essere valutato in modo attendibile; e 2) per visualizzare l&#39;architettura retinica adiacente al tatto senza rimuoverla. Per raggiungere obiettivo 1, una nuova tecnica di fissaggio è stata utilizzata (come descritto nell&#39;articolo guidata 16), che riduce artefatti delaminazione retinica. Al fine di conseguire l&#39;obiettivo 2, abbiamo modificato un embedding, rettifica, e la tecnica, originariamente sviluppato per l&#39;osservazione in situ di cocleari elettrodi impianto 21-23 lucidatura. I metodi descritti in questo manoscritto consentono la visualizzazione della retina circostante e adiacente ad una virata in situ, riducendo al minimo i danni della retina artefatta e consentendo quindi una valutazione accurata di eventuali danni causati dalla virata e la matrice epiretinal.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD Medical grade</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 Epoxy</td><td>Epoxy Technology</td><td>Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70-75% v/v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol grinding/polishing machine</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop specimen holder</td><td>Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo Objective</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope Camera</td><td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Application Suite v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Il protocollo di fissaggio ridotto sensibilmente il distacco artefatta e delaminazione della retina 16. Orientamento del campione all&#39;interno del blocco epossidica è stata ottenuta costantemente usando il processo incorporamento due fasi descritto. La procedura di rettifica incrementale richiesto un livello moderato di destrezza manuale per ottenere risultati ottimali, ma è stata aiutata dal titolare del campione regolabile che ha fornito un controllo preciso della risoluzione incremento. In tutti i casi (n = 5) l&#39;aderenza era situato e terra / lucidata con risultati desiderabili e coerenti. La retina adiacente alle puntine erano risolvibili e macchiato in modo appropriato. Lucidatura la superficie del blocco di resina epossidica con un grado P # 800 carta al carburo di silicio era sufficiente per l&#39;immagine macrostruttura cellulare del tessuto incorporato. Carta di grado superiore, o diamante liquami possono essere utilizzati per lucidare ulteriormente la superficie in qualsiasi data profondità se desiderato. Un microscopio dissezione e fibra ottica &#39;collo d&#39;oca&#39; lighfonte t è risultato essere adatto per l&#39;imaging la superficie del blocco di terra e il campione di tessuto incorporato. La posizione della sorgente di luce è stata variata per tentativi per trovare una posizione e angolo che ha dato il miglior illuminazione e contrasto attraverso il microscopio. Aggiunta di una goccia d&#39;acqua distillata alla superficie del blocco, sopra il campione, era utile per ridurre la luce di diffrazione percorso e / o distorsioni lisce all&#39;interfaccia epossidico. Figura 4 mostra esempio immagini di tessuto retinico visualizzate immediatamente adiacente ad una retina di titanio virare utilizzando questa tecnica. Non artefatta distacco della retina e pieghevole può essere visto su entrambi i lati del silicone (Figura 4A). L&#39;albero tack è visibile incorporato in silicone; la testa del tack è penetrato retina e sclera. C&#39;è non artefatta distacco di retina nella retina macchia lati del silicone (Figura 4C). La tecnica ha mostrato che, in questo caso, there è disorganizzazione retinica adiacente alla aderenza e la compressione della retina da un lato a causa di un angolo di inserimento obliquo. Si noti che le immagini presentate sono meramente illustrazioni del successo della tecnica, non rappresentativi della tack-danni istopatologia in generale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figura 1. Posizionamento di una matrice di elettrodi epiretinal. (A) Schema dell&#39;occhio che mostra una sezione trasversale ingrandita del posteriore sclera, coroide e retina degenerata (privo fotorecettori). Un array di elettrodi è rappresentato in blu, apposto epiretinally. (B) Computer-aided-disegno di un array di elettrodi epiretinal. un circuito integrato (&#39;chip&#39;) e il pacchetto elettrodi; b, titanio tack retina; c, custodia in silicone per uso medico; d, punto di uscita piombo. Pannello A modificato da un illustrati originalisu gentile concessione di Bionic Vision Australia, autore Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figura 2. Rimozione degli elettrodi e la dissezione dell&#39;occhio. Alta gamma dinamica fotografie macro di un occhio felino enucleato con tack epiretinal in situ. (A) Condividi fissazione con fissativo di Davidson per preservare l&#39;architettura della retina 16, l&#39;occhio enucleato è stato sezionato. Il pacchetto matrice di elettrodi è stato rimosso dal supporto di silicone (tratteggiata contorno quadrato indica posizione originale di matrice di elettrodi) con la tack (freccia) ed il corpo di silicone dell&#39;impianto restante. (B) L&#39;occhio è stato sezionato con la sezione longitudinale adiacente bordeggiare(Linea tratteggiata). La virata resta incorporato nella parete posteriore del oculare (freccia), stabilizzato prevalentemente dalla sclera. La sezione di tessuto contenente il tack è stato preparato per incorporamento resina e macinazione (segmento destra), mentre la sezione contenente retina sotto la matrice di elettrodi rimosso è stato preparato per l&#39;elaborazione istologica campione 16 (segmento a sinistra). Un righello con incrementi di 0,5 millimetri è mostrato sul bordo inferiore di ogni pannello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figura 3. embedment epossidica e rettifica della mura e tessuto retinico. Fotografie della resina epossidica integrata e campione di tessuto allineati, rettifica, colorazione e di imaging della mura e tessuto retinico. (A) La tac<html> k campione è stato incorporato in un blocco di resina epossidica. Utilizzando lo stampo, il campione è stato orientato in modo che il piano longitudinale è parallelo al fondo dello stampo. (B) Il blocco resina catalizzata contenente il campione tack. (C) Il blocco epossidica è stato montato in un portacampioni molatura, pronto per la macinazione . (D) Il campione è stato orientato in modo imaged sezioni del tessuto terra contengono gli strati cellulari retinici e l&#39;asse longitudinale del tack. (E) Il campione è stato macinato con carta carburo di silicio su un macinino rotativo. (F) La superficie terra il blocco è stato macchiato con toluidina blu per identificare gli strati retinici. (G) Il blocco è stato lavato in acqua di rubinetto per rimuovere l&#39;eccesso macchia. (H) La toluidina blu macchiati strati retinici e virata sono stati ripresi utilizzando una portata elevata dissezione potenza. annuncio / 52.348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. immagini di potenza alta e bassa della virata e della retina. In vari punti durante le immagini di processo di macinazione sono state scattate con un ambito dissezione, mostrando sezioni longitudinali della virata (asterisco) che penetrano attraverso l&#39;occhio e in uscita la sclera (&#39;S&#39; ), adiacente silicone (hash) e blu di toluidina macchiato e retina senza macchia (&#39;R&#39;). Nota questi sono esempi di immagini solo per dimostrare la presenza tecnica di visualizzazione, e non sono rappresentative di tutti di impianto o tack risultati istologici inserimento epiretiniche. Resti di terra del cablaggio platino sono visibili in pannelli AD (&#39;W&#39;). (A) a basso consumo, immagine senza macchia della mura penetrare la retina e sclera. (B) Immagini di alta potenza del distacco della retina e pieghevole in retina senza macchia adiacente al vettore silicone immagine A. (C) immagine a bassa potenza in al centro dell&#39;albero tack. <strong&gt; (D) Immagine di alta potenza del centro tack nell&#39;immagine C. (E) In un campione separato, con nessun vettore silicone, viene mostrata una immagine di alta potenza di blu di toluidina retina macchiato sotto l&#39;impugnatura tack, immediatamente prima rettifica l&#39;albero virata (F) toluidina Normale blu macchiato architettura retina (GCL: strato di cellule gangliari della retina; INL: strato nucleare interno; ONL: strato nucleare esterno; PR: fotorecettori; T: felino tapetum lucidum). visualizzata utilizzando la stessa tecnica di rettifica . Barre di scala in ogni pannello sono: A e C = 2 mm B e D = 500 micron; E = 200 micron; F = 100 micron.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.5K Views.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell&#39;epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Ricerca

Neuroscienze

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Medicina

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Genetica

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Biologia

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Ottimizzazione della configurazione e delle condizioni per l'elettroretinogramma ex vivo per studiare la funzione della retina in occhi piccoli e grandi

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Caratterizzazione di una nuova tecnica di coltura retinica organotipica umana

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or topical administration. IVT drug delivery involves an injection into the vitreous humor of the eye, a gelatinous substance that fills the posterior chamber of the eye and maintains the shape of the eye globe. Although the IVT route is less specifically targeted than subretinal delivery, it is much less invasive and is widely used in clinical settings for a range of ocular diseases. 
We previously demonstrated the efficacy of intravitreal delivery of an adeno-associated virus (AAV)-mediated gene therapy product (AAV9.CLN5) in sheep with a naturally occurring CLN5 form of neuronal ceroid lipofuscinosis (NCL). Affected sheep received IVT gene therapy in one eye, with the other untreated eye serving as an internal control. Retinal structure and function were maintained in the treated eye up to 15 months after treatment, while the untreated eye displayed progressively declining function and severe atrophy during postmortem examination. Based on the sheep studies, the CLN5 gene therapy product was cleared as a candidate investigational new drug (IND) by the United States Food and Drug Administration in September 2021. This paper details the surgical protocol for IVT delivery of a therapeutic viral vector to the ovine eye.

Intravitreal injections were performed in the sheep eye with the aim of delivering viral-mediated gene therapy to the retina.

Iniezioni intravitreali nell'occhio ovino

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...