Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

NOTA: Tutte le procedure sono state approvate dal Royal Victorian Eye and Ear Research &amp; Ethics Comitato Animal Hospital (RVEEH AEC; # 10-199AB). I soggetti sono stati trattati secondo il National Health e &quot;Codice di condotta australiano per la cura e l&#39;uso di animali a scopi scientifici&quot; del Medical Research Council (2013) e la &quot;Prevenzione della Crudeltà verso gli Animali Act&quot; (1986; e modifiche). Tutte le procedure di valutazione e di elettrofisiologia chirurgiche, cliniche sono state effettuate sotto anestesia e sono stati fatti tutti gli sforzi per ridurre al minimo le sofferenze. 1. enucleazione e Fixation NOTA: Seguire la procedura enucleazione e la fissazione descritto in dettaglio nel manoscritto compagno di 16, facendo attenzione in più verso cavi di dispositivi o porte vitrectomia, se presente. Brevemente, ciò comporta: <ol><li> Transcardiaca profumato il soggetto con soluzione salina calda seguita da buffe neutra a freddoformalina rosso. </li><li> Legare suture al bulbo oculare per servire come punti di riferimento. </li><li> Enucleare l&#39;occhio 16, mantenendo i cavi del dispositivo e qualsiasi attacco patch / schede. </li><li> Post-fix l&#39;occhio in soluzione di Davidson per 18 - 36 ore. </li><li> Trasferimento al 50% di etanolo per 6 - 8 ore. </li><li> Trasferimento a 70% di etanolo e conservare in frigorifero (4 ° C) fino dissezione. </li></ol> 2. Rimozione elettrodi e dissezione. NOTA: Non tutti gli impianti epiretiniche avranno lo stesso fattore di forma, ma in generale ci sarà un array di elettrodi e una qualche forma di materiale di supporto flessibile e adattabile. I dispositivi che sono collocati assieme alla retina presentano un foro in cui il tack tack metallo penetra la matrice e la parte posteriore dell&#39;occhio, mantenendo queste insieme. <ol><li> Visualizzate l&#39;impianto e il punto in cui è fissato alla retina. <ol><li> Utilizzando una lama di 15 gradi fa un&#39;incisione trans-corneale circonferenziale e togliere il tappo corneale a expose l&#39;iride e lente sottostanti. </li><li> Utilizzando una lama 15 gradi, il disinserimento fibre zonular della lente e rimuovere la lente in toto, esponendo camera posteriore con l&#39;impianto e il epiretinal tack metallo in situ. </li></ol></li><li> A seconda dell&#39;impianto e lo studio in corso di esecuzione, rimuovere i componenti estranei prima di ulteriori dissezione. NOTA: Nel presente esempio, l&#39;array epiretinal corso di valutazione costituito da un elettrodo di diamante ermetica pacchetto ed elettronica prototipo ospitato all&#39;interno di un vettore di silicone conforme (prodotto in casa, vedi 20). <ol><li> Qui, estrarre con cautela il pacchetto elettrodo diamante da dissezione fine con un bisturi. Lasciare il corpo silicone dell&#39;impianto insieme al tack retina e resti del cablaggio di platino (Figura 2). Se un array / contenitore incorporato non è parte del design del dispositivo in esame, quindi omettere questo passaggio (2.2). </li></ol></li><li> Attentamentesezionare un campione che comprende l&#39;aderenza e tessuto circostante nell&#39;orientamento desiderato. Usare bene le forbici dissezione per tagliare le strisce di spessore pieno dalla parte posteriore dell&#39;occhio, tra cui sclera, coroide e della retina. Prelevare un campione, che dà una sezione longitudinale del tack, che mostra tutti gli strati retinici adiacenti alla tack (Figura 2) NOTA: L&#39;orientamento desiderato per il campione può variare a seconda del particolare risultato desiderato. Ad esempio, se si vuole esaminare la vicinanza del danno virata al disco ottico poi il disco ottico deve essere inclusa nel campione. </li></ol> 3. Disidratazione, Embedding, montaggio, Macinare, colorazione, e Imaging <ol><li> Disidratare il campione in tre giorni in fasi progressive di etanolo: <ol><li> Disidratare il campione in etanolo al 70% per 2 ore due volte. </li><li> Disidratare il campione in 80% di etanolo per 2 ore due volte e poi O / N. </li><li> Disidratare il campione in etanolo al 90% per 2 ore TWICe. </li><li> Disidratare il campione in 100% di etanolo per 2 ore due volte e poi O / N. </li></ol></li><li> Disidratare il campione in 100% acetone per 2 ore due volte. <ol><li> Togliere il campione dal acetone e osservare al microscopio luce che aria-asciuga a temperatura ambiente. Trasferire il campione di resina epossidica (fare riferimento al punto 3.4) poco prima che inizi ad arricciarsi / crollo. NOTA: La rimozione del liquido dai tessuti molli risultati in cellule crollati e ritiro. Un apprezzamento di quando si verifica l&#39;arricciatura del tessuto / crollo è sviluppato con l&#39;esperienza. </li></ol></li><li> Preparare resina epossidica grado medico secondo le istruzioni del produttore. Per curare la resina, utilizzare 55 ° C per 1 ora o 24 ore a RT. Porre in una camera a vuoto per ~ 5 min a ~ 50 mbar per la rimozione di bolle d&#39;aria. Regolare il vuoto manualmente come un vuoto eccessivo causerà la miscela epossidica a bollire e degasaggio non si verifichi effettivamente NOTA: Eseguire il passaggio 3.3 in concomitanza con la fase 3.2. </li><li> Incorpora la sample in resina epossidica trasparente. Immergere il tessuto oculare in resina epossidica degasata in un apposito contenitore sigillabile e lasciare O / N a RT per curare. </li><li> Fare attenzione a incorporare il campione con l&#39;orientamento desiderato (Figura 2) ridimensionando e ri-embedding blocco resina catalizzata. Re-incorporare il blocco ridimensionata contenente il tessuto oculare tale che l&#39;asse lungo della mura è orientato parallelamente al fondo dello stampo (giallo tazza - Figura 3A). </li><li> Montare la resina in supporto del campione di macinazione e macinare il campione (230-250 giri con acqua, rettifica manuale) con carta carburo di silicio (a partire da 800 rete; Figure 3C e 3E). </li><li> Per la colorazione, immergere la superficie del terreno in toluidina colorazione blu per 3-5 minuti, o fino a quando si sviluppa macchia (Figura 3F). </li><li> Risciacquare con acqua di rubinetto (Figura 3G). </li><li> Immagine la superficie del terreno del campione con una portata elevata potenza dissezione per visualizzare gli strati cellulari delretina (Figura 3H). Applicare una goccia di acqua distillata sulla superficie superiore della resina epossidica sopra il campione per lisciare la diffrazione all&#39;interfaccia aria-epossi. Utilizzare una fibra &#39;collo d&#39;oca&#39; sorgente luminosa ottica per illuminare il campione. </li><li> Ripetere i passaggi 3,6-3,9, ogni tempo di macinazione di distanza uno spessore prefissato di campione (minimo incremento molatura preciso e riproducibile di portacampioni è 20 micron). </li></ol>

<ol>
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A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Tecniche istologiche standard sono in grado di elaborare le protesi in metallo duro in situ a causa di limitazioni nel taglio di questi oggetti di metallo, vetro o anche dischi diamantati. Nel nostro compagno di carta 16, abbiamo dimostrato che l&#39;uso di una tecnica di fissazione intero-eye modificato potrebbe ridurre artefatti delaminazione della retina. Nel manoscritto corrente, un consolidato smerigliatura e lucidatura tecnica per la visualizzazione di impianti cocleari 21-23 in situ è stato modificato per protesi retiniche. Una virata di titanio, utilizzato per proteggere una matrice di elettrodi alla retina, epiretinally, è stato incorporato in resina epossidica con il tessuto oculare circostante. Questo blocco di resina è stata poi orientato in modo appropriato e terra / progressivamente lucido per rivelare la morfologia del tessuto immediatamente adiacente alla virata di metallo. Immagini della superficie lucida del blocco a varie profondità sono state prese con un potente microscopio di dissezione. Questa tecnica è utile per: Visualizzazione e evaluating la risposta del tessuto adiacente all&#39;impianto epiretinal; per valutare il trauma chirurgico associato con l&#39;impianto della protesi; per determinare la reazione biologica ai componenti in metallo duro; e per misurare la distanza tra l&#39;impianto e la superficie della retina. Questa tecnica sarà utile in studi di sicurezza per future in situ visualizzazione della regione adiacente ad una virata retina o altri (ad esempio metallico) oggetti duri nell&#39;occhio. Questo ha applicazione diretta nella valutazione della sicurezza preclinica di protesi virato alla retina epiretinally. Può anche essere utile per valutare il danno tissutale in regioni retina a contatto con impianti situati in posizione sub-retinica. Ci sono diversi modi per verificare che la tecnica è stata eseguita correttamente. In ogni fase, la retina dovrebbe rimanere aderente agli strati esterni dell&#39;occhio. Se vi è il distacco di retina artefatta lordo, ciò può indianemangiato un problema con il fissaggio. Quando il campione è incorporato e ri-orientato nella resina finale bloccare la retina deve essere vicino ortogonale alla faccia di macinazione del blocco; Questo ridurrà al minimo il taglio obliquo. È utile per verificare che il numero di passaggi di macinazione incrementali (noto di step size) necessaria per attraversare un oggetto (quale un tack retinica) correlare conseguenza con le dimensioni dell&#39;oggetto. La tecnica può essere ottimizzato in diversi modi. Graffi sulla superficie del blocco epossidica associato al processo di macinazione possono essere ridotti con progressiva lucidatura grado più fine. Per questo studio, abbiamo utilizzato 800, 1000, 1200, 2400, e 4000 carta al carburo di silicio. Pasta diamante potrebbe essere utilizzato anche per migliorare la finitura superficiale. Una finitura superficiale più fine dà un&#39;immagine di qualità superiore, ma a costo di tempo lucidatura supplementare. Un&#39;altra considerazione importante per migliorare l&#39;esito di questa tecnica è la scelta e la qualità del optics e l&#39;illuminazione utilizzati per la cattura delle immagini. Altre macchie istologiche di base - in particolare le macchie di Nissl, possono essere utilizzati al posto del blu di toluidina, ma potrebbero richiedere un&#39;ulteriore ottimizzazione. Alcuni macchie si macchia la resina e il tessuto (ad esempio, eosina), quindi uno smalto superficiale può essere richiesto dopo la colorazione per rimuovere sfondo scolorimento. Macchie specializzati, coloranti fluorescenti e colorazione immunoistochimica non è stato tentato, ma a meno che un risultato molto specifica è desiderato, il tempo richiesto per eseguire queste macchie a ciascun livello di macinazione è probabile che sia proibitivi. Tuttavia, può essere possibile macchiare il tessuto nel suo insieme prima della fase di incorporamento (passo 3.4) 24. Il limite principale di questa tecnica è che una volta che la regione di interesse è stato macinato distanza, non può essere recuperato, pertanto, è prudente catturare molte immagini (eventualmente ridondanti) in una varietà di ingrandimenti in ogni fase di levigatura e lucidatura. Èanche importante utilizzare piccoli incrementi per ogni regolazione della profondità di macinazione. Un altro limite di questa tecnica è che la ingrandimento ottico e risoluzione rispetto a tessuto montato su un vetrino e visualizzato con uno standard (trasmissione) microscopio ottico. Ai fini della prototipazione e valutazione della sicurezza di un dispositivo di impianto romanzo, la valutazione patologica lordo è di interesse primario. Questa tecnica offre un metodo efficiente per osservare i danni clinicamente rilevanti associati con una virata retina. Con la pratica, il tempo complessivo necessario per raccogliere grind, polacco e fotografare un dato campione (una volta integrati) è paragonabile al tempo che ci vuole per la sezione di un blocco di paraffina o sezioni congelate. Vi è anche la possibilità per le attuali tecniche per essere esteso alle applicazioni al di fuori dell&#39;ambito di impianti retinici. Questa tecnica è adatta per valutare il tessuto adiacente ad un impianto fisso, in cui l&#39;estrazione dell&#39;impianto non feasible o danneggerebbero l&#39;interfaccia. Ad esempio, questa tecnica può essere espansa per valutare protesi in metallo (ad esempio, platino, nitinol, etc.) che non può essere tagliato con tecniche istologiche convenzionali, come alcuni cerebrale profonda o elettrodi nervose periferiche, cannule per la somministrazione di farmaci, stent vascolari o protesi ortopediche.

Retinite pigmentosa (RP) è una malattia ereditaria che provoca perdita diffusa dei fotorecettori, che sono le cellule nello strato più esterno della retina responsabile trasduzione luce, sotto forma di fotoni, in attività neurale. È importante sottolineare che i pazienti con RP hanno tipicamente neuroni residui negli altri strati della loro retina che sono ancora funzionali. Protesi retiniche sono in grado di ripristinare una certa visione limitata a questi pazienti di mira questi neuroni superstiti con stimolazione elettrica per attivare il loro percorso di 1,2 visiva. Esiti percettivi da studi clinici hanno mostrato promettenti risultati iniziali e recentemente alcuni dispositivi sono stati approvati per l&#39;uso commerciale. Attualmente, ci sono tre principali sedi anatomiche in cui sono state posizionate le protesi retiniche clinici: epiretinally 3,4, 5,6 e subretinally suprachoroidally 7,8. Dispositivi diversi utilizzano diversi materiali e la loro forma è personalizzatoalla posizione in cui sono impiantati. Tuttavia, tutti creano percezioni visive attivando i neuroni residui della retina con impulsi elettrici. Vi è la possibilità di qualsiasi protesi mediche per danneggiare il tessuto circostante a causa di effetti meccanici del collocamento iniziale o successive forze in corso. In caso di stimolatori impiantabili, quali protesi retiniche, vi è la considerazione aggiuntiva che i parametri elettrici devono essere entro limiti di sicurezza. La sicurezza del paziente è fondamentale, quindi i dispositivi deve essere rigorosamente testato in studi preclinici prima di passare alla creazione di una clinica 9-15. Nel nostro articolo compagno, abbiamo descritto un metodo per la valutazione della istopatologia localizzata dell&#39;occhio circostante un impianto posizionato nello spazio sovracoroideale 16. Nel presente manoscritto, si descrive una tecnica per la visualizzazione dei tessuti oculari che circonda una matrice di elettrodi appiccicato alla retina epiretinally, in un preclinico (feline) Modello (Figura 1). La posizione epiretinal è la posizione più comunemente utilizzato per localizzare una protesi visiva. Array elettrodi situati qui sono tipicamente apposte alla retina con una virata metallo che penetra tutti gli strati dell&#39;occhio 17-20. Prima le tecniche descritte nella presente manoscritto era difficile valutare con precisione la retina e altri tessuti immediatamente circostanti una virata. Fissazione dell&#39;occhio standard con formalina tamponata neutra provocato danni alla retina artefatta a causa del movimento differenziale della retina e sclera contro il punto fisso della mura. Pertanto i danni reali causati dalla virata e la matrice epiretinal non poteva essere osservato con precisione. Inoltre, sezionando il tessuto oculare non poteva essere eseguita con l&#39;aderenza della retina in situ come oggetti metallici non possono essere isolate con le apparecchiature tradizionali istologica; rimuovere la virata prima della trasformazione istologica era ancheindesiderabile in quanto ciò ha comportato anche danni alla retina artefatta. Lo scopo del presente studio è stato duplice: 1) per ridurre il distacco della retina manufatto in modo che eventuali danni causati dalla virata e l&#39;array dell&#39;impianto epiretinal può essere valutato in modo attendibile; e 2) per visualizzare l&#39;architettura retinica adiacente al tatto senza rimuoverla. Per raggiungere obiettivo 1, una nuova tecnica di fissaggio è stata utilizzata (come descritto nell&#39;articolo guidata 16), che riduce artefatti delaminazione retinica. Al fine di conseguire l&#39;obiettivo 2, abbiamo modificato un embedding, rettifica, e la tecnica, originariamente sviluppato per l&#39;osservazione in situ di cocleari elettrodi impianto 21-23 lucidatura. I metodi descritti in questo manoscritto consentono la visualizzazione della retina circostante e adiacente ad una virata in situ, riducendo al minimo i danni della retina artefatta e consentendo quindi una valutazione accurata di eventuali danni causati dalla virata e la matrice epiretinal.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="853">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:337px;">Name of the reagent / equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:176px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:151px;">Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Acetone</td>
			<td style="width:191px;">Chem-Supply</td>
			<td style="width:176px;">AA008</td>
			<td style="width:151px;">Propanone BHD Medical grade</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:337px;">Epo-Tek 301 Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Epoxy Technology</td>
			<td style="width:176px;">Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol 70-75% v/v</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">4.10261</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethanol</td>
			<td style="width:191px;">Merck PTY LTD</td>
			<td style="width:176px;">90143</td>
			<td style="width:151px;">Alcohol</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Toluidine blue O</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;">T3260</td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:151px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">TegraPol grinding/polishing machine</td>
			<td>Struers</td>
			<td>TegraPol-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:337px;">AccuStop specimen holder</td>
			<td style="width:191px;">Struers</td>
			<td style="width:176px;">Accustop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Objective lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>2.0x Planapo Objective</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Digital Microscope Camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DFC-420C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Software</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>Application Suite v4.1.0</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

Il protocollo di fissaggio ridotto sensibilmente il distacco artefatta e delaminazione della retina 16. Orientamento del campione all&#39;interno del blocco epossidica è stata ottenuta costantemente usando il processo incorporamento due fasi descritto. La procedura di rettifica incrementale richiesto un livello moderato di destrezza manuale per ottenere risultati ottimali, ma è stata aiutata dal titolare del campione regolabile che ha fornito un controllo preciso della risoluzione incremento. In tutti i casi (n = 5) l&#39;aderenza era situato e terra / lucidata con risultati desiderabili e coerenti. La retina adiacente alle puntine erano risolvibili e macchiato in modo appropriato. Lucidatura la superficie del blocco di resina epossidica con un grado P # 800 carta al carburo di silicio era sufficiente per l&#39;immagine macrostruttura cellulare del tessuto incorporato. Carta di grado superiore, o diamante liquami possono essere utilizzati per lucidare ulteriormente la superficie in qualsiasi data profondità se desiderato. Un microscopio dissezione e fibra ottica &#39;collo d&#39;oca&#39; lighfonte t è risultato essere adatto per l&#39;imaging la superficie del blocco di terra e il campione di tessuto incorporato. La posizione della sorgente di luce è stata variata per tentativi per trovare una posizione e angolo che ha dato il miglior illuminazione e contrasto attraverso il microscopio. Aggiunta di una goccia d&#39;acqua distillata alla superficie del blocco, sopra il campione, era utile per ridurre la luce di diffrazione percorso e / o distorsioni lisce all&#39;interfaccia epossidico. Figura 4 mostra esempio immagini di tessuto retinico visualizzate immediatamente adiacente ad una retina di titanio virare utilizzando questa tecnica. Non artefatta distacco della retina e pieghevole può essere visto su entrambi i lati del silicone (Figura 4A). L&#39;albero tack è visibile incorporato in silicone; la testa del tack è penetrato retina e sclera. C&#39;è non artefatta distacco di retina nella retina macchia lati del silicone (Figura 4C). La tecnica ha mostrato che, in questo caso, there è disorganizzazione retinica adiacente alla aderenza e la compressione della retina da un lato a causa di un angolo di inserimento obliquo. Si noti che le immagini presentate sono meramente illustrazioni del successo della tecnica, non rappresentativi della tack-danni istopatologia in generale. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Figura 1. Posizionamento di una matrice di elettrodi epiretinal. (A) Schema dell&#39;occhio che mostra una sezione trasversale ingrandita del posteriore sclera, coroide e retina degenerata (privo fotorecettori). Un array di elettrodi è rappresentato in blu, apposto epiretinally. (B) Computer-aided-disegno di un array di elettrodi epiretinal. un circuito integrato (&#39;chip&#39;) e il pacchetto elettrodi; b, titanio tack retina; c, custodia in silicone per uso medico; d, punto di uscita piombo. Pannello A modificato da un illustrati originalisu gentile concessione di Bionic Vision Australia, autore Beth Croce. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Figura 2. Rimozione degli elettrodi e la dissezione dell&#39;occhio. Alta gamma dinamica fotografie macro di un occhio felino enucleato con tack epiretinal in situ. (A) Condividi fissazione con fissativo di Davidson per preservare l&#39;architettura della retina 16, l&#39;occhio enucleato è stato sezionato. Il pacchetto matrice di elettrodi è stato rimosso dal supporto di silicone (tratteggiata contorno quadrato indica posizione originale di matrice di elettrodi) con la tack (freccia) ed il corpo di silicone dell&#39;impianto restante. (B) L&#39;occhio è stato sezionato con la sezione longitudinale adiacente bordeggiare(Linea tratteggiata). La virata resta incorporato nella parete posteriore del oculare (freccia), stabilizzato prevalentemente dalla sclera. La sezione di tessuto contenente il tack è stato preparato per incorporamento resina e macinazione (segmento destra), mentre la sezione contenente retina sotto la matrice di elettrodi rimosso è stato preparato per l&#39;elaborazione istologica campione 16 (segmento a sinistra). Un righello con incrementi di 0,5 millimetri è mostrato sul bordo inferiore di ogni pannello. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Figura 3. embedment epossidica e rettifica della mura e tessuto retinico. Fotografie della resina epossidica integrata e campione di tessuto allineati, rettifica, colorazione e di imaging della mura e tessuto retinico. (A) La tac<html> k campione è stato incorporato in un blocco di resina epossidica. Utilizzando lo stampo, il campione è stato orientato in modo che il piano longitudinale è parallelo al fondo dello stampo. (B) Il blocco resina catalizzata contenente il campione tack. (C) Il blocco epossidica è stato montato in un portacampioni molatura, pronto per la macinazione . (D) Il campione è stato orientato in modo imaged sezioni del tessuto terra contengono gli strati cellulari retinici e l&#39;asse longitudinale del tack. (E) Il campione è stato macinato con carta carburo di silicio su un macinino rotativo. (F) La superficie terra il blocco è stato macchiato con toluidina blu per identificare gli strati retinici. (G) Il blocco è stato lavato in acqua di rubinetto per rimuovere l&#39;eccesso macchia. (H) La toluidina blu macchiati strati retinici e virata sono stati ripresi utilizzando una portata elevata dissezione potenza. annuncio / 52.348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Figura 4. immagini di potenza alta e bassa della virata e della retina. In vari punti durante le immagini di processo di macinazione sono state scattate con un ambito dissezione, mostrando sezioni longitudinali della virata (asterisco) che penetrano attraverso l&#39;occhio e in uscita la sclera (&#39;S&#39; ), adiacente silicone (hash) e blu di toluidina macchiato e retina senza macchia (&#39;R&#39;). Nota questi sono esempi di immagini solo per dimostrare la presenza tecnica di visualizzazione, e non sono rappresentative di tutti di impianto o tack risultati istologici inserimento epiretiniche. Resti di terra del cablaggio platino sono visibili in pannelli AD (&#39;W&#39;). (A) a basso consumo, immagine senza macchia della mura penetrare la retina e sclera. (B) Immagini di alta potenza del distacco della retina e pieghevole in retina senza macchia adiacente al vettore silicone immagine A. (C) immagine a bassa potenza in al centro dell&#39;albero tack. <strong&gt; (D) Immagine di alta potenza del centro tack nell&#39;immagine C. (E) In un campione separato, con nessun vettore silicone, viene mostrata una immagine di alta potenza di blu di toluidina retina macchiato sotto l&#39;impugnatura tack, immediatamente prima rettifica l&#39;albero virata (F) toluidina Normale blu macchiato architettura retina (GCL: strato di cellule gangliari della retina; INL: strato nucleare interno; ONL: strato nucleare esterno; PR: fotorecettori; T: felino tapetum lucidum). visualizzata utilizzando la stessa tecnica di rettifica . Barre di scala in ogni pannello sono: A e C = 2 mm B e D = 500 micron; E = 200 micron; F = 100 micron.

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Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una retina Protesi per Localized istopatologico Analysis: Part 2 epiretinica impianti con retina aderenze

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

11.4K Views.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Tecniche di lavorazione occhi impiantati con una protesi retinica per analisi istopatologica localizzato

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

Ricerca

Medicina

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks performed by the RPE are phagocytosis and processing of outer photoreceptor segments through lysosome-derived organelles. These degradation products, stored and referred to as lipofuscin granules, are composed partially of bisretinoids, which have broad fluorescence absorption and emission spectra that can be detected clinically as fundus autofluorescence with confocal scanning laser ophthalmoscopy (cSLO). Lipofuscin accumulation is associated with increasing age, but is also found in various patterns in both acquired and inherited degenerative diseases of the retina. Thus, studying its pattern of accumulation and correlating such patterns with changes in the overlying sensory retina are essential to understanding the pathophysiology and progression of retinal disease. Here, we describe a technique employed by our lab and others that uses cSLO in order to quantify the level of RPE lipofuscin in both healthy and diseased eyes.

The retinal pigment epithelium (RPE) supports the sensory retina through recycling visual cycle byproducts, which accumulate as lipofuscin. These products are autofluorescent and can be qualitatively imaged in vivo. Here, we describe a method to quantitatively image RPE lipofuscin using confocal scanning laser ophthalmoscopy.

Quantitative Fundus autofluorescenza per la valutazione delle patologie retiniche

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un passo per passo protocollo per la chirurgia sottoretinico in Conigli

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of M&#252;ller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of M&#252;ller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.

A low-cost, easy-to-use and powerful system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach induced by histamine. Blood vessel leakage, M&#252;ller cell activation and the continuity of neuronal processes are utilized to assess the damage response and its reversal with a potential drug, lipoxin A4.

Un modello acuta della retina per la valutazione sanguigni della retina barriera breccia e potenziali farmaci per il trattamento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of diabetic microvascular complications one of the key research fields of the next decades. Specialized, targeted therapy and novel therapeutic drugs are needed to manage the increasing number of patients at risk of vision-loss. The zebrafish is an established animal model for developmental research questions with increasing relevance for modeling metabolic multifactorial disease processes. The advantages of the species allow for optimal visualization and high throughput drug screening approaches, combined with the strong ability to knock out genes of interest. Here, we describe a protocol which will allow easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis or vessel damage. This is achieved via dissection of the zebrafish retina and whole-mounting of the tissue. Visualization of the exposed vessels is then achieved via confocal microscopy of the green EGFP reporter expressed in the adult retinal vasculature. Correct handling of the tissue will lead to better outcomes and less internal vessel breakage to assure the visualization of the unaltered vascular structure. The method can be utilized in zebrafish models of retinal vasculopathy linked to changes in the vessel architecture as well as neoangiogenesis.

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tgfli:EGFP Zebrafish Retinal Vasculature

Here, we discuss a method protocol which will allow an easy analysis of the adult tg(fli:EGFP) zebrafish retinal vasculature as a fast read-out in settings of long-term vascular pathologies linked to neoangiogenesis and structural changes.

Lo studio diabete Through the Eyes of un pesce: Microdissection, visualizzazione e analisi della tg(fli:EGFP) adulto Vasculature retinico Zebrafish

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Biotribological Testing and Analysis of Articular Cartilage Sliding against Metal for Implants

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are now available for the shoulder, hip, ankle and the first metatarsalphalangeal joint. While providing pain reduction and clinical improvement, progressive degenerative changes of the opposing cartilage are observed in many patients. The mechanisms leading to this damage are not fully understood. This protocol describes a tribological experiment to simulate a metal-on-cartilage pairing and comprehensive analysis of the articular cartilage. Metal implant material is tested against bovine osteochondral cylinders as a model for human articular cartilage. By applying different loads and sliding speeds, physiological loading conditions can be imitated. To provide a comprehensive analysis of the effects on the articular cartilage, histology, metabolic activity and gene expression analysis are described in this protocol. The main advantage of tribological testing is that loading parameters can be adjusted freely to simulate in vivo conditions. Furthermore, different testing solutions might be used to investigate the influence of lubrication or pro-inflammatory agents. By using gene expression analysis for cartilage-specific genes and catabolic genes, early changes in the metabolism of articular chondrocytes in response to mechanical loading might be detected.

This protocol describes the preparation, biotribological testing, and analysis of osteochondral cylinders sliding against metal implant material. Outcome measures included in this protocol are metabolic activity, gene expression and histology.

Test biotribologici e analisi della cartilagine articolare scivolando contro il metallo per impianti

Osteochondral defects in middle-aged patients might be treated with focal metallic implants. First developed for defects in the knee joint, implants are ...

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR model induction and its readouts in both mice and rats. Retinal neovascularization is induced in OIR by exposing rodent pups either to hyperoxia (mice) or alternating levels of hyperoxia and hypoxia (rats). The primary readouts of these models are the size of neovascular (NV) and avascular (AVA) areas in the retina. This preclinical in vivo model can be used to evaluate the efficacy of potential anti-angiogenic drugs or to address the role of specific genes in the retinal angiogenesis by using genetically manipulated animals. The model has some strain and vendor specific variation in the OIR induction which should be taken into consideration when designing the experiments.

Oxygen-induced retinopathy (OIR) can be used to model ischemic retinal diseases such as retinopathy of prematurity and proliferative diabetic retinopathy and to serve as a model for proof-of-concept studies in evaluating antiangiogenic drugs for neovascular diseases. OIR induces robust and reproducible neovascularization in the retina that can be quantified.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 million patients worldwide. It leads to a decrease in retinal pigment epithelium (RPE)-synthesized neuroprotective factors, e.g., pigment epithelium-derived factor (PEDF) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), followed by the loss of RPE cells, and eventually photoreceptor and retinal ganglion cell (RGC) death. We hypothesize that the reconstitution of the neuroprotective and neurogenic retinal environment by the subretinal transplantation of transfected RPE cells overexpressing PEDF and GM-CSF has the potential to prevent retinal degeneration by mitigating the effects of oxidative stress, inhibiting inflammation, and supporting cell survival. Using the Sleeping Beauty transposon system (SB100X) human RPE cells have been transfected with the PEDF and GM-CSF genes and shown stable gene integration, long-term gene expression, and protein secretion using qPCR, western blot, ELISA, and immunofluorescence. To confirm the functionality and the potency of the PEDF and GM-CSF secreted by the transfected RPE cells, we have developed an in vitro assay to quantify the reduction of H2O2-induced oxidative stress on RPE cells in culture. Cell protection was evaluated by analyzing cell morphology, density, intracellular level of glutathione, UCP2 gene expression, and cell viability. Both, transfected RPE cells overexpressing PEDF and/or GM-CSF and cells non-transfected but pretreated with PEDF and/or GM-CSF (commercially available or purified from transfected cells) showed significant antioxidant cell protection compared to non-treated controls. The present H2O2-model is a simple and effective approach to evaluate the antioxidant effect of factors that may be effective to treat AMD or similar neurodegenerative diseases.

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

We present a protocol for the development and use ofan oxidative stress-model by treating retinal pigment epithelial cells with H2O2, analyzing cell morphology, viability, density, glutathione, and UCP-2 level. It is a useful model to investigate the antioxidant effect of proteins secreted by transposon-transfected cells to treat neuroretinal degeneration.

Induzione e analisi dello stress ossidativo nelle cellule epiteliali del pigmento retinico umano trasforato dalla bella addormentata nel bosco

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to differentiate into all types of retinal cells, even mini-retinal tissues, hold huge promises for patients with these diseases and many opportunities in disease modeling and drug screening. However, the induction process from hPSCs to retinal cells is complicated and time-consuming. Here, we describe an optimized retinal induction protocol to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency, suitable for various human pluripotent stem cells. This protocol is performed without the addition of retinoic acid, which benefits the enrichment of cone photoreceptors. The advantage of this protocol is the quantification of EB size and plating density to significantly enhance the efficiency and repeatability of retinal induction. With this method, all major retinal cells sequentially appear and recapitulate the main steps of retinal development. It will facilitate downstream applications, such as disease modeling and cell therapy.

Here we describe an optimized retinal organoid induction system, which is suitable for various human pluripotent stem cell lines to generate retinal tissues with high reproducibility and efficiency.

Sistema di induzione organoide retinica per la derivazione di tessuti retinici 3D da cellule staminali pluripotenti umane

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These conditions include retinitis pigmentosa (RP) and advanced forms of age-related macular degeneration (AMD), such as geographic atrophy (GA). Together, these disorders represent a significant proportion of currently untreatable blindness globally. These unmet medical needs have generated heightened academic interest in developing methods of RPE replacement. Among the animal models commonly utilized for preclinical testing of therapeutics, the non-human primate (NHP) is the only animal model that has a macula. As it shares this anatomical similarity with the human eye, the NHP eye is an important and appropriate preclinical animal model for the development of advanced therapy medicinal products (ATMPs) such as RPE cell therapy.
This manuscript describes a method for the submacular transplantation of an RPE monolayer, cultured on a polyethylene terephthalate (PET) cell carrier, underneath the macula onto a surgically created RPE wound in immunosuppressed NHPs. The fovea-the central avascular portion of the macula-is the site of the greatest mechanical weakness during the transplantation. Foveal trauma will occur if the initial subretinal fluid injection generates an excessive force on the retina. Hence, slow injection under perfluorocarbon liquid (PFCL) vitreous tamponade is recommended with a dual-bore subretinal injection cannula at low intraocular pressure (IOP) settings to create a retinal bleb. 
Pretreatment with an intravitreal plasminogen injection to release parafoveal RPE-photoreceptor adhesions is also advised. These combined strategies can reduce the likelihood of foveal tears when compared to conventional techniques. The NHP is a key animal model in the preclinical phase of RPE cell therapy development. This protocol addresses the technical challenges associated with the delivery of RPE cellular therapy in the NHP eye.

The non-human primate (NHP) is an ideal model for studying human retinal cellular therapeutics due to the anatomical and genetic similarities. This manuscript describes a method for submacular transplantation of retinal pigment epithelial cells in the NHP eye and strategies to prevent intraoperative complications associated with macular manipulation.

Trapianto di epitelio pigmentato retinico in un modello di primati non umani per malattie degenerative della retina

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...