Ricerca riportata in questa pubblicazione è sostenuta dall&#39;Ufficio Air Force di ricerca scientifica di base dell&#39;iniziativa di Grant FA9550-12-1-0464.

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+virtual+ground+to+control+transmembrane+voltages+and+measure+bilayer+currents+in+serial+arrays+of+droplet+interface+bilayers.">The use of virtual ground to control transmembrane voltages and measure bilayer currents in serial arrays of droplet interface bilayers.</a> SMART MATER STRUCT. 22, 094023 (2013).</li><li>Sarles, S. A., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-inspired+electroactive+polymer+materials+incorporating+biomolecular+materials.">Cell-inspired electroactive polymer materials incorporating biomolecular materials.</a> SPIE Smart Structures and Materials+ Nondestructive Evaluation and Health Monitoring. , 797626 (2011).</li><li>Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-actuated+nanovalve+derived+from+a+channel+protein.">A light-actuated nanovalve derived from a channel protein.</a> Science. 309, 755-758 (2005).</li><li>Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensitive+Channels+Activity+in+a+Droplet+Interface+Bilayer+System.">Mechanosensitive Channels Activity in a Droplet Interface Bilayer System.</a> MRS Proceedings. 1621, (2014).</li><li>Fox, R. O., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+voltage-gated+ion+channel+model+inferred+from+the+crystal+structure+of+alamethicin+at+1.5-&#8491;+resolution.">A voltage-gated ion channel model inferred from the crystal structure of alamethicin at 1.5-&#8491; resolution.</a> Nature. 300, 325-330 (1982).</li><li>Iwamoto, M., Oiki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+Bubble+Bilayers+with+Flush+Drainage.">Contact Bubble Bilayers with Flush Drainage.</a> Sci Rep. 5, (2015).</li><li>Barriga, H. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mechanosensation significa una delle prime vie di trasduzione sensoriale che si sono evoluti negli organismi viventi. L&#39;utilizzo di questo fenomeno per lo studio e la comprensione delle proprietà meccano-elettrica del DIB, è un passo cruciale verso materiali stimoli-reattiva funzionali. Essa implica l&#39;incorporazione e l&#39;attivazione di un canale meccanosensibili, MscL, nel DIB come trasduttore mechanoelectrical e un estensimetro per rilevare aumento tensione nell&#39;interfaccia doppio strato lipidico. In un&#39;altra nota, la funzione di canali SM potrebbe essere regolata tramite le proprietà del materiale di base di bistrati lipidici, quali spessore, curvatura intrinseca e compressibilità. Alla luce di quanto sopra, la tecnica basata micropipetta-fornisce un valido strumento che consente al ricercatore la capacità di studiare canali MS in DIB e fornisce lo studio della struttura del doppio strato lipidico, nonché le interazioni proteina-lipide. Negli ultimi tre decennios, patch-clamp era il metodo primario per studiare canali MS, in quanto consente di bloccaggio sia tensione e tensione. Tuttavia, patch-clamp richiede attrezzature ingombranti e non adatto per la miniaturizzazione, una proprietà necessaria per la progettazione di dispositivi sensoriali e di conversione. DIB per la loro semplicità, stabilità, e compattezza rappresentano un ambiente adatto per studiare l&#39;attività di MscL. Qui, estendiamo precedenti progressi nelle tecniche di formazione DIB proponendo una tecnica basata micropipetta-, con la capacità di controllare la dimensione delle goccioline e l&#39;interfaccia doppio strato, la composizione chimica di ogni goccia, e la tensione all&#39;interfaccia attraverso la stimolazione dinamica. La tecnica consiste di ancorare goccioline acquose, contenente proteoliposomi, fino alla punta delle coassiale opposte capillari di vetro. Le goccioline sono poste in un bagno di solvente organico e quando vengono portate in contatto un doppio strato lipidico forme all&#39;interfaccia. Le micropipette sono collegati a poscillatori iezoelectric, permettendo lo spostamento orizzontale delle goccioline. Dinamicamente comprimendo le goccioline, determina un aumento della tensione interfacciale all&#39;interfaccia olio acqua e quindi un aumento della tensione doppio strato. Due importanti aspetti differenziano questo metodo dal simile e recentemente pubblicato contatto bolla doppio strato (CBB) tecnica 37. Utilizzando la tecnica qui presentata, la dimensione del doppio strato è controllato usando micromanipolatori e quindi i volumi delle goccioline rimangono costanti, a differenza del metodo CBB. Inoltre, la tecnica CBB richiede pompe a pressione, che non sono necessari nel metodo presentato in questo documento rendendo più semplice e più facile da costruire. Possiamo incorporare e stimolare batterica MscL per la prima volta senza l&#39;uso di una pipetta patch o modificazioni chimiche 38. Poiché il sistema facilita la formazione di robuste membrane asimmetriche doppio strato lipidico, imita più da vicino il lasimmetria IPID trovato nelle membrane biologiche. Questo ci permette di studiare gli effetti di composizione della membrana controllato o asimmetria sull&#39;attività di MscL. Inoltre, attraverso tecniche di elaborazione delle immagini, questo metodo permette di stimare la tensione all&#39;interfaccia doppio strato. Questa tecnica aiuta a comprendere i principi di interconversione tra le forze di massa e di superficie nel DIB, facilita le misure delle proprietà di membrana fondamentali, e migliora la comprensione della risposta MscL a membrana tensione. Anche se questo metodo ci porta un passo avanti verso un sistema materiale stimoli-responsive biomolecolari e ad un ambiente fisiologico diverso per studiare MscL, vi sono limitazioni al sistema. Tensione in questo sistema non può essere bloccato a causa della presenza del serbatoio lipidi in forma di liposomi in ogni goccia, che tende per alleviare la tensione all&#39;interfaccia acqua / olio. Pertanto, attualmente i canali meccanosensibili può essere stimolatoin DIB solo in un regime dinamico. La presenza di bolle d&#39;aria nel sistema influenza significativamente la precisione e la riproducibilità degli esperimenti. Le bolle d&#39;aria presenti nel idrogel potrebbe provocare perdita se il collegamento elettrico. Mentre si descrive l&#39;uso del metodo basato micro-pipetta per la stimolazione della MscL, la tecnica potrebbe essere utilizzata per studiare altri tipi di canali SM e ha il potenziale per essere utilizzato dai ricercatori per studiare una varietà di biomolecole. Per esempio, configurazione simile è stata utilizzata nel nostro laboratorio per studiare la risposta mechanoelectrical di un&#39;interfaccia gocciolina membrana a doppio strato libero-channel. Varie proteine ​​potrebbero essere ricostituito e attivate con questa configurazione altamente controllato, prendendo in considerazione che gli ambienti di ricostituzione di ogni biomolecole variano. Il metodo descritto in questo articolo tocca una potenziale applicazione notevolmente più ampio che è limitato solo alla fantasia del ricercatore.

Negli ultimi dieci anni, il montaggio di doppi strati lipidici artificiali è stata sostanzialmente avanzato attraverso lo sviluppo del metodo di doppio strato di interfaccia delle gocce. Conosciuto come stabile e robusto, DIB si imposero come sistemi modello alternativi alla classica dipinta (Mueller) e piegati bistrati (Montal-Mueller) planari 1. Anche se l&#39;idea di utilizzare gocce per creare doppi strati lipidici risale al 1960 2, non ha guadagnato la popolarità fino a tempi recenti. Il primo tentativo di successo è stato segnalato dal gruppo Takeushi 3, seguito da diversi studi che dimostrano formazione doppio strato utilizzando una rete di goccioline dal gruppo Bayley 4-6. Più recentemente, tecniche di incapsulamento sono stati proposti dal gruppo Leo 7-9, che ha introdotto il concetto di usando DIB come elementi costitutivi di nuovi sistemi materiali stimoli-reattiva 10. In studi precedenti, DIB hanno dimostrato la loro capacità di rispondere alle elettrica 9,11, chemiCal 10,12, e ottica 13 stimoli. Vari biomolecole con diverse funzionalità stimoli-reattiva sono stati effettivamente stimolato quando ricostituita nel DIB 10,14. Alla luce di questi tentativi riusciti una domanda importante è sollevata: potrebbe rispondono DIB di stimolo meccanico quando biomolecole appropriate sono incorporati? Le forze interfacciali che agiscono su un DIB differiscono da quelli degli altri 15,16 sistema doppio strato. Pertanto, la tensione nel doppio strato in possesso delle goccioline potrebbe essere controllata regolando la tensione alle interfacce acqua-lipide-olio; un concetto non applicabile con i sistemi doppio strato dipinti o piegati. Canali MscL, notoriamente conosciuto come valvole di rilascio osmolyte e gli elementi fondamentali della membrana citoplasmatica dei batteri, reagiscono ad un aumento della tensione della membrana 17,18. In caso di shock ipo-osmotico, più canali residente nella membrana di una piccola cella 19 può generare un masrisposta permeabilità sive di rilasciare rapidamente ioni e piccole molecole, salvando i batteri da lisi 20. Biofisico, MscL è ben studiato e caratterizzato in primo luogo attraverso la patch clamp prominente tecnica 21-23. Modelli strutturali affidabili che spiegano il meccanismo di gating 24,25 del MscL sono proposti in base alla struttura del suo omologo di cristallo 26,27, modellando 28, e risultati di un&#39;ampia sperimentazione 24,29-31. Sotto una tensione applicata di ~ 10 mN / m, il canale chiuso che consiste in uno stretto fascio di eliche transmembrana, si trasforma in un anello di eliche fortemente inclinate formando un ~ 28 Å di riempimento d&#39;acqua dei pori conduttivo 21,24,32. È stato anche dimostrato che l&#39;idrofobicità del cancello stretto, posizionato all&#39;intersezione dei domini TM1 interne, determina la soglia di attivazione del canale 33. Corrispondentemente, si è constatato che diminuendo la idrofobicità del cancello, la tension soglia potrebbe essere abbassata 22. La struttura, di MscL reso possibile la progettazione di varie valvole controllabili 34, principalmente per motivi di consegna della droga. Per tutte le proprietà di cui sopra e in base al suo ruolo fondamentale di tradurre membrana cellulare tensioni eccessive in attività elettrofisiologiche, MscL rende una grande misura come trasduttore mechanoelectrical in DIB. In questo articolo, vi presentiamo un metodo basato micropipetta-originale per formare DIB e misurare l&#39;attività dei canali MscL incorporati sotto stimolazione meccanica. Segnaliamo per la prima volta, la risposta di DIB di stimolo meccanico e la ricostituzione funzionale del mutante V23T a bassa soglia di MscL in DIB 35. Il sistema sperimentale è costituito da lipidi incassato goccioline acquose ancorate alla punta delle due opposte micropipette vetro borosilicato. Quando le goccioline vengono portati a contatto un&#39;interfaccia doppio strato lipidico è foconfermate. Questa tecnica offre il controllo sulla composizione chimica e le dimensioni di ogni goccia (bulk), nonché le dimensioni dell&#39;interfaccia doppio strato. Inoltre, le membrane asimmetriche con varie composizioni lipidiche in ciascun foglio potrebbero essere facilmente formate. Avere uno dei micropipette collegati ad un attuatore piezoelettrico armonica, fornisce la possibilità di applicare un ciclo singolo preprogrammato o stimolo oscillatorio. La tensione è consegnato alla membrana artificiale attraverso la compressione dei due goccioline sostengono. Come risultato della gocciolina deformazione, le aree di interfacce aumento acqua-lipide-olio, e contemporaneamente l&#39;angolo tra le goccioline diminuisce, causando un aumento della tensione della membrana e l&#39;attivazione transiente MscL. Attraverso l&#39;analisi delle forme delle goccioline durante la deformazione, la tensione creata all&#39;interfaccia potrebbe essere stimato. Anche se l&#39;attenzione in questo articolo è sulle proprietà meccano-trasduzione del DIB, abbiamo anche sottolineare che altri tipi di biomolecole, come alameticina, possono essere attivati ​​da questa piattaforma multifunzionale. Presentiamo qui, tutti gli aspetti tecnici della preparazione, assemblaggio, e prendendo le misure con questo nuovo metodo in modo step-by-step.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850356P</td>
			<td>Purchased as lyophilized powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>34-gauge microfil</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF24G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>400 mL Centrifuge bottels</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3141</td>
			<td>Nalgene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz</td>
			<td>Keysight Technologies</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillian</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1760</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti&#174; Mini-Extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Scope.A1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam HSm</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B Amplifier&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Pierce&#160;</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator</td>
			<td>Digi-Key</td>
			<td>BK4017B-ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>7 Spectra/Por</td>
			<td>132113</td>
			<td>MWCO 8000, 7.5 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DigiData 1440A system</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPhPC</td>
			<td>Avanti</td>
			<td>850356C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-625 PZT Servo-Controller&#160;</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>E-526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC System</td>
			<td>Pharmacia Biotech</td>
			<td>-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>9535-33</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexadecane, 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>544-76-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homoginizer</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357426</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>17886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRGACURE&#174; 2959</td>
			<td>IRGACURE&#174;</td>
			<td>555047962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopore Membrane Filters&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>VCTP02500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl Alcohol</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH1133-4LP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7100</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimble-Chase</td>
			<td>Kontes</td>
			<td>420401-1515</td>
			<td>Flex-Column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED-100 UV Spot Curing System</td>
			<td>Electro-Lite, corp.</td>
			<td>81170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manual Patch-Clamp Micromanipulators</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>PCS-520N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>M33</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holder&#160;</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MEH1S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette Puller</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>P-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS, minimum 99.5% titration</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1254-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Gas</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>EMD</td>
			<td>SX0420-1</td>
			<td>ACS Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni NTA agarose beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1000632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2&#34; OD x 2&#34; ID</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>8486K545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator</td>
			<td>Physik Instrumente</td>
			<td>P-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>456-9033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M&#174; All-Purpose Laboratory Film</td>
			<td>Parafilm&#174;</td>
			<td>PM999</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>15178-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk</td>
			<td>Sterlitech Corporation</td>
			<td><a href="http://www.sterlitech.com/filters/membrane-disc-filters/polycarbonate-membranes/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filters/hydrophilic-polycarbonate-membrane-filter-pctb0425100.html">PCTB0425100</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves&#160;</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>CA89-38-272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replacement Gasket 1.0mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>GO1-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silver wire</td>
			<td>GoodFellow</td>
			<td>147-346-94</td>
			<td>Different diameters could be used depending on the application&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>21610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test tubes</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14-961-27</td>
			<td>12 x 130 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracal 30K</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC803024</td>
			<td>Amicore Ultra 30 MWCO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Light-Duty Tissue Wipers</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>82003-820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>13089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purifier</td>
			<td>Barnstead</td>
			<td>D11931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>BP1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-octylglucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>O311S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multifunctional, micropipette-based method for incorporation and stimulation of bacterial mechanosensitive ion channels in droplet interface bilayers

MscL, un canale meccanosensibili grande conduttanza (MSC), è una valvola di rilascio osmolyte onnipresente che aiuta i batteri sopravvivono shock ipo-osmotico bruschi. E &#39;stato scoperto e rigorosamente studiato con la tecnica del patch-clamp per quasi tre decenni. Il suo ruolo essenziale di tradurre tensione applicata alla membrana cellulare in risposta permeabilità rende un candidato forte per funzionare come un trasduttore mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari basati sulle membrane artificiali. Servire come elementi costitutivi di tali dispositivi, doppi strati di interfaccia gocciolina (DIB) possono essere utilizzati come una nuova piattaforma per l&#39;integrazione e la stimolazione dei canali MscL. Qui, si descrive un metodo basato micropipetta a formare DIB e misurare l&#39;attività dei canali MscL incorporati. Questo metodo consiste di goccioline lipidiche acquose-incassato ancorati alle estremità delle due opposte (coassialmente) posizionate micropipette vetro borosilicato. Quando le goccioline vengono portati a contatto, un&#39;interfaccia doppio strato lipidico èformata. Questa tecnica offre il controllo sulla composizione chimica e la dimensione di ogni gocciolina, nonché le dimensioni dell&#39;interfaccia doppio strato. Avere uno dei micropipette collegati ad un attuatore piezoelettrico armonico fornisce la capacità di fornire uno stimolo oscillatorio desiderato. Attraverso l&#39;analisi delle forme delle goccioline durante la deformazione, la tensione creata all&#39;interfaccia può essere stimata. Usando questa tecnica, viene riportata la prima attività di canali in un sistema MscL DIB. Oltre canali MS, attività di altri tipi di canali possono essere studiate usando questo metodo, dimostrando la multifunzionalità di questa piattaforma. Il metodo qui presentato permette di misurare proprietà di membrana fondamentale, fornisce un maggiore controllo sulla formazione delle membrane simmetrici e asimmetrici, ed è un modo alternativo per stimolare e studiare canali meccanosensibili.

Figure 1 e 2 mostra la configurazione e attrezzature sperimentale utilizzato per registrare l&#39;attività della proteina in corso di stimolazione meccanica della membrana doppio strato lipidico. Per ridurre al minimo il rumore elettrico nelle nostre misurazioni, la workstation viene collocato all&#39;interno di una gabbia di Faraday laboratorio artigianale, a terra per un collegamento a terra sul Axopatch 200 B amplificatore. La formazione di una stabile isolante doppio strato lipidico è un passo fondamentale in questo studio. In questa disposizione, un monostrato lipidico assembla all&#39;interfaccia olio / acqua delle goccioline acquose immersi in un bagno di un solvente organico. Quando le goccioline sono posti in contatto, l&#39;olio in eccesso viene eliminato, e monostrati lipidici opposti fino ad una spessa due molecola doppio strato lipidico. La tecnica più comunemente usata nella caratterizzazione doppio strato è voltage-clamp. Con tensione-clamp, la tensione attraverso il doppio strato è mantenuta ad un valore costante mentre la corrente viene misurata. Figura 4 </strong&gt; ritrae un tipico registrazione corrente in tempo reale della formazione doppio strato iniziale. Conoscendo la capacità specifica (~ 0,6 mF / cm 2) 5 del doppio strato lipidico DPhPC, l&#39;area del doppio strato formato potrebbe essere calcolato. L&#39;area doppio strato può essere controllato variando la posizione delle gocce (Figura 4A). Utilizzando l&#39;attuatore piezoelettrico, diversi tipi di forme d&#39;onda (sinusoidale, quadra, triangolare, ecc.) A diverse frequenze, ampiezze, e cicli di lavoro possono essere applicate alle goccioline di orizzontalmente ed assialmente li oscillano e, quindi, la tensione doppio strato e la zona potrebbero essere alterati (Figura 4B). Quando il DIB è stimolato meccanicamente, pur mantenendo un potenziale DC costante attraverso la membrana, una bassa soglia (guadagno di funzione) V23T mutante di MscL genera attività affidabili compresi gli stati principalmente sub-conduttivi ed eventi di apertura occasionalmente completi (figura 5) . Questi evEnt sono identici a quelli registrati con la tecnica del patch-clamp da intatte interne membrane di E. coli e liposomi ricostituiti con la V23T purificato MscL. I risultati in figura 5 dimostrano che gating si verifica in risposta ad un aumento della tensione, poiché tutti picchi di corrente sono osservati a compressione picco. A compressione picco, l&#39;espansione areale relativa delle goccioline è massima e quindi, la tensione all&#39;interfaccia è massima. Alameticina, un canale ionico voltaggio-dipendenti e uno dei peptidi più studiati, aumenta la permeabilità della membrana quando viene applicata una tensione continua attraverso la membrana 36. La capacità dell&#39;interfaccia doppio strato lipidico per ospitare proteine ​​transmembrana e peptidi è anche testato eseguendo registrazioni corrente-tensione gating utilizzando alameticina peptide. Alameticina viene miscelato con la soluzione fosfolipide ad una concentrazione finale di 100 ng / ml. La Figura 6 mostra le misure di corrente sotto<html> morsetto di tensione (115 mV). Le goccioline in questo esperimento sono allontanati per conseguire piccola interfaccia doppio strato e quindi una maggiore resistenza e minore capacità. Il comportamento gating del peptide alameticina si manifesta attraverso i passi discreti di corrente (Figura 6). L&#39;istogramma sul lato destro del grafico mostra le variazioni di conduttanza dal livello di base (0.0962 nS), che è sostanzialmente il primo livello di conduttanza del canale stesso. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig1.jpg" /> Figura 1:. Uno schema che descrive le parti principali e le dimensioni del serbatoio dell&#39;olio Il serbatoio dell&#39;olio è fabbricato in officina al Virginia Tech. È costituito da un tubo acrilico cilindrica lavorata incollata alla superficie di un foglio acrilico. Le dimensioni e il design possono essere modificati per ospitare diverse applicazioni o più di due micropipette./53362/53362fig1large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig2.jpg" /> Figura 2:. Experimental setup e micropipette preparazione (A) La workstation standard per formare meccanicamente stimolante, e caratterizzare i bistrati interfaccia comprende un microscopio, manipolatori 3 assi, una fotocamera digitale, oscillatore piezoelettrico, tavolo isolamento dalle vibrazioni, e una gabbia di Faraday (non mostrato). (B) L&#39;apparato sperimentale è costituito da due opposti PEG-DMA idrogel riempita micropipette posizionati orizzontalmente all&#39;interno di un bagno d&#39;olio Esadecano. Ciascuna delle micropipette contiene un elettrodo Ag / AgCl per fornire collegamento elettrico. Un terzo micropipetta riempito con proteoliposome soluzione viene utilizzata per formare le goccioline sulla punta delle altre micropipette. (C) La risposta attuale DIB potrebbe essere misuratautilizzando una combinazione dell&#39;amplificatore cerotto e il sistema di acquisizione dati a basso rumore. (D) Un chiuso immagine che mostra le goccioline acquose formate sulla punta delle micropipette. Elettrodi (E) Ag / AgCl sono fatti immergendo la punta di due 250 micron fili d&#39;argento in candeggina. Gli elettrodi vengono poi alimentati attraverso due capillari di vetro borosilicato riempiti con PEG-DMA idrogel, che viene curato con luce UV a solidificare. Un supporto microelettrodo diritto con connettore maschio viene utilizzato per collegare una delle micropipette al headstage dell&#39;amplificatore patch. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig3.jpg" /> Figura 3:. Immagini che illustrano la formazione di bistrati interfaccia gocciolina (A) A 10 micron micropipetta riempito con proteoliposomi è posizionato sotto il microscopio in prossimità delle punte micropipetta. Utilizzando una siringa collegata alla micropipetta, dispensare piccoli volumidei proteoliposomi per formare goccioline sferiche a volume desiderato. Lasciate che il modulo monostrato, consentendo le goccioline di sedersi per dieci minuti. Portare le goccioline in contatto; il doppio strato formerà dopo tutto l&#39;olio all&#39;interfaccia è eliminato. (B) Mentre il doppio strato è formato, la composizione chimica su entrambi i lati della interfaccia potrebbe essere controllata iniettando chimici desiderati utilizzando una micropipetta micro dimensioni. (C) Le goccioline al momento del primo contatto. (D) Le goccioline quando si forma il doppio strato lipidico. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig4.jpg" /> Figura 4: tempo reale misurazioni mostrano sia il diradamento iniziale e successiva espansione dell&#39;interfaccia (A) Corrente misurata nel corso della formazione di doppio strato attraverso l&#39;applicazione di un potenziale elettrico triangolare.. L&#39;entità della corrente misurata è direttamente proporzionale alla Capacitanza, e così l&#39;area dell&#39;interfaccia doppio strato. Più le goccioline sono riuniti, maggiore è l&#39;area dell&#39;interfaccia e viceversa. (B) In applicazione di eccitazione meccanica, l&#39;area dell&#39;interfaccia doppio strato aumenta e diminuisce con la stessa frequenza del segnale di stimolazione. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53362/53362fig5.jpg" /> Figura 5:. Misurazioni in tempo reale mostrano la risposta del doppio strato all&#39;eccitazione meccanica e il gating del mutante V23T di MscL La forma della risposta corrente è sinusoidale, che si riferisce ad una variazione sinusoidale in bistrato capacità come risultato di la modifica dell&#39;area doppio strato. I picchi di corrente, che si verificano al picco di ciascun ciclo, indicano sub-conduttanza gating del mutante V23T. Un diagramma polare indica inoltre che gating verifica a compressione di picco, che riflette un aumento della tensione all&#39;interfaccia doppio strato. Figura 6:. Misure di corrente sotto tensione morsetto e corrispondente istogramma dei livelli di conduttanza per l&#39;attività di controllo dell&#39;immagine canali alameticina incorporati Il comportamento gating del peptide alameticina è mostrato attraverso l&#39;aumento graduale discreta corrente. I livelli di conduttanza abbinano molto bene con le misurazioni precedenti eseguite dal nostro gruppo di ricerca al Virginia Tech 7.

Watch this Scientific Journal Video about Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers at JoVE.

Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

Canali meccanosensibili batteriche possono essere usati come trasduttori mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari. Bistrati interfaccia Droplet (DIB), cellula di ispirazione blocchi di costruzione di tali dispositivi, rappresentano nuove piattaforme per incorporare e stimolare canali meccanosensibili. Qui, dimostriamo un nuovo metodo basato micropipetta-di formare DIB, permettendo lo studio di canali meccanosensibili sotto stimolazione meccanica.

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

MscL, a large conductance mechanosensitive channel (MSC), is a ubiquitous osmolyte release valve that helps bacteria survive abrupt hypo-osmotic shocks. ...

multifunctional-micropipette-based-method-for-incorporation

Research

JoVE Journal

Biology

10.7K Views.  Virginia Polytechnic Institute and State University.  Canali meccanosensibili batteriche possono essere usati come trasduttori mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari. Bistrati interfaccia Droplet (DIB), cellula di ispirazione blocchi di costruzione di tali dispositivi, rappresentano nuove piattaforme per incorporare e stimolare canali meccanosensibili. Qui, dimostriamo un nuovo metodo basato micropipetta-di formare DIB, permettendo lo studio di canali meccanosensibili sotto stimolazione meccanica. 

Video: Multifunctional, Micropipette-based Method for Incorporation And Stimulation of Bacterial Mechanosensitive Ion Channels in Droplet Interface Bilayers

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDI Preparazione del campione: il metodo ultra sottile strato

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Ricerca

Biologia

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Patch di registrazione pinza dei canali ionici Espressa in ovociti di Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp e Tecniche di perfusione per la valutazione dei canali ioni Espresso in Xenopus Ovociti

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers such as epithelia also form a barrier that separates the inside from the outside or different compartments of multicellular organisms. A key feature of these barriers is the differential distribution of ions across cell membranes or cell layers. Two properties allow this distribution: 1) membranes and epithelia display selective permeability to specific ions; 2) ions are transported through pumps across cell membranes and cell layers. These properties play crucial roles in maintaining tissue physiology and act as signaling cues after damage, during repair, or under pathological condition. The ion-selective self-referencing microelectrode allows measurements of specific fluxes of ions such as calcium, potassium or sodium at single cell and tissue levels. The microelectrode contains an ionophore cocktail which is selectively permeable to a specific ion. The internal filling solution contains a set concentration of the ion of interest. The electric potential of the microelectrode is determined by the outside concentration of the ion. As the ion concentration varies, the potential of the microelectrode changes as a function of the log of the ion activity. When moved back and forth near a source or sink of the ion (i.e. in a concentration gradient due to ion flux) the microelectrode potential fluctuates at an amplitude proportional to the ion flux/gradient. The amplifier amplifies the microelectrode signal and the output is recorded on computer. The ion flux can then be calculated by Fick&#8217;s law of diffusion using the electrode potential fluctuation, the excursion of microelectrode, and other parameters such as the specific ion mobility. In this paper, we describe in detail the methodology to measure extracellular ion fluxes using the ion-selective self-referencing microelectrode and present some representative results.

Transporters in cell membranes allow differential segregation of ions across cell membranes or cell layers and play crucial roles during tissue physiology, repair and pathology. We describe the ion-selective self-referencing microelectrode that allows the measurement of specific ion fluxes at single cells and tissues in vivo.

Misurazione della extracellulare Ion Flussi Utilizzando il ionoselettivo autoreferenziale microelettrodo Tecnica

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

Determinazione del relativo cellulari di superficie e di espressione totale di canali ionici ricombinante in citometria a flusso

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...