Semplice produzione interna di colonne capillari ad altissime prestazioni con l'approccio FlashPack. L'obiettivo di questa procedura è quello di introdurre un protocollo ottimizzato per l'imballaggio di colonne capillari ad altissime prestazioni e veloce per l'analisi proteomica LC-MS. La moderna proteomica si basa sulla spettrometria di massa accoppiata con cromatografia liquida capillare ad altissime prestazioni.
La separazione peptidica avviene principalmente in colonne capillari con un diametro interno di 75 micrometri. Alla pari con i prodotti commerciali, è possibile preparare internamente colonne capillari. Le colonne preparate su misura dimostrano qualità di separazione simili alle analogie commerciali, risparmiando un sacco di denaro e consentendo la personalizzazione delle dimensioni delle colonne e delle colonne.
Qui dimostriamo una procedura di imballaggio ottimizzata per la produzione interna di colonne capillari, che chiamiamo FlashPack. L'idea alla base dell'ottimizzazione è quella di imballare da una concentrazione di liquame assorbente molto elevata, pur utilizzando la stessa comune configurazione di imballaggio della bomba a pressione da 100 bar. Ciò richiede la continua rottura dei cluster assorbenti, che si formano attorno all'ingresso della colonna ad alta concentrazione assorbente e impediscono al nuovo materiale assorbente di entrare nel capillare.
Tecnicamente, otteniamo questo utilizzando una barra magnetica come un martello, riscaldando e spostando costantemente intorno al capillare all'interno del filo assorbente. FlashPack applicato correttamente aumenta la velocità di imballaggio fino a 10 volte. Ciò lo rende adatto per l'imballaggio di assorbenti ad altissime prestazioni di dimensioni micrometriche più morbide e per la produzione di colonne molto lunghe fino a un metro di lunghezza in tempi ragionevoli.
La procedura di preparazione delle colonne consiste in cinque passaggi. Tre fasi preparatorie, che includono l'assemblaggio della stazione di imballaggio e la preparazione di liquami capillari e assorbenti. Quindi il capillare viene prima imballato nella bomba a pressione a 60-100 bar di pressione.
Segue il collegamento del capillare imballato al sistema HPLC, l'imballaggio dell'assorbente ad alta pressione e il taglio a colonna alle dimensioni. La procedura FlashPack richiede modifiche da apportare ai passaggi tre e quattro del protocollo comune. Prima di tutto, prepariamo una stazione di imballaggio.
È costituito da un serbatoio di gas azoto con almeno 50 bar di pressione di uscita. Il serbatoio è collegato alla valvola di sfiato della bomba a pressione, che viene posizionata nell'agitatore magnetico. L'uscita della valvola di sfiato viene inserita in una bottiglia d'acqua attraverso uno stretto ID PEEK capillare, che consente un controllo fine sulla depressurizzazione.
Successivamente, prepariamo un capillare. L'imballaggio può essere fatto sia in un capillare fritto con una fritta di vetro integrata formata da Kasil e formammide. Un'altra opzione è quella di imballare in un capillare tirato preparato da un estrattore laser sutter.
Il capillare deve essere reso da 10 a 15 centimetri più lungo della lunghezza della colonna prevista. Il seguente video è preparato sull'esempio di un imballaggio capillare emettitore tirato. Proteggere un'estremità dell'emettitore tirato con una punta della pipetta di caricamento del gel tagliata.
Per i dettagli, vedere la versione testuale del manoscritto. La fase successiva è la preparazione del liquame assorbente. In primo luogo, mettere circa 50 milligrammi di assorbente secco in un tubo di centrifuga da 1,5 millilitro.
Questa sarà una fiala assorbente di riserva. Questo video è stato preparato con l'uso di Reprosil Pur C18 AQ 1.9 micro metric sorbente del Dr.Maisch. Aggiungere un millilitro di metanolo nel flaconcino assorbente di riserva.
Vortice per 10 secondi. E sonicare in un bagno di sonicazione per altri 10 secondi. Lasciare che l'assorbente si impregni accuratamente per 20-30 minuti, quindi vortice e sonicarlo ancora una volta.
Preparare un flaconcino assorbente funzionante. Deve essere una fiala conica inferiore che si inserisce nella bomba. Può essere un altro tubo della centrifuga da 1,5 millilitteri o qualsiasi altra fiala a seconda del particolare design della bomba a pressione.
Usiamo un tubo conico conico con tappo a vite tagliato all'altezza della bomba a pressione. Sospendere di sospendere il sorbente nel flaconcino assorbente di serie e trasferire 500 microlitri nel flaconcino assorbente funzionante insieme a una barra magnetica di due per tre millimetri. Completare la fiala di lavoro a un millilitro con metanolo.
Lasciare riposare il flaconcino funzionante sul tavolo per 10 minuti affinché il assorbente si depositi per gravità. Il risultato di questo passaggio deve essere un flaconcino conico inferiore con lo strato inferiore di assorbente sciolto alto circa quattro millimetri. Se lo strato è troppo basso e un po 'più assorbente dal flaconcino di riserva.
Pertanto, il flaconcino funzionante preparato è destinato alla preparazione di più colonne per mesi. Se il flaconcino assorbente funzionante rimane senza mescolare per più di due ore, deve essere vorticoso, sonicato e nuovamente regolato per gravità prima dell'imballaggio. Quando tutto è pronto, procedi alla fase quattro, imballando la bomba a pressione.
Indossare sempre occhiali protettivi quando si lavora con capillari di silice fusi e la bomba a pressione. Allo stesso tempo, i guanti protettivi non sono raccomandati. Riducono notevolmente il senso del tatto necessario per una corretta gestione dei capillari di piccolo diametro e portano a errori.
Posizionare la fiala assorbente nella bomba a pressione e fissare saldamente tutti i nodi. Inizia la rotazione da 60 a 100 colpi al minuto, inserisci il capillare dell'emettitore fritto o tirato nella bomba. Spingilo fino al fondo della fiala, quindi sollevalo fino a due o tre millimetri e fissa il nodo.
Applicare la forza minima richiesta per fissare il capillare. Controllare che il capillare sia fissato correttamente. Deve essere impossibile spostare il capillare estraendolo a mano.
Molto lentamente, apri la valvola della bomba a pressione mantenendo l'estremità aperta del capillare puntata lontano dal viso. Guarda le fasi iniziali del processo di imballaggio. Subito dopo la pressurizzazione, l'assorbente riempie il capillare e diventa non trasparente per tutta la lunghezza.
Non appena l'assorbente inizia a impacchettarsi all'interno dell'estremità distale, la contropressione aumenta, il flusso rallenta e il liquame assorbente uniforme all'interno del capillare si riforma in diversi pacchetti assorbenti, separati da spazi liberi assorbenti. Il assorbente già confezionato è visibile come una regione densamente colorata in continua crescita. Mantenere le regioni riempite di assorbente ad almeno il 70% della lunghezza capillare con piccoli spazi liberi assorbenti per l'intera durata del processo di imballaggio.
Ci sono diversi problemi comuni da tenere d'occhio durante il processo di imballaggio. Richiedono la regolazione della configurazione in volo per mantenere un'efficiente consegna assorbente nel capillare. Il problema più frequente è quando il nuovo assorbente smette di entrare nel capillare mentre il assorbente già all'interno continua a muoversi.
Nella maggior parte dei casi, l'ingresso capillare viene bloccato da cluster assorbenti autoaggreganti. Applica questi passaggi uno per uno fino a quando il flusso assorbente non viene ripristinato, quindi salta il resto dei passaggi relativi al problema. Aumentare la velocità di rotazione a 500 colpi al minuto e ridurla immediatamente a 60 giri/min.
Il più delle volte ripristina il flusso assorbente. Controllare che la velocità di rotazione sia di almeno 60 RPM per il resto del processo di imballaggio. Se non aiuta, sfiatare brevemente la bomba da imballaggio e pressurizzarla immediatamente indietro.
Se non aiuta, o il blocco si verifica di nuovo, riposizionare il capillare all'interno dello strato assorbente. L'assenza del sorbente può essere dovuta al fatto che l'estremità aperta capillare è troppo alta sopra la barra magnetica, quindi l'estremità della colonna non la tocca. Oppure il capillare è posizionato troppo in basso e si attacca al fondo della fiala.
In primo luogo, sfiatare completamente la bomba, quindi allentare il dado, spingere il capillare verso il basso, quindi tirarlo indietro di due millimetri. Fissare il dado. Aprire la valvola per pressurizzare la bomba e continuare a imballare.
Maggiori dettagli sui problemi di imballaggio sono descritti nella versione testuale del metodo. Continua a imballare la colonna fino a raggiungere la lunghezza della colonna target più cinque o sette centimetri. Fermare la rotazione e depressurizzare molto lentamente la bomba.
Apri un po 'la valvola della bomba e attendi che la bolla scoppi all'interno della bottiglia d'acqua si plachi. Quindi aprire la valvola un po 'più ampia e attendere nuovamente che la bolla scoppi rallenti. Pertanto, in fasi incrementali, rilasciare la pressione fino a quando nessun gas esce dalla valvola.
Non aprire la valvola fino in fondo in una sola volta. Porterà a gorgogliare all'interno del capillare e il sorbente tornerà nella fiala. Se ciò accade, fai pressione sulla bomba e attendi che la colonna si impacchetta di nuovo.
Quando il gas smette di uscire dalla valvola di sfiato, togliere il capillare imballato dalla bomba a pressione. Non lasciare asciugare la colonna. Se non è collegato immediatamente al sistema HPLC per un ulteriore imballaggio, mettere il capillare imballato in stoccaggio immergendolo intero in una soluzione di etanolo al 10%.
Le colonne HPLC disconnesse vengono archiviate nello stesso modo. Se non è previsto altro imballaggio per oggi, esponi la fiala assorbente dalla bomba e chiudila saldamente. Conservalo per ulteriormente l'imballaggio della colonna.
Fase cinque, impacchettamento HPLC. Collegare il capillare imballato al sistema HPLC tramite connessione HPLC. Avviare il flusso di solvente organico elevato.
Regolare il flusso in base alla lunghezza imballata mirando a circa 300 bar. Per capillari imballati di 40 centimetri utilizzare la portata di 200-300 litri normali al minuto. Guarda il sorbente sciolto all'interno del capillare che viene imballato, aggiungendo alla lunghezza totale dell'imballaggio.
Senza interrompere il flusso, immergere il corpo della colonna due volte nel bagno di sonicazione. È importante immergere solo una parte del corpo della colonna. Non immergere le estremità delle colonne e le connessioni capillari.
Quando il letto assorbente smette di restringersi, immergere il corpo della colonna nel bagno di sonicazione due volte di più senza interrompere il flusso. Eseguire la colonna per altri 10 minuti a 300 barre. Arrestare il flusso, attendere che la pressione scenda al di sotto di tre bar e scollegare la colonna.
Ispezionare visivamente la colonna per la mancanza di spazi vuoti e scolorimenti. Se ne vengono trovati, la sonicazione sotto il flusso può essere ripetuta. Per gli esperimenti critici, prendi in considerazione la possibilità di creare una nuova colonna.
Tagliare la colonna alla lunghezza desiderata. Il taglio eseguito correttamente è un prerequisito per l'efficienza della colonna. Fai una tacca in rivestimento in poliammide con lo scriba.
Rompere parzialmente il capillare e separare due pezzi. Lucidare il front-end della colonna su un wafer ceramico o con pellicola di lappatura. Ricollegare la colonna al sistema LC utilizzando una connessione ad altissima pressione.
Avviare la portata di lavoro al 2% B. La portata di lavoro viene regolata in base ai parametri della colonna. Ad esempio, le colonne ID da 100 micrometri vengono eseguite a 500 nanolitri al minuto.
Attendere che la pressione si equilibra e controllare la retropressione della colonna. Una colonna opportunamente preparata conferisce una pressione proporzionale alla sua lunghezza e alle sue caratteristiche assorbenti. Ad esempio, la colonna capillare di 30 centimetri imballata con assorbente di due micrometri ha una contropressione da 450 a 500 bar al 2% di solvente B.Se la colonna prodotta fornisce una contropressione entro l'intervallo previsto, è pronta per l'uso.
Se la retropressione è ben al di fuori dell'intervallo previsto, qualcosa non va nella colonna o nel sistema LC. L'imballaggio con FlashPack produce un capillare confezionato per 50 centimetri con assorbente da 1,9 micrometri in meno di un'ora a pressione di imballaggio di 100 bar. Ad esempio, produciamo una colonna id ultra ad altissima pressione da 30 centimetri e 100 micrometri imballata in un capillare emettitore tirato con assorbente ReprosilPur C18 AQ da 1,9 micrometri.
L'imballaggio è stato fatto a 60 barre in capillare emettitore tirato lungo 50 centimetri. Il capillare è stato imballato a 40 centimetri in 40 minuti con un po 'più di assorbente all'interno del capillare non imballato. Il capillare imballato era collegato al sistema HPLC e funzionava a 300 nanolitri al minuto con solvente B, che nel nostro caso era 80% acetonitrile, 0,1% acido formico.
La lunghezza finale imballata era di 43 centimetri. La colonna è stata tagliata di 30 centimetri. Con un flusso di lavoro di 500 nanolitri al minuto con il 99% di solvente B, la colonna ha dato la contropressione di 275 bar, che è vicina al valore atteso.
Per testare la colonna, abbiamo separato 50 fmol di un digest triptico della proteina del citocromo C in un gradiente di 15 minuti dal 2-50% B. I picchi cromatografici erano altamente simmetrici con un minimo di coda. La media FWHM era di circa tre secondi.
Il protocollo descritto è in grado di produrre colonne UHPLC in un comune imballaggio da 100 bar impostato in tempi ragionevoli. Le colonne HPLC o UPLC corte possono essere imballate in pochi minuti, mentre le colonne lunghe di 30-50 centimetri sono imballate in meno di un'ora. Il metodo è efficiente per impacchettare assorbenti con RP e qualsiasi altra chimica in qualsiasi DOCUMENTO di iD di colonna.
Le colonne prodotte sono riproducibilmente efficaci quanto qualsiasi altra colonna commerciale di dimensioni e parametri assorbenti simili.
