Questo protocollo delinea un metodo altamente riproducibile per valutare funzionalmente e molecolarmente la segnalazione Wnt paracrina non canonica in qualsiasi popolazione cellulare di interesse. Le valutazioni funzionali e molecolari vengono eseguite nella stessa popolazione cellulare e possono essere applicate per studiare qualsiasi componente della via Wnt/PCP. Per iniziare, risospendere la cella C2C12 precedentemente pellettata in 10 millilitri di mezzo C2C12.
Per diluire le cellule nel rapporto di 1:20, aggiungere 0,5 millilitri di sospensione cellulare in un tubo da 15 millilitri contenente 9,5 millilitri di terreno C2C12 fresco e mescolare delicatamente con una pipetta sierologica usando una pipetta P1000, aggiungere un millilitro della sospensione cellulare diluita a ciascun pozzetto di un nuovo pozzetto a quattro camere e posizionarlo nell'incubatore. Per placcare gli inserti delle cellule O9-1, risospendere il pellet cellulare O9-1 in 10 millilitri di terreno di coltura O9-1. E simile alla diluizione delle cellule C2C12, diluire le cellule O9-1 nel rapporto di 1:20.
Quindi, posizionare un singolo inserto permeabile all'interno di ciascun pozzetto di un nuovo pozzo a quattro camere riempito con un millilitro di terreno di coltura O9-1. Aggiungere 300 microlitri di sospensione di cella O9-1 diluita a ciascun inserto e assicurarsi che l'inserto sia completamente sommerso. Quindi incubare il pozzo a 37 gradi Celsius.
Per eseguire il knockdown del siRNA nelle cellule O9-1, diluire il siRNA e il reagente di trasfezione nel mezzo sierico ridotto secondo le raccomandazioni del produttore alle concentrazioni desiderate. Mescolare delicatamente il siRNA diluito e il reagente di trasfezione e incubare la miscela a temperatura ambiente per sette minuti. Dopo 18-24 ore di placcatura cellulare, aggiungere i complessi lipidici siRNA agli inserti cellulari O9-1 e incubare per circa 34-48 ore.
Quando le cellule raggiungono il 70-80% di confluenza, rimuovere bene il mezzo dalla camera C2C12 e lavare le cellule una volta con PBS. Dopo aver rimosso il PBS, iniziare a grattare le celle facendo passare saldamente la punta di una pipetta P10 sterile in un'unica direzione per coprire l'intera lunghezza o larghezza del monostrato cellulare. Una volta che le celle sono graffiate, aggiungere rapidamente un millilitro di PBS.
Quindi, accendere il computer e il microscopio. Posizionare la slitta della camera sul palco e ruotare la manopola dell'obiettivo fino all'ingrandimento 5X. Aprire il software di imaging.
Fare clic sulla scheda della fotocamera, quindi fare clic sul pulsante Live per visualizzare le celle nella scheda AxioCam IC. Assicurarsi che il filtro luce sia tirato completamente verso l'esterno per consentire alla luce di passare alla fotocamera e allo schermo del computer, spostare o ruotare manualmente la slitta della camera per posizionare l'area della ferita al centro dell'immagine live nella scheda IC di AxioCam. Per scattare immagini, fare clic su Snap per aprire una nuova scheda accanto alla scheda AxioCam IC che contiene l'immagine.
Per salvare questa immagine fissa, fare clic sul file, selezionare Salva con nome, selezionare desktop sulla barra a sinistra per salvare il file sul desktop, inserire il nome del file nella casella Nome file e salvare la figura in formato file CZI. Per salvare l'immagine come file tiff, fare clic su file, selezionare Salva con nome, immettere il nome del file nella casella Nome file. Fare clic sul pulsante Salva come tipo e selezionare tiff dal menu a discesa.
Riposizionare manualmente il vetrino della camera per scattare altre due o tre immagini in altri punti della ferita nello stesso pozzetto. Dopo l'imaging, rimuovere il PBS da ciascun pozzetto e aggiungere un millilitro di mezzo C2C12. Assemblare il sistema di co-coltura degli inserti del pozzo posizionando manualmente gli inserti contenenti le celle O9-1 in ciascun pozzetto del pozzetto della camera.
Spingere delicatamente gli inserti verso il basso nel pozzetto, in modo che il fondo dell'inserto si trovi appena sopra le celle C2C12 sottostanti. Restituire i costrutti dell'inserto del pozzo all'incubatore e consentire alle celle di migrare per un totale di nove a 12 ore. Per determinare il tempo di migrazione ottimale, controllare le cellule sei ore dopo la creazione della ferita, quindi ogni due o tre ore dopo.
Termina l'esperimento quando le cellule in condizioni di controllo coprono completamente la ferita. Iniziare la terminazione del test di migrazione e inserire bene la decostruzione del sistema rimuovendo gli inserti della cella O9-1 dopo nove o 12 ore del periodo di migrazione. Aspirare con cautela il mezzo C2C12.
Aggiungere 0,5 millilitri di PBS ai pozzetti della camera e prendere le immagini finali delle cellule dopo la migrazione. Aspirare con cura tutto il PBS miscelato con il mezzo e rimuovere le camere di plastica dai pozzetti della camera utilizzando le istruzioni del kit. Lasciando la diapositiva sottostante contenente le celle C2C12.
Per l'immunocolorazione, incubare immediatamente il vetrino con aldeide paraforme al 4% per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la paraformaldeide e lavare il vetrino con Triton X-100 contenente PBST allo 0,1% per 15 minuti a temperatura ambiente. Dopo 15 minuti, versare PBST e lavare il vetrino due volte con PBS per 10 minuti ciascuno.
Quindi creare un bordo idrofobico con una penna idrofobica attorno al vetrino per evitare che le soluzioni fuoriescano dal vetrino impedendo l'interruzione delle celle di aderenza. Quindi, aggiungere circa 0,5 millilitri di soluzione bloccante BSA all'1% al vetrino all'interno del confine idrofobico e incubare il vetrino per un'ora a temperatura ambiente in una camera di vetrino umidificata. Alla fine dell'incubazione, rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere l'anticorpo falloidina a questo vetrino all'interno del confine idrofobico e incubare a quattro gradi Celsius durante la notte.
Il giorno successivo, posizionare il vetrino in un supporto per vetrini protetto dall'esposizione alla luce. Lavare le cellule tre volte con PBS per 10 minuti ciascuna a temperatura ambiente. Aggiungere un mezzo di montaggio contenente DAPI, montare i vetrini con vetrini di copertura e acquisire le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza standard.
Nel presente studio, l'aggiunta di Wnt5a ricombinante ai pozzi di co-coltura ha accelerato la migrazione dei mioblasti con il recupero completo di alcune aree di nove ore. I mioblasti migratori in tutte e tre le condizioni mostravano una normale morfologia cellulare migratoria, tra cui filopodi e lamellipodi ben formati e sporgenti e polarizzazione asimmetrica delle proiezioni citoscheletriche dell'actina. È stato studiato l'effetto paracrino di Wnt5a derivato da NCC sulla migrazione dei mioblasti.
Il trattamento con siRNA nanomolare 50 contro Wnt5a ha ridotto l'espressione genica di Wnt5a del 64% rispetto al controllo negativo. La migrazione delle esplosioni di C2C12 miglia con significativamente ridotta in seguito all'abbattimento di Wnt5a nelle NCC e l'aggiunta di Wnt5a ricombinante esogeno hanno salvato questo deficit migratorio e difetto morfologico in questi mioblasti. Al fine di comprendere meglio i meccanismi cellulari di ricezione del segnale nel modello paracrino, il recettore ROR2 è stato abbattuto e l'espressione genica è stata ridotta del 54%Il knockdown di ROR2 nei mioblasti riduce la loro capacità migratoria nonostante la presenza di NCC.
Il ricombinante esogeno Wnt5a non è riuscito a salvare la migrazione dei mioblasti dopo il knockdown di ROR2, suggerendo che la deplezione di ROR2 interrompe la capacità dei mioblasti di ricevere segnali Wnt5a. Le cellule di coltura a densità adeguata graffiano con punta P10 solo una volta assemblate e smontate il sistema di co-coltura con cura senza interrompere la cellula sottostante. Questa tecnica è stata utilizzata come prova di concetto per studiare uno specifico asse di segnalazione molecolare all'interno del complesso percorso Wnt / PCP con rilevanza per la biologia delle cellule della cresta neurale e del secondo campo cardiaco.
