Supportato da NIH concedere R01HL105635 a SEJ. Gli autori desiderano ringraziare Diego V. Bohórquez consulenza tecnica. Ringraziamo anche R. Ian Cumming per l&#39;assistenza tecnica e l&#39;esecuzione della citometria a flusso al Duke Vaccine umana Research Institute citometria a flusso Shared Resource Facility (Durham, NC). La citometria a flusso è stato eseguito nel Laboratorio biocontenimento regionale presso la Duke, che ha ricevuto il supporto parziale per la costruzione dal National Institutes of Health, National Institute of Allergy e Malattie infettive (UC6-AI058607).

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della Duke University. 1. intranasale Amministrazione di Fast Blue Per Fast Blue, amministrare il colorante almeno 2 giorni prima eutanasia il mouse. Il colorante persisterà fino a otto settimane. <ol><li> Anestetizzare il mouse con l&#39;anestesia per inalazione di luce (2,5% sevoflurano) fino a quando inizia a rallentare la respirazione. </li><li> Utilizzare una pipetta 200 ml con punte filtrati per infondere lentamente 40 ml di soluzione colorante (0.4 mm Fast Blue, 1% dimetilsolfossido, saline DMSO, in tampone fosfato, PBS) nella narice, fermandosi di tanto in tanto per garantire il mouse è aspirando la soluzione (Figura 1A). </li><li> Tenere il mouse verticalmente, testa alta, e massaggiare delicatamente il petto per garantire il colorante si diffonde in tutto i polmoni. </li></ol> 2. Preparati sulla dissezione e analisi Giorno <ol><li> Preparare 10 ml0; gangli dissociazione Solution (GADS) mediante la combinazione di ingredienti come specificato nella tabella 1. </li><li> Eseguire l&#39;estrazione di RNA in una zona laboratorio dedicato. Prima di iniziare l&#39;esperimento, superfici pulite con etanolo al 70%, 10% di candeggina, e RNasi reagente decontaminazione. Questo include la centrifuga RNA, eventuali portaprovette e pipette. Assicurarsi che ci sono scatole di punta filtro dedicato per solo uso di RNA. Non utilizzare questa apparecchiatura e l&#39;area per la preparazione del DNA, in modo da contaminare i campioni. </li><li> Mescolare fresco 70%, e l&#39;80% di etanolo con acqua RNase-free. Preparare 1 ml per campione da utilizzare per l&#39;estrazione di RNA. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ingrediente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> Avanzate DMEM / F12 </td><td> 9,5 ml </td></tr><tr><td> glutammina </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> HEPES (10 mM) </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> supplemento N2 </td><td> 100 pl </td></tr><tr><td> B27 (senza vitamina A) </td><td> 200 ml </td></tr><tr><td> NGF (50 ug / ml) </td><td> 10 microlitri </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Miscela reagente per gangli dissociazione Solution (GADS). 3. Procedura Dissection <ol><li> Riempire provette da 1,5 ml con 500 microlitri GADS, uno per ciascun campione sperimentale, uno per un controllo di smistamento positivo, ed uno per un controllo di smistamento negativo. conservare le provette su ghiaccio durante la dissezione. </li><li> Sezionare il ganglio nodoso e fare due tagli parziali per facilitare la dissociazione, poi metterlo nel tubo campione sperimentale. Si prega di fare riferimento al seguente protocollo di Giove per la dissezione dei gangli nodose 16 e 17 DRG. </li><li> Sezionare e parzialmente tagliato gangli-etichettato, come il gangli spinali (DRG), per i controlli di ordinamento. Utilizzare due gangli per il controllo positivo e due gangliuna per il controllo negativo. </li><li> Per ottenere neuroni nodose sufficienti per l&#39;ordinamento di successo, unire gangli da 5 topi in un tubo campione sperimentale contenenti GADS. </li></ol> 4. sensoriale gangli Dissociazione <ol><li> Pipetta fuori 500 GADS microlitri, lasciando gangli nel tubo. Lavare gangli volta aggiungendo 1 ml di PBS, attendere gangli di depositarsi sul fondo del tubo, poi pipetta su PBS. </li><li> Aggiungere 1 ml GADS e 22 pl di digestione enzimatica (collagenasi I / II e mix proteasi, 2,5 mg / ml in H 2 O) ad ogni provetta. </li><li> Aggiungere 20 ml Fast Blue (5,26 mm) per la provetta di controllo positivo. </li><li> Mettere le provette a bagnomaria o riscaldamento blocco già a 37 ° C. Nota: Il tempo di digestione gangli dipende dall&#39;età della digestione enzimatica. Entro 1 mese di dissolvere l&#39;enzima digestione, digerire per 30 minuti, entro 2 - 6 mesi digerire per 45 min. Se l&#39;enzima è più di 6 mesi di età, digerire gangli fo 60 min. </li><li> Ogni 15 min tubi Agitare brevemente e flick loro per garantire gangli sono coperti dalla soluzione. </li><li> Mentre gangli vengono digeriti, preparare gradienti di densità utilizzando una soluzione di particelle (particelle di silice colloidale rivestite con polivinilpirrolidone). <ol><li> Mescolare soluzione particella% 12 in GADS, 500 microlitri per campione. </li><li> Mescolare soluzione particella% 28 in GADS, 500 microlitri per campione. </li><li> Lentamente e con attenzione aggiungere 400 microlitri soluzione di densità 12% sulla sommità della soluzione densità 400 microlitri 28% in una provetta da 1,5 ml fresco per ciascun campione. Non permettere che i due strati per mescolare. Due strati distinti devono essere visibili nel tubo; uno più scura dell&#39;altra. </li></ol></li><li> Mentre gangli vengono digeriti, etichettare nuovi tubi da 1,5 ml di raccolta per l&#39;ordinamento (un tubo Fast Blue positivo e uno negativo Fast Blue per campione di ordinamento). A seconda dei requisiti di smistamento impianto, questi tubi devono avere coperchi amovibili in modo da non interferireE Con ​​il cell sorter. </li><li> Dopo il tempo di digestione appropriata, rimuovere GADS con l&#39;enzima digestione e lavare gangli due volte con 1 ml di PBS. Aggiungere 200 ml di GADS freschi ad ogni provetta. </li><li> Utilizzare una pipetta 200 microlitri, impostato a 100 volumi microlitri, e pipetta gangli su e giù parecchie volte per rompere le cellule a parte. Ripetere l&#39;operazione fino a quando si vede nessun pezzo di tessuto intatto. Evitare di creare bolle nella soluzione. </li><li> Passare cellule dissociate attraverso un colino cella di 70 micron. </li><li> Aggiungere altri 100 microlitri GADS al tubo di dissociazione originale per raccogliere tutte le cellule rimanenti randagi a sinistra e passare la soluzione aggiuntiva attraverso il filtro delle cellule. Utilizzando un nuovo puntale, raccogliere qualsiasi liquido cellule contenenti residuo che è passata attraverso il filtro e aggrappato alla maglia. Il volume finale di cellule sospese in GADS è di 300 microlitri. </li><li> strato attentamente le 300 microlitri di cellule sulla parte superiore del gradiente di densità fatta in precedenza. Evitare di bolle e la miscelazione di cells con gli strati densità. </li><li> Centrifugare per 10 minuti a 2.900 xg a temperatura ambiente. </li><li> Mentre le cellule sono nella centrifuga, miscela tampone di lisi (1 ml per campione sperimentale) come segue: 10 microlitri 2-mercaptoetanolo in 1 ml Buffer RLT (dal kit di estrazione di RNA). <ol><li> Aggiungere 300 ml di tampone di lisi tubo di raccolta positivo Blu Veloce e 600 ml di tubo Fast Blue negativo di raccolta (tubi etichettati dal punto 4.7). Questo volume dipende dal numero di celle previste da raccogliere. Per &lt;2.000 cellule, aggiungere 300 ml, per&gt; 7.000 cellule aggiungono 600 ml. Ciò garantirà la selezione fluido di trasporto non diluire in modo significativo il tampone di lisi. </li></ol></li><li> Una volta che la centrifugazione, rimuovere con cautela ed eliminare lo strato superiore ml 700. Questo livello contiene la maggior parte dei detriti cellulari che altrimenti interferire con l&#39;ordinamento delle cellule. </li><li> Aggiungere 700 microlitri GADS freschi alla cella rimanente contenente soluzione e pipettaTE su e giù più volte per mescolare. </li><li> Centrifugare per 15 minuti a 2.900 xg per far sedimentare le cellule. </li><li> Mentre le cellule sono nella centrifuga, mescolare classificare GADS (500 microlitri per campione) aggiungendo 5 microlitri DNasi (10 mg / ml) per 1 ml GADS. </li><li> Una volta che la centrifugazione è fatto, rimuovere con attenzione e scartare il surnatante, lasciando il pellet. </li><li> Risospendere pellet cellulare in 200 - 300 ml di smistamento GADS pipettando su e giù con una pipetta 1000 ml impostata su 200 ml più volte. Mettere i campioni in ghiaccio. Le cellule sono ora pronti per essere ordinati. </li></ol> 5. fluorescenza cellulare attivato (FAC) Ordinamento Nota: questa sezione richiede la conoscenza operativa di un sorter FACS o l&#39;assistenza di personale specializzato. <ol><li> Aggiungere 1 ml soluzione madre ioduro di propidio (PI) (50 mg / ml) per ogni campione per verificare la vitalità cellulare. Split controllo negativo in 2 tubi, uno con e uno senza PI. PI lega il DNA solo nelle cellule morte. Sedopo le prime specie non ci sono le cellule morte per etichetta, non è necessario l&#39;uso di PI. </li><li> Cellule di trasporto di citometria a flusso strumento, ad es., BD FACS AriaII che esegue il software Diva 8, sul ghiaccio. </li><li> Poiché la dimensione della cella è variabile in questa popolazione, utilizzare un ugello grande (100 micron) per l&#39;ordinamento. Per ridurre la quantità di stress dell&#39;esperienza cellule e aumentare la vitalità cellulare utilizzare bassa pressione (20 psi). </li><li> Utilizzare il software selezionatrice FACS per impostare le trame analisi, scatter in avanti, lato scatter (SSC), Fast Blue, e PI, se necessario. </li><li> Per ri-sospendere le cellule, Agitare delicatamente brevemente il campione prima di caricarla nel sorter. </li><li> Iniziare con il controllo negativo, non Fast Blue o PI, per impostare la soglia di gate (Figura 2A). Questo determina la quantità di autofluorescenza nella popolazione di cellule. Opzionale: Eseguire l&#39;esempio negativo con PI per identificare se c&#39;è una popolazione di cellule morte. </li><li> Ordina il campione di controllo positivo (incubated con Fast Blu), per impostare i parametri di compensazione. </li><li> Una volta che i cancelli ed i parametri sono impostati, iniziare l&#39;ordinamento dei campioni sperimentali. I campioni vengono ordinati nei tubi di raccolta preparati contenenti tampone di lisi RNA. </li><li> I campioni ordinati in ghiaccio fino a quando l&#39;ordinamento delle cellule è completa. </li><li> Iniziare fase di estrazione di RNA subito dopo che le cellule sono ordinati. </li></ol> 6. RNA Estrazione <ol><li> Vortex cellule ordinati in tampone di lisi per 1 minuto per omogeneizzare. </li><li> Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% e mescolare pipettando su e giù diverse volte. </li><li> Trasferire fino a 700 ml di campione in una colonna di spin. Centrifugare per 15 sec a 8.000 x g. Gettare il flow-through. <ol><li> Ripetere finché il volume totale del campione attraverso la colonna di spin. </li></ol></li><li> Aggiungere 350 microlitri Buffer RW1 e continuare il processo di purificazione dell&#39;RNA, comprendente la fase di trattamento DNasi, secondo protoco del produttorel per le cellule. </li><li> Una volta RNA è stato estratto, per verificare la qualità RNA utilizzando un sistema di elettroforesi microfluidica secondo le specifiche del costruttore. </li></ol>

<ol><li>Manteniotis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+RNA-Seq+Expression+Analysis+of+Sensory+Ganglia+with+a+Focus+on+Ion+Channels+and+GPCRs+in+Trigeminal+Ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive RNA-Seq Expression Analysis of Sensory Ganglia with a Focus on Ion Channels and GPCRs in Trigeminal Ganglia.</a> PLoS One. 8 (11), 1-30 (2013).</li>
<li>Vandewauw, I., Owsianik, G., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+quantitative+mRNA+expression+analysis+of+TRP+channel+genes+at+the+single+trigeminal+and+dorsal+root+ganglion+level+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Systematic and quantitative mRNA expression analysis of TRP channel genes at the single trigeminal and dorsal root ganglion level in mouse.</a> BMC Neurosci. 14 (1), 21(2013).</li>
<li>Paintal, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+sensory+receptors+and+their+reflex+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Vagal sensory receptors and their reflex effects.</a> Physiol Rev. 53 (1), 159-227 (1973).</li>
<li>Springall, D. R., Cadieux, A., Oliveira, H., Su, H., Royston, D., Polak, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+tracing+shows+that+CGRP-immunoreactive+nerves+of+rat+trachea+and+lung+originate+from+vagal+and+dorsal+root+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Auton+Nerv+Syst%22%5BJournal%5D)">Retrograde tracing shows that CGRP-immunoreactive nerves of rat trachea and lung originate from vagal and dorsal root ganglia.</a> J Auton Nerv Syst. 20 (2), 155-166 (1987).</li>
<li>Ricco, M. M., Kummer, W., Biglari, B., Myers, A. C., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interganglionic+segregation+of+distinct+vagal+afferent+fibre+phenotypes+in+guinea-pig+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interganglionic segregation of distinct vagal afferent fibre phenotypes in guinea-pig airways.</a> J Physiol. 496 (Pt 2), 521-530 (1996).</li>
<li>Zhao, H., Sprunger, L. K., Simasko, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+transient+receptor+potential+channels+and+two-pore+potassium+channels+in+subtypes+of+vagal+afferent+neurons+in+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression of transient receptor potential channels and two-pore potassium channels in subtypes of vagal afferent neurons in rat.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298 (2), 212-221 (2010).</li>
<li>Zhuo, H., Ichikawa, H., Helke, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurochemistry+of+the+nodose+ganglion%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neurochemistry of the nodose ganglion.</a> Prog Neurobiol. 52 (2), 79-107 (1997).</li>
<li>Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+Sensory+Neuron+Subtypes+that+Differentially+Control+Breathing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vagal Sensory Neuron Subtypes that Differentially Control Breathing.</a> Cell. 161, 1-12 (2015).</li>
<li>Kaczyńska, K., Szereda-Przestaszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodose+ganglia-modulatory+effects+on+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Nodose ganglia-modulatory effects on respiration.</a> Physiol Res. 62, 227-235 (2013).</li>
<li>Taylor-Clark, T. E., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+pulmonary+oxidative+stress+by+lung+vagal+afferents%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Physiol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Sensing pulmonary oxidative stress by lung vagal afferents.</a> Respir Physiol Neurobiol. 178 (3), 406-413 (2011).</li>
<li>Bautista, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA1+mediates+the+inflammatory+actions+of+environmental+irritants+and+proalgesic+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and proalgesic agents.</a> Cell. 124 (6), 1269-1282 (2006).</li>
<li>Ichikawa, H., De Repentigny, Y., Kothary, R., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+survival+of+vagal+and+glossopharyngeal+sensory+neurons+is+dependent+upon+dystonin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The survival of vagal and glossopharyngeal sensory neurons is dependent upon dystonin.</a> Neuroscience. 137 (2), 531-536 (2006).</li>
<li>Hondoh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+expression+of+cold+receptors+%28TRPM8+and+TRPA1%29+in+the+rat+nodose-petrosal+ganglion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Distinct expression of cold receptors (TRPM8 and TRPA1) in the rat nodose-petrosal ganglion complex.</a> Brain Res. 1319, 60-69 (2010).</li>
<li>Kummer, W., Fischer, A., Kurkowski, R., Heym, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensory+and+sympathetic+innervation+of+guinea-pig+lung+and+trachea+as+studied+by+retrograde+neuronal+tracing+and+double-labelling+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The sensory and sympathetic innervation of guinea-pig lung and trachea as studied by retrograde neuronal tracing and double-labelling immunohistochemistry.</a> Neuroscience. 49 (3), 715-737 (1992).</li>
<li>Choi, D., Li, D., Raisman, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+retrograde+neuronal+tracers+that+label+the+rat+facial+nucleus%3A+A+comparison+of+Fast+Blue%2C+Fluoro-ruby%2C+Fluoro-emerald%2C+Fluoro-Gold+and+DiI%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent retrograde neuronal tracers that label the rat facial nucleus: A comparison of Fast Blue, Fluoro-ruby, Fluoro-emerald, Fluoro-Gold and DiI.</a> J Neurosci Methods. 117 (2), 167-172 (2002).</li>
<li>Calik, M. W., Radulovacki, M., Carley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+of+Nodose+Ganglia+Injection+in+Sprague-Dawley+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method of Nodose Ganglia Injection in Sprague-Dawley Rat.</a> J Vis Exp. (93), e1-e5 (2014).</li>
<li>Ramachandra, R., McGrew, S., Elmslie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+sensory+neuron+populations+for+study+of+expressed+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of specific sensory neuron populations for study of expressed ion channels.</a> J Vis Exp. (82), e50782(2013).</li>
<li>Yu, X., Hu, Y., Ru, F., Kollarik, M., Undem, B. J., Yu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM8+function+and+expression+in+vagal+sensory+neurons+and+afferent+nerves+innervating+guinea+pig+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+-+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">TRPM8 function and expression in vagal sensory neurons and afferent nerves innervating guinea pig esophagus.</a> Am J Physiol - Gastrointest Liver Physiol. 308 (6), 489-496 (2015).</li>
<li>Kwong, K., Lee, L. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PGE%282%29+sensitizes+cultured+pulmonary+vagal+sensory+neurons+to+chemical+and+electrical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">PGE(2) sensitizes cultured pulmonary vagal sensory neurons to chemical and electrical stimuli.</a> J Appl Physiol. 93 (4), 1419-1428 (2002).</li>
<li>Joachim, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+induces+substance+P+in+vagal+sensory+neurons+innervating+the+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Stress induces substance P in vagal sensory neurons innervating the mouse airways.</a> Clin Exp Allergy. 36 (8), 1001-1010 (2006).</li>
<li>Kaan, T. K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+blockade+of+P2X3+and+P2X2%2F3+receptors+attenuates+bone+cancer+pain+behaviour+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Systemic blockade of P2X3 and P2X2/3 receptors attenuates bone cancer pain behaviour in rats.</a> Brain. 133 (9), 2549-2564 (2010).</li>
<li>Nakatani, T., Minaki, Y., Kumai, M., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helt+determines+GABAergic+over+glutamatergic+neuronal+fate+by+repressing+Ngn+genes+in+the+developing+mesencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Helt determines GABAergic over glutamatergic neuronal fate by repressing Ngn genes in the developing mesencephalon.</a> Development. 134 (15), 2783-2793 (2007).</li>
<li>Lobo, M. K., Karsten, S. L., Gray, M., Geschwind, D. H., Yang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-array+profiling+of+striatal+projection+neuron+subtypes+in+juvenile+and+adult+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">FACS-array profiling of striatal projection neuron subtypes in juvenile and adult mouse brains.</a> Nat Neurosci. 9 (3), 443-452 (2006).</li>
<li>Usoskin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+classification+of+sensory+neuron+types+by+large-scale+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing.</a> Nat Neurosci. 18, 145-153 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive un metodo per indirizzare i neuroni delle vie aeree, che innervano nei gangli nodoso del nervo vago. Una volta etichettato, i gangli vengono delicatamente dissociate per conservare in modo ottimale il numero di cellule e la vitalità. Questi neuroni sono poi FAC allineati direttamente nel tampone di lisi e RNA viene estratto. Il significato di questo protocollo è la possibilità di individuare, isolare e preservare la qualità di una specifica popolazione di cellule sensoriali. L&#39;espressi...

nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi nervi afferenti si trovano nei gangli sensoriali, come la radice dorsale, trigemino, o gangli nodoso. Ogni ganglion sensoriale innerva regioni specifiche del corpo e contiene cellule che innervano organi e tessuti separati all&#39;interno di tale regione. Per esempio, i gangli delle radici dorsali (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere i processi in tutto il corpo e gli arti, mentre i gangli del trigemino si trova nel cranio, che contiene neuroni che innervano il viso, gli occhi, le meningi e vie aeree superiori 1, 2. Il gangli nodose del nervo vago è situata nel collo sotto il cranio e contiene corpi cellulari che si estendono fibre nervose in tutto il tratto gastrointestinale, cuore e basse vie aeree e dei polmoni 3. Nell&#39;uomo il ganglio nodoso sta da solo, tuttavia, nel topo è fusacon il ganglio giugulare, che innerva anche i polmoni 4. Questo ganglio fuso viene spesso chiamata la giugulare / nodoso complesso, ganglio vagale, o semplicemente nodoso ganglio 5. Qui, viene indicato come il ganglio nodoso. fibre afferenti del nodosi passano informazioni dai visceri al nucleo del tratto solitario (NTS) nel tronco cerebrale. Input sensoriale a questo ganglio unico controlla una gamma diversificata di funzioni, come la motilità intestinale 6, frequenza cardiaca 7, la respirazione 8,9, e le risposte respiratorie irritanti attivato 10,11. Con questa diversità di funzioni e organi innervati, è fondamentale per indirizzare e isolare sottopopolazioni organo-specifiche del ganglio nodoso al fine di studiare percorsi neuronali individuali. Tuttavia, date le dimensioni del nodose e il numero limitato di neuroni che contiene questo non è un compito banale. Ogni topo nodose ganglio contiene circa 5.000 neuroni 12oltre a una vasta popolazione di cellule di supporto satellite. Dei 5.000 neuroni nodose, solo 3-5% innervano le vie respiratorie. Pertanto, eventuali modifiche funzionali, morfologiche o molecolari all&#39;interno dei neuroni delle vie aeree-innervano, grazie alla stimolazione delle vie respiratorie o patologie, andranno perduti nel ganglio nodoso densamente. Per risolvere questo problema, è stato sviluppato un metodo per identificare e isolare i neuroni che innervano le vie respiratorie. Le vie aeree sono stati esposti a un colorante tracciante fluorescente per identificare le successive neuroni innervano nodoso. Fast Blue è stato preso dai neuroni e viaggia rapidamente alle loro corpi cellulari dove viene conservata per un massimo di otto settimane 13 - 15. Una volta identificato, un dolce, ma efficace, il protocollo di dissociazione è stato utilizzato per preservare l&#39;etichettatura tintura e la vitalità delle cellule per cellulare attivato fluorescente (FAC) di smistamento. Cellule separate vengono utilizzati per estrarre l&#39;acido ribonucleico di alta qualità (RNA) per determinare l&#39;espressione genica o Fo altra analisi molecolare valle. Questo protocollo fornisce una tecnica utile e robusto per isolare i neuroni sensoriali che innervano un tessuto di interesse.

<table><tbody><tr><td>Fast Blue</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>17740-2</td><td>stock 2 mg/ml in water</td></tr><tr><td>NeuroTrace 530/615 red Nissle stain</td><td>Life Technologies</td><td>N21482</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>glutamine (Glutamax)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 (no vitamin A)</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor (NGF)</td><td>Sigma</td><td>N6009</td><td>stock 50 &amp;micro;g/ml in PBS/10% FBS</td></tr><tr><td>digestion enzyme, Liberase DH Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>stock 2.5 mg/ml in water</td></tr><tr><td>particle solution (Percoll)</td><td>Sigma</td><td>P1644-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>LabNet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>RNase free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2484-100</td><td></td></tr><tr><td>RNase decontamination reagent, RNase AWAY</td><td>invitrogen</td><td>10328-011</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>EM-6010</td><td></td></tr><tr><td>RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74034</td><td></td></tr><tr><td>DNase kit, RNase-Free DNase Set</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Sigma</td><td>P4170-10MG</td><td>stock 10 &amp;micro;g/ml in PBS</td></tr><tr><td>Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200)</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a method to target and isolate airway-innervating sensory neurons in mice

nervi somatosensoriali trasdurre termica, meccanica, chimica, e stimoli nocivi causati da due agenti endogeni e ambientali. I corpi cellulari di questi neuroni afferenti si trovano all&#39;interno dei gangli sensoriali. gangli sensoriale innervano un organo specifico o porzione del corpo. Per esempio, i gangli della radice dorsale (DRG) si trovano nella colonna vertebrale e estendere processi in tutto il corpo e degli arti. I gangli del trigemino si trovano nel cranio e innervano la faccia, e le vie respiratorie superiori. afferenze vagali dei gangli nodose si estendono per tutto l&#39;intestino, cuore e polmoni. I neuroni nodose controllano una gamma diversificata di funzioni quali: frequenza respiratoria, irritazione delle vie respiratorie, tosse e riflessi. Così, per capire e manipolare la loro funzione, è fondamentale per identificare e isolare vie aeree specifiche sotto-popolazioni neuronali. Nel topo, le vie aeree sono esposti a un colorante tracciante fluorescente, Fast Blue, per il tracciamento retrograda di specifiche vie aeree nodose neuroneS. I gangli nodose sono dissociate e la fluorescenza delle cellule attivate (FAC) l&#39;ordinamento viene utilizzato per raccogliere le cellule positive colorante. Successivamente, l&#39;acido ribonucleico di alta qualità (RNA) viene estratto dalle cellule positive dye per la prossima generazione di sequenziamento. Utilizzando questo metodo vie aeree specifica espressione genica neuronale è determinata.

Utilizzando questo metodo, i neuroni delle vie respiratorie-innervano sono etichettati per via intranasale instillando Fast Blue (Figura 1A). Dopo due giorni, veloci cellule blu marcate appaiono nei gangli nodoso (Figura 1C). Queste cellule formano 3 - 5% della popolazione totale neuronale dei gangli nodose. Altri coloranti retrogrado che sono stati usati per questo scopo comprendono DII (1,1&#39;-diottadecil-3,3,3 &#39;, 3&#39;-perclorato tetramethylind...

Watch this Scientific Journal Video about A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice at JoVE.com

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...

a-method-to-target-isolate-airway-innervating-sensory-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.2K Views.  Yale University. Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

Video: A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

A Reversible, Non-invasive Method for Airway Resistance Measurements and Bronchoalveolar Lavage Fluid Sampling in Mice

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated procedures to obtain such measurements in the same animal are generally not feasible.  Here, we demonstrate protocols for obtaining from mice repeated measurements of AHR and bronchoalveolar lavage fluid samples.  Mice were challenged intranasally seven times over 14 days with a potent allergen or sham treated.  Prior to the initial challenge, and within 24 hours following each intranasal challenge, the same animals were anesthetized, orally intubated and mechanically ventilated.  AHR, assessed by comparing dose response curves of respiratory system resistance (RRS) induced by increasing intravenous doses of acetylcholine (Ach) chloride between sham and allergen-challenged animals, were determined.  Afterwards, and via the same intubation, the left lung was lavaged so that differential enumeration of airway cells could be performed.  These studies reveal that repeated measurements of AHR and BAL fluid collection are possible from the same animals and that maximal airway hyperresponsiveness and airway eosinophilia are achieved within 7-10 days of initiating allergen challenge.  This novel technique significantly reduces the number of mice required for longitudinal experimentation and is applicable to diverse rodent species, disease models and airway physiology instruments.  

Repeated measurements of rodent respiratory physiology and sampling of airway inflammatory cells are desirable, but generally not feasible. Here we describe a repeatable method for orally intubating mice that permits repeated measurements of airway hyperreactivity and sampling of airway inflammatory cells.

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Airway hyperreactivity (AHR) measurements and bronchoalveolar lavage (BAL) fluid sampling are essential to experimental asthma models, but repeated ...

Ricerca

Biologia

Facial Nerve Axotomy in Mice: A Model to Study Motoneuron Response to Injury

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and either cut or crush it to induce peripheral nerve injury. Advantages of this surgery are its simplicity, high reproducibility, and the lack of effect on vital functions or mobility from the subsequent facial paralysis, thus resulting in a relatively mild surgical outcome compared to other nerve injury models. A major advantage of using a cranial nerve injury model is that the motoneurons reside in a relatively homogenous population in the facial motor nucleus in the pons, simplifying the study of the motoneuron cell bodies. Because of the symmetrical nature of facial nerve innervation and the lack of crosstalk between the facial motor nuclei, the operation can be performed unilaterally with the unaxotomized side serving as a paired internal control. A variety of analyses can be performed postoperatively to assess the physiologic response, details of which are beyond the scope of this article. For example, recovery of muscle function can serve as a behavioral marker for reinnervation, or the motoneurons can be quantified to measure cell survival. Additionally, the motoneurons can be accurately captured using laser microdissection for molecular analysis. Because the facial nerve axotomy is minimally invasive and well tolerated, it can be utilized on a wide variety of genetically modified mice. Also, this surgery model can be used to analyze the effectiveness of peripheral nerve injury treatments. Facial nerve injury provides a means for investigating not only motoneurons, but also the responses of the central and peripheral glial microenvironment, immune system, and target musculature. The facial nerve injury model is a widely accepted peripheral nerve injury model that serves as a powerful tool for studying nerve injury and regeneration.

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Facial assotomia Nerve in topi: un modello per studiare motoneuroni risposta al danno

The goal of this surgical protocol is to expose the facial nerve, which innervates the facial musculature, at its exit from the stylomastoid foramen and ...

Medicina

Direct Visualization of the Murine Dorsal Cochlear Nucleus for Optogenetic Stimulation of the Auditory Pathway

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. Few studies have examined gene transfer to the central auditory system. The dorsal cochlear nucleus (DCN) of the brainstem, which contains second order neurons of the auditory pathway, is a potential site for gene transfer. In this protocol, a technique for direct and maximal exposure of the murine DCN via a posterior fossa approach is demonstrated. This approach allows for either acute or survival surgery. Following direct visualization of the DCN, a host of experiments are possible, including injection of opsins into the cochlear nucleus and subsequent stimulation by an optical fiber coupled to a blue light laser.&#160;Other neurophysiology experiments, such as electrical stimulation and neural injector tracings are also feasible.&#160;The level of visualization and the duration of stimulation achievable make this approach applicable to a wide range of experiments.

The goal of this protocol is to outline a surgical approach to provide direct access to the dorsal cochlear nucleus in a murine model.

Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Investigation into the use of virus-mediated gene transfer to arrest or reverse hearing loss has largely been relegated to the peripheral auditory system. ...

Neuroscienze

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

In-depth Physiological Analysis of Defined Cell Populations in Acute Tissue Slices of the Mouse Vomeronasal Organ

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory neurons (VSNs) express a specific type of G protein-coupled receptor (GPCR) from at least three different chemoreceptor gene families allowing sensitive and specific detection of chemosensory cues. These families comprise the V1r and V2r gene families as well as the formyl peptide receptor (FPR)-related sequence (Fpr-rs) family of putative chemoreceptor genes. In order to understand the physiology of vomeronasal receptor-ligand interactions and downstream signaling, it is essential to identify the biophysical properties inherent to each specific class of VSNs.
The physiological approach described here allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons using a transgenic mouse line (Fpr-rs3-i-Venus). The use of this protocol, however, is not restricted to this specific line and thus can easily be extended to other genetically modified lines or wild type animals.

Here, we describe a physiological approach that allows identification and in-depth analysis of a defined population of sensory neurons in acute coronal tissue slices of the mouse vomeronasal organ using whole-cell patch-clamp recordings.

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

In most mammals, the vomeronasal organ (VNO) is a chemosensory structure that detects both hetero- and conspecific social cues. Vomeronasal sensory ...

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to network properties. We show how to prepare viable oblique slices of the spinal cord of young mice (P2 - P11). In this preparation, the motoneurons retain&#160;their axons coming out from the ventral roots of the&#160;spinal cord. Stimulation of these axons elicits back-propagating action potentials invading the motoneuron&#160;somas and exciting the motoneuron&#160;collaterals within the spinal cord. Recording of antidromic action potentials is an immediate, definitive and elegant way to characterize motoneuron identity, which surpasses&#160;other identification methods. Furthermore, stimulating the motoneuron collaterals is a simple and reliable way to excite the collateral targets of the motoneurons within the spinal cord, such as other motoneurons or Renshaw cells. In this protocol, we present antidromic recordings from the motoneuron somas as well as Renshaw cell excitation, resulting from ventral root stimulation.

We show how to prepare oblique slices of the spinal cord in young mice. This preparation allows for the stimulation of the ventral roots.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

<meta charset="utf8"></head><body>Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Targeting dei neuroni simpatici del topo: un approccio alla simpatectomia lombare

Surgical Lumbar Sympathectomy in Mice

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays many critical roles in maintaining bodily homeostasis, but it has rarely been studied in the context of peripheral nerve injury. The extent of postganglionic sympathetic neuronal functions in distal targets in the periphery is currently unclear. To better explore the role of sympathetic innervation of peripheral targets, a surgical &#34;knock-out&#34; model provides an alternative approach. Although this can be achieved chemically, chemical destruction of postganglionic sympathetic neurons can be nonspecific and dose-dependent. The use of a surgical lumbar sympathectomy in mice, once thought to be &#34;virtually not practicable&#34; in small animals, allows for specific targeting of postganglionic sympathetic neurons that innervate the hind limbs. This manuscript describes how to surgically remove the L2-L5 lumbar sympathetic ganglia from a mouse as a survival surgery, which reliably decreases the hind paw sweat response and the number of sympathetic axons in the sciatic nerve.

Autore in primo piano: Esplorare la plasticità dei neuroni simpatici

This manuscript presents a protocol for surgically removing the postganglionic lumbar sympathetic neurons from a mouse. This procedure will facilitate a multitude of studies aimed at investigating the role of sympathetic innervation in distal tissue targets.

Simpatectomia lombare chirurgica nei topi

Peripheral nerve injuries are common, and full functional recovery after injury is achieved in only 10% of patients. The sympathetic nervous system plays ...

Un metodo per identificare e isolare Airway-innervano neuroni sensoriali nei topi

Riepilogo

Esplora Altri Video

Un reversibile, metodo non invasivo per le misure di resistenza delle vie aeree e liquido di lavaggio broncoalveolare di campionamento nei topi

Facial assotomia Nerve in topi: un modello per studiare motoneuroni risposta al danno

Visualizzazione diretta del Murine Dorsale Cochlear Nucleus per optogenetic stimolazione del percorso uditivo

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Approfondita fisiologica Analisi di popolazioni di cellule definite nel acuta del tessuto Fette del mouse Vomeronasal Organo

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

Simpatectomia lombare chirurgica nei topi

Simpatectomia lombare chirurgica nei topi