We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Das folgende Protokoll verwendet Parameter , die von den Experimenten definiert in den 4 und 6 zu Akquisitionseinstellungen und Versuchsbedingungen. Viele dieser Parameter können modifiziert werden , um andere Experimente zu passen (dh Belichtungszeiten, Binning, fluoreszierende Kanäle usw.). Alle Verfahren müssen den institutionellen Richtlinien und Vorschriften einhalten und von der institutionellen Biosicherheitskommission genehmigt werden. Mikroskop-Hersteller-Websites enthalten ausgezeichnete Informationen für Live Cell Imaging. 1. Mikroskope und Imaging Software <ol><li> Führen Sie Live-Cell-Imaging auf einer Vielzahl von invertierten Mikroskopen. Die am häufigsten verwendeten Mikroskope sind Epifluoreszenz und Spinnscheiben-konfokale Weitfeld-. Hier verwenden eine automatisierte und motorisierte Weitfeld- Epifluoreszenz-Mikroskop mit 200-Watt-Metall-Halogen-Lichtquelle. </li><li> Besorgen Sie sich eine Bühne-Top-oder Mikroskop Klimakammer. Hier verwenden, um eine Stufe-top Klimakammer. </li><li> Verwenden Sie kommerzielle Software zu betreiben Mikroskope mit Dienstprogramme Zeitraffer-Mikroskopie auszuführen. </li><li> Verwenden Sie handelsübliche Software oder ImageJ für die Bildanalyse. Viele andere Analysetools sind im Handel erhältlich, und es gibt maßgeschneiderte Programme von denen viele 8,18 veröffentlicht wurden. </li></ol> 2. Visualisierung zellulärer Prozesse und phänotypische Antworten <ol><li> Visualisieren Zellen mit Hellfeldmikroskopie. Differentialinterferenzkontrast und Phasenkontrast allein kann sehr informativ sein Antworten zu studieren, um Anti-Krebs-Medikament Antworten. Diese Prozesse können Mitose, Zellbeweglichkeit und Apoptose umfassen. </li><li> Visualisieren Zellstrukturen, Organellen und Prozesse mit Fluoreszenzbiosensoren. Fluoreszenzsonden sind informativ in bestimmten subzellulären Prozesse zu verfolgen. Diese können die Dynamik der Mikrotubuli sind, mitochondriale und endoplasmatischen Reticulum Dynamik, Proteinakkumulation und Lokalisierung, undMolekular Signalisierung (z. B. Phosphorylierung, Calcium). </li></ol> 3. Herstellung der Proben <ol><li> Wachsen Zellen in Zellkulturschalen in einer zertifizierten Standard befeuchteten Zellkulturbrutschrank (beispielsweise 37 ° C, 5% CO 2, 80% relative Luftfeuchtigkeit). <ol><li> Wachsen HT1080-Zellen in MEM mit EBSS. Ergänzen die Medien mit 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v Natriumpyruvat und 1% v / v nicht-essentiellen Aminosäuren. </li></ol></li><li> Zwei Tage vor der Bildgebung, Platte 50.000 HT1080 Fucci Zellen in 3 Vertiefungen einer 12-Well # 1.5 Glasbodenschale in einem zertifizierten sterilen Laminar-Flow-Haube. Stellen Sie die Anzahl von Zellen ausplattiert ~ 60% Konfluenz für den Beginn des Experimentes zu erreichen. Abhängig von der Zelllinie und der Natur des Experiments kann die Zelldichte geringer sein. Anmerkung: Die Zelldichte haben großen Einfluss auf das Wachstum der Zelllinie und auf den experimentellen Ergebnissen. Zählen von Zellen zu minimieren Experiment zu Experiment variability aufgrund der Dichte. <ol><li> In Abhängigkeit von der Umgebungskammer und die notwendigen Bedingungen für das Experiment, Platte Zellen in einzelnen Well-Platten (in der Regel 35- oder 60-mm), 4 gut 35-mm-Schalen, 6-, 12- oder 24-Well-Zellkulturplatten oder Deckglas-Folien in verschiedenen Formaten. Verwenden Sie Glasbodenplatten mit # 1.5 Glas, da die meisten Objektive für diese Dicke des Glases optimiert sind, und Bildgebung durch Zellkultur-Plastik ist sehr schlecht. Hinweis: Einige Zelllinien wachsen nicht und überleben auf Glas. In diesen Fällen kann das Glas , um Anhaftung zu verbessern Zelle beschichtet werden (z. B. Poly-Lysin oder Kollagen). Einige Unternehmen stellen optische Zellkultur-Plastik, muss es empirisch ermittelt werden, ob dies ein gangbarer Weg ist. </li></ol></li></ol> 4. Umweltkammer Set-up <ol><li> Vor jedem Experimentieren, Aufbau der Klimakammer , so dass es bei ~ 80% Luftfeuchtigkeit arbeitet und so die Temperatur an der Probenposition ist 37 o C. Die meisten kultivierten Zellen wachsen in 5% CO 2 / Balance Luftatmosphäre aufgrund Natriumbicarbonat - Puffer in dem Medium. Je nach Set-up : entweder die Umgebungsregler auf 5% CO 2 , und es wird zu 100% CO 2 mit Luft mischen, oder verwenden Sie vorgemischten, zertifiziert 5% CO 2 / Balance - Luft - Gas. Folgen Sie den Herstelleranweisungen für die Gasdurchflussraten. Hinweis: Einige Zelllinien wachsen in CO 2 -unabhängigen Medium in diesem Fall können sie ohne CO 2 aufrechterhalten werden. Speziell Bildmedien ist auch, dass die Zugabe von autofluoreszenten Verbindungen begrenzt. Das Wachstum in Thesen Medien für den gewünschten Zelltyp empirisch vorher bestimmt werden. </li><li> Vor der Bildgebung gewährleistet ist, der Wasserbehälter gefüllt (nach Anweisungen des Herstellers) mit sterilem destilliertem Wasser. Schalten Sie die Klimakammer auf die gewünschte Temperatureinstellung und legen Sie sie in den Mikroskoptisch Einsatz. So speichern Sie Gas, nicht anfangen, den Fluss an dieser Stelle. Hinweis: Wenn es einen freien Raum zwischen Bühne-Top-Kammer und Bühneneinsatz und / oder jede Spannung auf Verbindungskabel an die Kammer kann es Bewegungsartefakte in das Experiment vorstellen. <ol><li> Legen Sie Stücke von Paraffinfilm über die Kanten der Bühne Einstellöffnung vor die Kammer hinein zu koppeln, um die Kammer auf die Bühne Einsetzen und stellen Sie sicher, dass keine Anschlüsse an der Kammer ziehen. </li></ol></li><li> Ermöglichen die Kammer auf 37 o C äquilibrieren Achten Sie auf eine stabile Temperatur Temperaturschwankungen während der Bildgebung zu verhindern, die die Zellphysiologie beeinflussen können und Drift einzuführen. Erreichen Temperaturausgleich erfordert typischerweise 30 min bis 1 h, je nach der Umgebung. <ol><li> Legen Sie eine &quot;Dummy&quot; Schüssel mit Wasser in den Brunnen in die Kammer unter Erwärmung. Eine Abbildungsschale mit Wasser ahmt die Probe gefüllt, die Kammer hilft sicherzustellen, dass ausreichend erwärmt und stabilisiert. Füllen der Kammer mit vorgewärmten sterilem Wasserreduziert die zur Temperaturstabilisierung erforderliche Zeit minimiert und bei der Zugabe der experimentellen Probe, die die Temperaturabnahme. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskop Set-up <ol><li> Schalten Sie das Mikroskop, zugehörigen Computer, und alle erforderlichen Peripheriegeräte. <ol><li> In Abhängigkeit von der Lichtquelle, warten , um ihn einzuschalten , bis sie benötigt (z. B. LED). </li></ol></li><li> Mit dem Objektivrevolver in einer niedrigen Position, wählen Sie die 20X 0,7 NA-Objektiv verwendet werden. </li><li> Positionieren Sie die Probe auf das Ziel - das macht es einfacher, die Zellen zu finden, wenn die Probe in der Kammer ist. </li><li> Definieren Abbildungsparameter in dieser Zeit, wenn sie von früheren Experimenten bekannt sind. </li></ol> 6. Der Transport von Zellen an ein Mikroskop und in die Kammer <ol><li> Transportieren Sie die Zellen aus dem Inkubator in die Klimakammer abgebildet werden. Stellen Sie sicher , dass dies schnell getan wird , um die Auswirkungen einer vergleichsweise niedrigen CO 2 zu begrenzen , </sub&gt; Atmosphäre und verringerte Temperatur auf die Zellen. Folgen Sie alle institutionellen Biosicherheit Richtlinien für die Probentransport und clean-up im Falle eines Austretens. <ol><li> Legen Sie die Zellen in einem verschlossenen Behälter Styropor oder isolierte Tasche große Veränderungen der Umwelt zu vermeiden. </li></ol></li><li> Legen Sie die Probenabbildung Schale in die Kammer Anweisungen des folgenden Herstellers. </li><li> Nachdem die Zellen innerhalb der Klimakammer, dichten die Kammer zu halten, ein stabiles Umfeld und gleich wieder auf die Quelle (n) des atmosphärischen Gas gesichert wurden. <ol><li> Da einige Klimakammern, keine engen, versiegelte Deckel nutzen zu verzögern Verdunstung, Schicht steril, Embryo-zertifizierte Mineralöl auf der Oberseite des Wachstumsmediums. Gas-permeant Paraffinfilm Wickeln um den Umfang Kanten der Probenschale vorsichtig das Glas nicht Imaging-Bereich zu behindern. Lokalisierte können sekundäre Befeuchtung Verfahren eingesetzt werden. Kondensation auf dem Deckel der Probenschale kann perfor verringernmance von Hellfeldmikroskopie. </li></ol></li><li> Um die Auswirkungen der thermischen Drift früh während des Experiments zu minimieren, warten, 30 Minuten vor der Zeitraffer beginnen. Die benötigte Zeit hängt von Imaging-Schüssel Größe und andere Faktoren. Bestimmen Sie empirisch. </li></ol> 7. Einstellen der Imaging up <ol><li> Wählen Sie Abbildungsbedingungen, die am besten die Daten darstellen. Treffen Sie Vorkehrungen Phototoxizität zu vermeiden, indem Belichtungszeiten zu begrenzen, mit geringerer Intensität Licht und Auswahl von Sonden, die durch längere Wellenlängen des Lichts angeregt werden. </li><li> Definieren x, y und z-Ebene und der gewünschten Wellenlänge (n) für jede Position abgebildet werden. Die Zeitauflösung ist durch die Anzahl von Positionen und Wellenlängen beschränkt. Für langfristige Zeitraffer der meisten zellulären Prozesse, erwerben ein Bild alle 10 - 20 min; höhere Zeitauflösung (kurzen Intervallen, z. B. 1 min) mehr Datenpunkte liefert und damit robuster Zellverfolgung, sondern führt auch zu stärker integriertenBelichtung und größere Datenmengen. <ol><li> Als HT1080 Fucci dynamische grün und rot fluoreszierende Proteine ​​(Repräsentative Ergebnisse sehen), verwenden Sie die folgenden Belichtungszeiten: FITC / GFP - 50 ms, Texas Rot / TRITC - 40 ms, Hellfeld - 20 ms. Verwenden Sie ein 2 x 2 bin. </li></ol></li><li> Aktivieren Software gesteuert automatische Scharfeinstellung die Standardparameter in den erweiterten Einstellungen. Definieren Sie ein Autofokus-Bereich von 10 &amp; mgr; m mit der empfohlenen Schrittgröße. Achten Sie darauf, dies zu tun, bevor die Zeitraffer beginnen. Autofokus mit Hell- Bilder und nie mit Fluoreszenzphototoxizität und Photobleaching zu reduzieren. <ol><li> Softwaregesteuerte Systeme Autofokus auf jedem Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und direkt konzentrieren sich auf die Probe. Sie können jedoch die Erfassungsgeschwindigkeit des Experiments begrenzen. Hardware gesteuert Dauerfokussierart Systeme funktionieren gut für Zeitraffer-Mikroskopie und Geschwindigkeit zu verbessern, für mehr Positionen ermöglicht abgebildet oder eine höhere Rate des Erwerbs werden. Aber siestützen sich auf Detektion der Grenzfläche Luft-Glas und kann Mittelpunkt der Probe mit Variationen in der Glasdicke über die gut verlieren. </li></ol></li><li> Ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit Medien die gewünschte Wirkstoffkonzentration enthält , die auf 37 ° C erwärmt wurde Teil Medien Austausch hilft thermische Drift zu reduzieren. Die Bedingungen, die in diesem Experiment sind Vehikel (DMSO), 1 &amp; mgr; M selinexor und 10 uM PD0332991. Anmerkung: Dieser Schritt kann auch durch Anhalten und Neustarten des Experimentes nach dem Start der Übernahme erfolgen. Dies ermöglicht eine Längs Verfolgung von Pre- und Post-drug-Antworten einzelner Zellen. Wenn der Arzneimittelstabilität oder Stoffwechsel ist ein Anliegen, Pausieren und ersetzt die Medien können mit dem gleichen Verfahren durchgeführt werden. Um zu testen, für die Arzneimittel Abbau oder Metabolismus, Medien von behandelten Zellen können auch auf naive Zellen platziert werden Arzneimittelwirkung zu testen. </li><li> Starten Sie den Zeitraffer. </li><li> Da die Zeitraffer läuft, stellen Sie sicher, dass die abgebildeten Felder im Fokus bleiben und die chamber hält ein feuchtes 37 o C. <ol><li> Stellen Sie den Fokus, wie durch Anhalten der Erwerb während der Zeitabstand zwischen den Zeitpunkten benötigt. </li></ol></li><li> Falls erforderlich, fügen Sie Wasser in die Kammer bei längeren Experimenten. Vermeiden Sie die Kühlkammer durch Zugabe von vorgewärmten, steriles destilliertes Wasser bei 37 ° C </li></ol> 8. Beenden der Time-lapse <ol><li> Wenn das Experiment zu Ende ausgeführt wurde, beenden Sie den Erwerb, wenn es nicht automatisch zu stoppen, wurde eingestellt. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Zeitraffer richtig auf der Festplatte gespeichert wurde, obwohl die meisten Softwarepakete automatisch während der Aufnahme zu speichern, wenn nicht ordnungsgemäß Daten fertig verloren gehen kann. </li><li> Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop und entsorgen Sie die Zellen in biologisch gefährlichen Abfall folgende zugelassene institutionelle Biosicherheit Verfahren. </li></ol> 9. Longitudinal-Tracking und Analyse von Zeitraffer-Daten <ol><li> Wählen Sie die Methode für die Analyse, die istGeeignet für die biologischen Prozesse von Interesse. Viele Plugins für ImageJ, Programme mit Matlab und benutzerdefinierte Plattformen wurden für spezifische Anwendungen hergestellt. Die folgende Methodik umfasst Tracking von Kernen und Analyse von Kernfluoreszenzsonden , wie in den 4 und 5 gezeigt. </li><li> Öffnen Sie die .tif Bildstapel für die verwendeten Kanäle in ImageJ. Alternativ öffnen Sie native Dateien aus dem Erwerb Programm direkt in ImageJ das Bioformats Plugin. </li><li> Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) innerhalb des Kerns einer Zelle die Hell- Bild oder das Kernetikettenkanal verwendet (falls verwendet), und fügen Sie den ROI-Manager. Hinweis: Wenn die abgebildeten Zellen , die ein Kern Etikett (zB Histone H2B-EGFP.), Dann wird die automatische Zellverfolgung genutzt werden können Regionen von Interesse (ROIs) , die einzelnen Kerne durch die Zeit zu erstellen. </li><li> Fahren Sie mit dem nächsten Punkt und positionieren Sie den ROI innerhalb des gleichen nucleus. Fügen Sie den ROI zu dem ROI-Manager. </li><li> Weiter zu verfolgen und zu machen ROIs für die einzelne Zelle , bis eine Zellereignis ist (Mitose, Apoptose, etc.) , Oder die Zelle nicht mehr nachgeführt werden kann (dh., Bewegt sich aus dem Rahmen oder der Versuch beendet). </li><li> Wenn ROIs sind für Zellen durch die Zeit, die sie im Feld sind, überlagern sie auf die Fluoreszenzkanäle von Interesse etabliert. Messen Sie die mittlere Intensität der Fluoreszenz in jedem Kanal für jeden Zeitpunkt. Speichern Sie die ROI-Liste für die spätere Verwendung. <ol><li> Verschiedene Messungen können innerhalb der ROI für Anwendungen in verschiedenen Experimenten durchgeführt werden. Klicken Sie Analyse → Set Messungen ... ein Menü zu öffnen , um die Analysemethode wählen (z. B. mittlere Intensität innerhalb des ROI, integrierte Intensität, etc.). </li></ol></li><li> Hinweis Zellschicksale für einzelne Zellen (z. B. Apoptose, Teilung, Überleben) , während Tracking. Dies ermöglicht die Schaffung von Überlebenskurven und further Populationsanalyse. </li><li> Mit der mittleren Intensität für beide Kanäle, erstellen Sie ein Streudiagramm zu Zellzyklusdynamik in Reaktion auf Therapeutika (5B, C) ​​anzuzeigen. Hinweis: Die Grundstücke können für einzelne Zellen im Laufe der Zeit oder gemittelt über eine Population von Zellen verfolgt erstellt werden. Quantitative Bildgebung kann für den Aufbau komplexer Reaktionen und Zell Beziehungen in Reaktion auf Krebstherapeutika kritisch sein. Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie, Längsverfolgung und Datenanalyse ist ein mehrstufiger Prozess, mit vielen Optionen für die Art der Mikroskopie und Analyse - Tools, und folgt dem allgemeinen Umriss versehen in Abbildung 1. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Vorteile der Zeitraffermikroskopie und Longitudinal - Tracking Das Mikroskop ist ein ideales Instrument für Langzeitstudien von Arzneimittelreaktion, wie sie Forscher können einzelne Zellen und ihre Schicksale sowie die gesamte Bevölkerung zu verfolgen. Variability in Ansprechen auf das Medikament innerhalb einer Population von Zellen ist ein wichtiges Thema für Anti-Krebs-Therapie-Design. Längs-Tracking einzelner Zellen ermöglicht Ermittler diese Vari...

Live-Zell-Mikroskopie und Längsverfolgung einzelner Zellen ist keine neue Technik. Von den frühesten Mikroskope haben Enthusiasten und Wissenschaftler beobachteten , und einzelne Zellen und Organismen untersucht, ihr Verhalten und die Entwicklung 1-3. Ein berühmtes Beispiel aus dem späten David Rogers an der Vanderbilt University in den 1950er Jahren zeigt eine menschliche Neutrophilen in einem Blutausstrich ein Bakterium Staphylococcus aureus und schließlich den Prozess der Phagozytose 4 jagen. Diese Live-cell-Film ist ein ausgezeichnetes Beispiel dafür, wie mehrere Prozesse können in einem einzigen Experiment beobachtet und korreliert werden: Erfassen eines chemischen Gradienten, der Mechanik und der Geschwindigkeit der Zellbewegung, Zellformen Dynamik, Adhäsion und Phagozytose eines Pathogens. Das Aufkommen der vollautomatischen Mikroskope und hochempfindliche Digitalkameras hat sich in einer wachsenden Zahl von Ermittlern führte Mikroskopie grundlegende Fragen in der Zellbiologie bis hin f fragen mitrom , wie Zellen 5,6 und 7,8 dividieren zu Organell Dynamik und Membrantransport 11.09 bewegen. Nicht fluoreszierende, Hellfeldmikroskopie, einschließlich Phasenkontrast (PC), die den Nobelpreis für Frits Zernike 1953 sammelte und Differentialinterferenzkontrast (DIC) für die Beobachtung von Zellen und Zellkerne erlauben, sondern auch subzellulärer Strukturen einschließlich Mikrotubulus-Bundles , Chromosomen, Kernkörperchen, Organell Dynamik und dicke Aktinfasern 12. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​und die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen gegen Organellen haben sich dramatisch Zeitraffer-Mikroskopie 13-15 beeinflusst. Zwar nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, Bildgebung in der Zelle Sphäroiden und in situ (Intravitalmikroskopie) mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie stellen eine weitere Ausweitung des Ansatzes, und es gibt hervorragende Artikel , die diese Ansätze 16-19 verwenden und zu diskutieren. Die Antworten von Zellen auf Anti-cancer Drogen oder natürliche Produkte werden auf der molekularen und zellulären Skala bestimmt. Verständnis Zellantworten und Schicksal nach der Behandlung beinhaltet häufig Population Lungs Assays (z. B. Immunoblotting, ganz gut Maßnahmen) oder festen Zeitpunkten mit Immunofluoreszenz - Nachweis und Durchflusszytometrie, die einzelnen Zellen zu messen. Heterogeneity in Einzelzellreaktionen auf Arzneimittel innerhalb einer Population, insbesondere in Tumoren, können einige der Variabilität in Reaktion auf Zelllinien und Tumoren gesehen erklären, die mit dem gleichen Medikament bei Sättigung behandelt. Langzeitlängs Ansätze einer gegebenen einzelnen Zelle oder einer Population von Zellen zu folgen ist ein seltener , aber sehr leistungsfähigen Ansatz, der für die direkte Untersuchung der molekularen Reaktionswege, verschiedene Phänotypen (z. B. den Zelltod oder die Zellteilung) ermöglicht es , die Beobachtung von Zell-zu-Zell - Variabilität innerhalb einer Population, und wie diese Faktoren tragen zur Bevölkerung Ansprechdynamik 20-22. Optimistisch, in der Lage zu seinzu beobachten und einzelne Zell-Reaktionen zu quantifizieren wird unser Verständnis von zu verbessern, wie Medikamente wirken, warum sie manchmal scheitern, und wie man sie am besten nutzen. Die Technik der langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie, Längs - Tracking und Analyse von Arzneimittelreaktionen zu vielen Forschern zur Verfügung und kann einfach sein, nur im Durchlicht - Phänotyp Antworten 20,21 zu beobachten. Die Hauptkomponenten des Ansatzes sind: eine angemessene Vorbereitung der Zellen von Interesse, ein automatisiertes Mikroskop mit Klimakammer, eine Kamera mit einem Computer integriert, um die Bilder zu erfassen und zu speichern, und Software, die im Zeitraffer und zu messen und zu analysieren, um die Zellen zu überprüfen und alle Fluoreszenzbiosensoren. Wir bieten ein detailliertes Protokoll mit vielen Tipps für die Durchführung von Zeitraffer-Mikroskopie von kultivierten Zellen so lange wie mehrere Tage mit Hell- und / oder Weitfeld Epifluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll kann für jede Zelllinie verwendet werden, die in Kultur gezüchtet werden können,ihre Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapien zu untersuchen. Wir stellen Beispiele von Daten erfasst und unter Verwendung mehrerer verschiedener genetisch kodierten Fluoreszenz Biosensoren und ein Beispiel für Phasenkontrast-Mikroskopie, kurz verschiedene Arten von Sonden, die Vor- und Nachteile der langfristigen Zeitraffer und Längs Tracking diskutieren, was sein kann für diesen Ansatz gelernt, die aus nicht-direkten Ansätze zu verstehen, und einige Variationen, die wir hoffen, dass sein Interesse und Wert für unerfahrene Forscher, die nicht als mit dem Ansatz, und erfahrene Forscher schwierig ist.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Taxol (paclitaxel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7191</td>
			<td>microtubule stabilizing drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>etoposide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1225</td>
			<td>topoisomerase II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>selinexor</td>
			<td>Karyopharm Therapeutics</td>
			<td>na</td>
			<td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesin-5 inhibitor</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>na</td>
			<td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell growth medium</td>
			<td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td>
			<td></td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/balance air, certified</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7222004379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm 4 well dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35C4-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, gridded glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well, glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-UCB controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR LumenPro200</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Lumen200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR Proscan III motorized stage</td>
			<td>Prio Scientific</td>
			<td>H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEV chamber</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Controller Unit</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon laser launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA light engine</td>
			<td>lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td>
			<td>ANDOR&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOKAI HIT inclubation chamber</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

Die Reaktion von einzelnen Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente trägt wesentlich die Bevölkerung Antwort bei der Bestimmung, und ist daher ein wichtiger Faktor in dem Gesamtergebnis. Immunoblotting, die Durchflusszytometrie und fixierte Zellexperimente werden oft verwendet, zu untersuchen, wie Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente reagieren. Diese Verfahren sind wichtig, aber sie haben verschiedene Nachteile. Variability in der Arzneimittelreaktionen zwischen Krebszellen und normalen Zellen und zwischen Zellen verschiedener Krebs Ursprungs und transiente und seltene Reaktionen sind schwierig mit Bevölkerung Lungs Assays zu verstehen und ohne direkt in der Lage zu verfolgen und sie in Längsrichtung zu analysieren. Das Mikroskop ist besonders gut geeignet, um Bild lebenden Zellen. Fortschritte in der Technologie ermöglichen es uns, bei einer Auflösung routinemäßig Zellen Bild, das nicht nur Zellverfolgung ermöglicht, sondern auch die Beobachtung einer Vielzahl von zellulären Reaktionen. Wir beschreiben einen Ansatz im Detail, die für die kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es derZellen während der Arzneimittelantwort für im wesentlichen so lange wie gewünscht, in der Regel bis zu 96 Stunden. Mit Variationen des Ansatzes können die Zellen für Wochen überwacht werden. Mit dem Einsatz von genetisch Fluoreszenzbiosensoren codiert zahlreiche Prozesse, Wege und Reaktionen können verfolgt werden. Wir zeigen Beispiele, die Verfolgung und die Quantifizierung von Zellwachstum und die Zellzyklusprogression, Chromosomendynamik, DNA-Schädigung und Zelltod sind. Wir diskutieren auch Variationen der Technik und ihrer Flexibilität und typische Fehler hervorzuheben.

Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie und direkte Längs Tracking ermöglicht die Untersuchung von vielen Anti-Krebs-Wirkung während der Arzneimittelantwort. Nach dem allgemeinen Umriß in Figur 1, werden mehrere Beispiele für Zellen gezeigt validierten fluoreszierenden Reporter exprimieren , das mit Anti-Krebs - Medikamenten behandelt, verfolgt und analysiert werden verschiedene Ansätze verwendet. Phasenkontrast...

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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K Aufrufe.  University of Colorado, Boulder. Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Serie: Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

The Measurement and Treatment of Suppression in Amblyopia

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current estimates put the prevalence of amblyopia at approximately 1-3%1-3, the majority of cases being monocular2. Amblyopia is most frequently caused by ocular misalignment (strabismus), blur induced by unequal refractive error (anisometropia), and in some cases by form deprivation.
Although amblyopia is initially caused by abnormal visual input in infancy, once established, the visual deficit often remains when normal visual input has been restored using surgery and/or refractive correction. This is because amblyopia is the result of abnormal visual cortex development rather than a problem with the amblyopic eye itself4,5 . Amblyopia is characterized by both monocular and binocular deficits6,7 which include impaired visual acuity and poor or absent stereopsis respectively. The visual dysfunction in amblyopia is often associated with a strong suppression of the inputs from the amblyopic eye under binocular viewing conditions8. Recent work has indicated that suppression may play a central role in both the monocular and binocular deficits associated with amblyopia9,10 .
Current clinical tests for suppression tend to verify the presence or absence of suppression rather than giving a quantitative measurement of the degree of suppression. Here we describe a technique for measuring amblyopic suppression with a compact, portable device11,12 . The device consists of a laptop computer connected to a pair of virtual reality goggles. The novelty of the technique lies in the way we present visual stimuli to measure suppression. Stimuli are shown to the amblyopic eye at high contrast while the contrast of the stimuli shown to the non-amblyopic eye are varied. Patients perform a simple signal/noise task that allows for a precise measurement of the strength of excitatory binocular interactions. The contrast offset at which neither eye has a performance advantage is a measure of the "balance point" and is a direct measure of suppression. This technique has been validated psychophysically both in control13,14 and patient6,9,11 populations.
In addition to measuring suppression this technique also forms the basis of a novel form of treatment to decrease suppression over time and improve binocular and often monocular function in adult patients with amblyopia12,15,16 . This new treatment approach can be deployed either on the goggle system described above or on a specially modified iPod touch device15.

Amblyopia is a developmental disorder of the visual cortex that is often accompanied by strong suppression of one eye. We present a new technique for measuring and treating interocular suppression in patients with amblyopia that can be deployed using virtual reality goggles or a portable iPod Touch device.

Die Messung und Behandlung von Unterdrückung in Amblyopie

Amblyopia, a developmental disorder of the visual cortex, is one of the leading causes of visual dysfunction in the working age population. Current ...

Intranasal Administration of CNS Therapeutics to Awake Mice

Intranasal administration is a method of delivering therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is non-invasive and allows large molecules that do not cross the blood-brain barrier access to the CNS. Drugs are directly targeted to the CNS with intranasal delivery, reducing systemic exposure and thus unwanted systemic side effects1. Delivery from the nose to the CNS occurs within minutes along both the olfactory and trigeminal neural pathways via an extracellular route and does not require drug to bind to any receptor or axonal transport2. Intranasal delivery is a widely publicized method and is currently being used in human clinical trials3.
Intranasal delivery of drugs in animal models allows for initial evaluation of pharmacokinetic distribution and efficacy. With mice, it is possible to administer drugs to awake (non-anesthetized) animals on a regular basis using a specialized intranasal grip. Awake delivery is beneficial because it allows for long-term chronic dosing without anesthesia, it takes less time than with anesthesia, and can be learned and done by many people so that teams of technicians can dose large numbers of mice in short periods. Efficacy of therapeutics administered intranasally in this way to mice has been demonstrated in a number of studies including insulin in diabetic mouse models 4-6 and deferoxamine in Alzheimer's mouse models. 7,8
The intranasal grip for mice can be learned, but is not easy and requires practice, skill, and a precise grip to effectively deliver drug to the brain and avoid drainage to the lung and stomach. Mice are restrained by hand using a modified scruff in the non-dominant hand with the neck held parallel to the floor, while drug is delivered with a pipettor using the dominant hand. It usually takes 3-4 weeks of acclimating to handling before mice can be held with this grip without a stress response. We have prepared this JoVE video to make this intranasal delivery technique more accessible.

A method to intranasally administer drugs to awake mice for the purpose of targeting the brain is described. This method allows for repeat dosing over long periods using intranasal administration of drug without anesthesia, and nose-to-brain delivery with minimal systemic exposure.

Intranasale Verabreichung von CNS Therapeutics Awake Mäuse

Intranasal administration is a method of delivering  therapeutic agents to the central nervous system (CNS). It is  non-invasive and allows large ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Pulse Wave Velocity Testing in the Baltimore Longitudinal Study of Aging

Carotid-femoral pulse wave velocity is considered the gold standard for measurements of central arterial stiffness obtained through noninvasive methods1.&#160;Subjects are placed in the supine position and allowed to rest quietly for at least 10 min prior to the start of the exam. The proper cuff size is selected and a blood pressure is obtained using an oscillometric device. Once a resting blood pressure has been obtained, pressure waveforms are acquired from the right femoral and right common carotid arteries. The system then automatically calculates the pulse transit time between these two sites (using the carotid artery as a surrogate for the descending aorta). Body surface measurements are used to determine the distance traveled by the pulse wave between the two sampling sites. This distance is then divided by the pulse transit time resulting in the pulse wave velocity. The measurements are performed in triplicate and the average is used for analysis.

Pulse wave velocity (PWV) measurement assesses arterial stiffness by a tonometry-based system that measures the speed with which arterial pressure wave travels along the arterial tree, typically approximating the time that it takes this wave to travel from the descending aorta (using the carotid artery as a surrogate) to the femoral artery. Carotid-femoral PWV increases two- to threefold across the adult lifespan.

Pulswellengeschwindigkeit Testing in der Baltimore Longitudinal Study of Aging

Carotid-femoral pulse wave velocity is considered the gold standard for measurements of central arterial stiffness obtained through noninvasive ...

Confocal Time Lapse Imaging as an Efficient Method for the Cytocompatibility Evaluation of Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The objective of this study was to use 3D CLSM time lapse confocal imaging to assess the in vitro biocompatibility of dental composites. This method provides an accurate and sensitive indication of viable cell rate in contact with dental composite extracts. The ELS extra low shrinkage, a dental composite used for direct restoration, has been taken as example. In vitro assessment was performed on cultured primary human gingival fibroblast cells using Live/Dead staining. Images were obtained with the FV10i confocal biological inverted system and analyzed with the FV10-ASW 3.1 Software. Image analysis showed a very slight cytotoxicity in the presence of the tested composite after 5 hours of time lapse. A slight decrease of cell viability was shown in contact with the tested composite extracts compared to control cells. The findings highlighted the use of 3D CLSM time lapse imaging as a sensitive method to qualitatively and quantitatively evaluate the biocompatibility behavior of dental composites.

The most studied aspect of the biocompatibility of dental composites is their cytotoxicity 3D CLSM time lapse imaging combined with fluorescent signal quantification allows sensitive evaluation of the cell fate over time. Utilizing this method could be an efficient tool to assess the cytocompatibility of dental composites.

Konfokale Zeitraffer Imaging als eine effiziente Methode für die Bewertung der Cytocompatibility Dental Composites

It is generally accepted that in vitro cell material interaction is a useful criterion in the evaluation of dental material biocompatibility. The ...

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest improved outcome measures in both experimental and clinical studies. Although the BMMSC are implanted into the tendon lesion in large numbers (usually 10 - 20 million cells), only a relatively small number survive (&#60;10%) although these can persist for up to 5 months after implantation. This appears to be a common observation in other species where BMMSC have been implanted into other tissues and it is important to understand when this loss occurs, how many survive the initial implantation process and whether the cells are cleared into other organs. Tracking the fate of the cells can be achieved by radiolabeling the BMMSC prior to implantation which allows non-invasive in vivo imaging of cell location and quantification of cell numbers.
This protocol describes a cell labeling procedure that uses Technetium-99m (Tc-99m), and tracking of these cells following implantation into injured flexor tendons in horses. Tc-99m is a short-lived (t1/2 of 6.01 hr) isotope that emits gamma rays and can be internalized by cells in the presence of the lipophilic compound hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO). These properties make it ideal for use in nuclear medicine clinics for the diagnosis of many different diseases. The fate of the labeled cells can be followed in the short term (up to 36 hr) by gamma scintigraphy to quantify both the number of cells retained in the lesion and distribution of the cells into lungs, thyroid and other organs. This technique is adapted from the labeling of blood leukocytes and could be utilized to image implanted BMMSC in other organs.

In Vivo Imaging and Tracking of Technetium-99m Labeled Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Equine Tendinopathy

This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.

In-vivo-Imaging und Verfolgung von Technetium-99m markierten Knochenmark mesenchymale Stammzellen in Equine Tendinopathie

Recent advances in the application of bone marrow mesenchymal stem cells (BMMSC) for the treatment of tendon and ligament injuries in the horse suggest ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Erweiterte Zeitraffer-Intravital Imaging von Echtzeit-Vielzellige Dynamics im Tumormikromilieu

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

Remodeling of the brain vasculature is a common trait of brain pathologies. In vivo imaging techniques are fundamental to detect cerebrovascular plasticity or damage occurring overtime and in relation to neuronal activity or blood flow. In vivo two-photon microscopy allows the study of the structural and functional plasticity of large cellular units in the living brain. In particular, the thinned-skull window preparation allows the visualization of cortical regions of interest (ROI) without inducing significant brain inflammation. Repetitive imaging sessions of cortical ROI are feasible, providing the characterization of disease hallmarks over time during the progression of numerous CNS diseases. This technique accessing the pial structures within 250 &#956;m of the brain relies on the detection of fluorescent probes encoded by genetic cellular markers and/or vital dyes. The latter (e.g., fluorescent dextrans) are used to map the luminal compartment of cerebrovascular structures. Germane to the protocol described herein is the use of an in vivo marker of amyloid deposits, Methoxy-O4, to assess Alzheimer&#39;s disease (AD) progression. We also describe the post-acquisition image processing used to track vascular changes and amyloid depositions. While focusing presently on a model of AD, the described protocol is relevant to other CNS disorders where pathological cerebrovascular changes occur.

Longitudinal In Vivo Imaging of the Cerebrovasculature: Relevance to CNS Diseases

This manuscript describes a procedure to track the remodeling of the cerebrovasculature during amyloid plaque accumulation in vivo using longitudinal two-photon microscopy. A thinned-skull preparation enables the visualization of fluorescent dyes to assess the progression of cerebrovascular damage in a mouse model of Alzheimer&#39;s disease.

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

Zusammenfassung

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