We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and &#946;-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).

Aşağıdaki protokol, Şekiller 4 ve 6 ile ilgili olarak elde etme ayarları ve deney koşullarında deneyler ile tanımlanan parametreleri kullanır. Bu parametrelerin çoğu, diğer deneyler uyacak şekilde değiştirilebilir (örneğin, maruz kalma süreleri, gruplama, floresan kanalları, vs.).. Tüm işlemler, kurumsal kurallar ve düzenlemelere uymak zorundadır ve kurumsal biyogüvenlik komitesi tarafından onaylanmalıdır. Mikroskop üretici web siteleri canlı hücre görüntüleme için mükemmel bilgiler içermektedir. 1. mikroskoplar ve Görüntüleme Yazılımı <ol><li> ters mikroskoplar çok çeşitli canlı hücre görüntüleme gerçekleştirin. En yaygın mikroskoplar Epifloresans ve eğirme diskli konfokal Geniş alanlı edilir. Burada, 200 watt metal halide ışık kaynağı ile bir otomatik ve motorlu widefield Epifloresans mikroskop kullanıyoruz. </li><li> Bir sahne top almak veya çevre odasına mikroskop. Burada, bir sahne t kullanmakop çevre odası. </li><li> time-lapse mikroskobu yürütmek için programları ile mikroskopları çalıştırmak için ticari yazılım kullanın. </li><li> Görüntü analizi için ticari olarak temin edilebilen yazılımı veya ImageJ kullanın. Diğer birçok analiz araçları piyasada mevcuttur ve 8,18 yayınlanmış olan birçok ısmarlama programları vardır. </li></ol> 2. Hücresel Süreçler ve Fenotipik Yanıtlar görselleştirme <ol><li> aydınlık mikroskobu ile hücrelerin görselleştirmek. yalnız Diferansiyel girişim kontrast ve faz kontrast anti-kanser ilaç yanıtları yanıtları incelemek için çok bilgilendirici olabilir. Bu süreçler mitoz, hücre motilitesi ve apoptoz içerebilir. </li><li> floresan biyosensörler ile hücre yapıları, organelleri ve süreçleri gözünüzde canlandırın. Floresan sondalar spesifik hücre içi süreçleri izleme bilgilendirici. Bunlar mikrotübül dinamiklerini, mitokondriyal ve endoplazmik retikulum dinamikleri, protein birikimi ve lokalizasyonu ve içerebilirmoleküler sinyal (örn., fosforilasyon, kalsiyum). </li></ol> Numunelerin 3. hazırlanması <ol><li> Standart bir hücre kültürü sertifikalı kap içinde bulunan hücreler büyümek, nemlendirilmiş hücre kültürü yetiştirme cihazı kullanılmaktadır (örneğin, 37 o C,% 5 CO2,% 80 bağıl nem). <ol><li> EBSS&#39;ye ile MEM HT1080 hücreleri büyütün. % 10 h / h FBS,% 1 h / h Pen / Strep,% 1 hac / hac sodyum piruvat ve% 1 h / h esansiyel olmayan amino asitler ile, ortam takviyesi. </li></ol></li><li> görüntüleme İki gün önce, sertifikalı steril laminer akış kaputun içindeki bir 12-iyi # 1.5 cam alt çanak 3 kuyu içine plaka 50,000 HT1080 FUCCI hücreleri. Deneyin başlaması için ~% 60 izdiham elde etmek için kaplama hücrelerinin sayısını ayarlar. hücre çizgisi ve deney hücre yoğunluğu doğasına bağlı olarak daha az olabilir. Not: Hücre yoğunluğu, hücre kuşağının büyümesinin ve deney sonuçları üzerinde derin bir etkiye sahip olabilir. en aza indirmek için hücreleri saymak deneme-to-deney variabilityoğunluğuna bağlı Y. <ol><li> çevre odasında ve deney için gerekli olan koşullar, tek bölmeli tepsilerde levha hücreler (genellikle 35-veya 60-mm), 4 de 35 mm&#39;lik tabaklar, 6-, 12 veya 24-iyi hücre kültür plakaları ya da bağlı olarak çeşitli biçimlerde slaytlar lamel. Hücre kültürü plastik yoluyla # 1.5 en objektif lensler cam bu kalınlık için optimize edilmiştir cam ve görüntüleme ile cam-alt tabak kullanın çok kötüdür. Not: Bazı hücre hatları büyür ve camın üzerine hayatta yoktur. Bu gibi durumlarda, cam (örn., Poli-lisin ya da kolajen), hücre yapışmasını arttırmak için kaplanabilmektedir. Bu uygun bir seçenek olup olmadığını Bazı şirketler, bu ampirik olarak tespit edilmelidir optik hücre kültürü plastik imalatı. </li></ol></li></ol> 4. Çevre Odası Kurulumu <ol><li> Önceden herhangi bir deney için, set-up çevre odasını 37 o C 80% nem ~ çalışır ve böylece örnek konumunda sıcaklık böylece. En kültürlenmiş hücreler nedeniyle ortam içinde, sodyum bikarbonat tamponu% 5 CO2 / denge hava atmosferinde büyür. Set-up bağlı olarak, ya% 5 CO 2 çevre kontrolörü ayarlamak ve hava ile% 100 CO 2 karıştırın, ya da% 5 CO 2 / denge hava gazı sertifikalı, önceden karıştırılmış kullanacaktır. Gaz akış hızları için üreticinin talimatlarını izlemelidir. Not: bazı hücre çizgileri de CO2 olmaksızın muhafaza edilebilir ve bu durumda, CO 2 bağımsız ortamda büyür. Özel olarak tasarlanmış görüntüleme medya autofluorescent bileşiklerinin eklenmesini sınırlar da mevcuttur. İstenen bir hücre tipi için tezler ortamlarda büyüme deneysel olarak daha önce tespit edilmelidir. </li><li> görüntüleme önce su deposu steril damıtılmış su ile (üreticinin talimatlarına sonra) dolu olduğundan emin olun. İstenilen sıcaklık ayarına çevre odasında açın ve mikroskop sahne içerlek içine yerleştirin. gaz kaydetmek için, bu noktada akışını başlatmak yok. Not: sahne top haznesi ve sahne içerlek ve / veya deneye hareket eserleri tanıtmak olabilir odasına bağlantı kablolarının herhangi bir gerilim arasında herhangi bir boş alan varsa. <ol><li> sahneye çift içine odasına odasını takmadan önce sahne gömme açılış kenarları üzerinde parafin filmin parçalarını Lay ve hiçbir bağlantı odasının çekerek emin olun. </li></ol></li><li> Odası 37 o C gelmesini sağlayınız Hücre fizyolojisini etkileyen ve sürüklenme tanıtabilirsiniz görüntüleme sırasında sıcaklık dalgalanmaları önlemek için istikrarlı bir sıcaklık korumak. Ulaşan sıcaklık dengeleme genellikle ortama bağlı olarak 1 saat 30 dakika gerektirir. <ol><li> ısıtılırken odasına kuyulardan su ile bir &#39;kukla&#39; çanak yerleştirin. odasına sağlamak yardımcı su taklit ile örnek dolu bir görüntüleme çanak, yeterince ısınmış ve stabilize edilir. Önceden ısıtılmış steril su ile bölme doldurmaIsı dengelenmesi için gerekli olan zamanı azaltır ve deneysel örnek ilavesinden sonra sıcaklık düşmesini minimuma indirir. </li></ol></li></ol> 5. Mikroskop Set-up <ol><li> mikroskop, ilişkili bilgisayar, ve gerekli çevre birimlerini açın. <ol><li> Işık kaynağına bağlı olarak, gerekli kadar açmak için sabırsızlanıyorum (örn., LED). </li></ol></li><li> Düşük pozisyonda objektif taret, kullanılacak 20X 0.7 NA hedefi seçin. </li><li> amaç üzerinde örnek yerleştirin - Bu örnek odasına olduğunda daha kolay hücreleri bulmak için yapacaktır. </li><li> önceki deneylerden biliniyorsa, şu anda görüntüleme parametreleri tanımlayın. </li></ol> 6. Mikroskop ve Odası&#39;na Hücreler taşınması <ol><li> Taşıma hücreleri, çevresel bölmeye inkübatör yansıması. Bu nispeten düşük CO2 etkilerini sınırlamak için hızlı bir şekilde yapılır emin olun </sub&gt; atmosfer ve hücreler üzerindeki sıcaklık azaldı. Numune taşıma ve dökülme durumunda temiz-up için tüm kurumsal biyogüvenlik kurallarına uyun. <ol><li> Büyük çevre değişiklikleri önlemek için kapalı bir Strafor kap veya yalıtılmış torba hücreleri yerleştirin. </li></ol></li><li> üreticinin talimatlarına aşağıdaki odasına örnek görüntüleme çanak yerleştirin. </li><li> Hücre, çevresel bölme içinde tespit edildikten sonra, kararlı bir ortam sağlamak hemen atmosferik gaz kaynak (lar) açmak için bölme mühür. <ol><li> bazı çevresel odaları sıkı, mühürlü kapağı kullanmak yok gibi, büyüme ortamının üstüne buharlaşmasını, steril bir katman, embriyo sertifikalı madeni yağ geciktirir. Cam görüntüleme alanını engellemeyecek için dikkatli olmak örnek çanak çevre-kenarlarda gaz geçirgen parafin filmi sarın. Lokalize, ikincil nemlendirme yöntemleri kullanılabilir. performasını azaltabilir örnek çanak kapağı üzerinde yoğunlaşmaaydınlık mikroskobu mance. </li></ol></li><li> Erken deney sırasında termal sürüklenme etkisini en aza indirmek amacıyla, time-lapse başlamadan önce 30 dakika bekleyin. Gerekli zamanlı görüntüleme çanak büyüklüğü ve diğer faktörlere bağlı olarak değişir. ampirik belirleyin. </li></ol> 7. Görüntüleme kurma <ol><li> en iyi veri temsil edecek seçin görüntüleme koşulları. , Pozlama süreleri sınırlayıcı düşük yoğunlukta ışık kullanılarak ve ışığın uzun dalga boylarına göre heyecanlıyız sondalar seçerek fototoksisite önlemek için gerekli tedbirleri alın. </li><li> Her bir konum için X, Y ve Z düzlemi ve istenen dalga boyu (ları) nın, görüntülenecek. Zaman çözünürlüklü pozisyonları ve dalga boyu sayısı ile sınırlıdır. En hücresel süreçlerin uzun vadeli time-lapse, bir görüntü her 10 elde - 20 dakika; yüksek zaman çözünürlüğü (kısa aralıklar, örneğin., 1 dk) daha fazla veri noktaları ve bu nedenle daha güçlü hücre izleme sağlar, fakat aynı zamanda daha entegre sonuçlanırışığa maruz kalma ve daha büyük veri setleri. <ol><li> - 50 msn, Texas Red / TRITC - 40 msn, aydınlık - 20 milisaniye FITC / GFP: HT1080 FUCCI dinamik, yeşil ve kırmızı floresan proteinleri olduğu gibi (Temsilcisi Sonuçlar bakınız), aşağıdaki poz kez kullanabilirsiniz. 2 x 2 bin kullanın. </li></ol></li><li> Gelişmiş ayarları altında, varsayılan parametreler kullanılarak yazılım kontrollü otomatik netleme etkinleştirin. Tavsiye adım büyüklüğü ile 10 mikron bir otofokus aralığını tanımlayın. time-lapse başlamadan önce bu yaptığınızdan emin olun. Aydınlık görüntüleri ile otofokus ve asla floresan ile fototoksisite ve photobleaching azaltmak için. <ol><li> motorlu bir sahne ile herhangi bir mikroskop yazılım kontrollü otomatik netleme sistemleri kullanmak ve doğrudan örnek üzerinde odaklanmak. Ancak, deney edinme hızını sınırlayabilir. Sürekli odaklama sistemleri daha fazla pozisyon için izin time-lapse mikroskopi için iyi çalışır ve hızını artırmak kontrollü donanım görüntülü veya devralma daha yüksek bir oran olması. Bununla birlikte,Hava-cam arayüzü tespiti güveniyor ve kuyunun üzerinden cam kalınlığı varyasyonları ile numunenin odağı kaybedebilir. </li></ol></li><li> Medya 37 o C ısıtılmış olmuştur istenen ilaç konsantrasyonu içeren medyanın yarısını Değiştir Kısmi medya yedek termal sürüklenme azaltmaya yardımcı olur. Bu deneyde koşulları araç (DMSO), 1 uM selinexor ve 10 uM PD0332991 vardır. Not: Bu adım aynı zamanda duraklatma ve deney yeniden başlatarak satın başlattıktan sonra yapılabilir. Bu tek hücre öncesi ve sonrası ilaç etkileşimleri uzunlamasına izleme sağlar. İlaç kararlılığı ya da metabolizma eğer duraklatma ve medya aynı yöntemle yapılabilir yerine, bir husustur. İlaç bozulması veya metabolizma testi için, muamele edilmiş hücreler ortam, aynı zamanda ilaç etkisini test etmek için saf hücrelerde yerleştirilebilir. </li><li> time-lapse başlatın. </li><li> Zaman atlamalı çalışır gibi, görüntülü alanlar odak ve Chambe içinde kalmasını sağlamakr nemli 37 o C korur <ol><li> zaman noktaları arasındaki zaman boşluğu sırasında edinme duraklatarak gerektiği gibi odağı ayarlayın. </li></ol></li><li> Gerekirse, uzun deneyler sırasında bölmeye su ilave edilir. 37 o C&#39;de önceden ısıtılmış steril damıtılmış su eklemek suretiyle soğutma odalı önlemek </li></ol> 8. Time-lapse Bitiş <ol><li> Deney tamamlanma tükendi zaman otomatik olarak durdurmak için ayarlanmamış ise, satın durdurun. </li><li> düzgün veri kaybı olabilir bitmiş değilse çoğu yazılım paketleri otomatik olarak satın alma sırasında tasarruf rağmen time-lapse, sabit diske düzgün kaydedildi emin olun. </li><li> mikroskop odasına çıkarın ve onaylı kurumsal biyogüvenlik prosedürleri takip biyolojik tehlikeli atık haline hücrelerin imha edin. </li></ol> 9. Boyuna Takip ve Analiz Zaman atlamalı Verilerinin <ol><li> bir analiz için metodoloji seçinilgi biyolojik süreçler için uygundur. Birçok ImageJ için eklentileri, MATLAB kullanarak programları ve özel platformlar özel uygulamalar için üretilmiştir. Şekiller 4 ve 5&#39;te gösterildiği gibi, aşağıdaki yöntem çekirdeklerin nükleer flüoresan analiz izleme kapsar. </li><li> ImageJ kullanılan kanallar için tif görüntü yığınlarını açın. Alternatif olarak, Bioformats eklentisi kullanarak doğrudan ImageJ satın alma programı açık yerli dosyaları. </li><li> aydınlık görüntü veya (eğer kullanılıyorsa) nükleer etiket kanalını kullanarak bir hücrenin çekirdeğinde içinde faiz (ROI) bir bölge çizin ve ROI yöneticisi ekleyin. Not: görüntülü hücreler nükleer etiketi varsa (örneğin, histon H2B EGFP.), Daha sonra otomatik hücre izleme süresi faiz (ROI) bireysel çekirdekleri temsil bölgeleri oluşturmak için kullanılabilir. </li><li> dahaki sefere noktasına geçin ve aynı nucleu içinde ROI konumlandırmaks. ROI yöneticisi ROI ekleyin. </li><li> Izlemek ve hücresel bir olay (mitoz, apoptoz, vb.) Veya hücre artık izlenebilir kalmayıncaya kadar bireysel hücre için İB&#39;leri yapmaya devam (yani., Çerçevenin dışına taşır veya deney biter). </li><li> ROI onlar alanında bulunmaktadır zaman içinde hücreler için kurulduğunda, ilgi floresan kanalları üzerine onları üst üste. Her bir zaman noktası için her kanalda floresans ortalama yoğunluğu ölçülür. daha sonra kullanmak üzere ROI listesini kaydedin. <ol><li> Çeşitli ölçümler farklı deneyler uygulamalar için ROI içinde yapılabilir. (Örneğin. ROI, entegre yoğunluğu, vb içinde ortalama yoğunluğu.) Analitik yöntemi seçmek için bir menüyü getirmek için ... Analiz → Set Ölçümleri tıklayın. </li></ol></li><li> Izlerken tek tek hücrelerin hücre kaderi (örn., Apoptoz, bölünme, hayatta kalma) unutmayın. Bu hayatta kalma eğrileri ve furthe yaratılması için izinr populasyon çözümlemesi. </li><li> Her iki kanal için ortalama yoğunluğu ile, terapötik (Şekil 5B, Cı) yanıt olarak hücre döngüsü dinamikleri görüntülemek için bir dağılım grafiği oluşturur. Not: Lineer zaman tek tek hücreler için oluşturulan veya izlenen bir hücre popülasyonu üzerinden ortalaması olabilir. Kantitatif görüntüleme kanser tedavi tepki olarak karmaşık tepkiler ve hücre ilişkilerin kurulması için çok önemli olabilir. Uzun vadeli time-lapse mikroskopi, uzunlamasına izleme ve veri analiz mikroskopisi ve analiz araçları türü için birçok seçenek ile, bir çok adımlı bir süreçtir ve Şekil 1&#39;de verilen genel hatlarıyla izlemektedir. </li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Time-lapse Mikroskopi ve Boyuna İzleme Avantajları bu araştırmacılar, bireysel hücreleri ve kaderlerini yanı sıra tüm nüfusu izlemenize olanak sağlar olarak mikroskop ilaç yanıtının uzunlamasına çalışmalar için ideal bir araçtır. bir hücre popülasyonu içinde, ilaç yanıtındaki değişkenliği, anti-kanser terapötik tasarımı için önemli bir sorundur. tek hücre Boyuna izleme araştırmacılar bu değişkenliği gözlemlemek ve hücre popülasyo...

Canlı hücre mikroskopi ve tek hücre boyuna izleme yeni bir teknik değildir. Erken mikroskoplar, meraklıları ve bilim adamları tek hücreler ve organizmalar, onların davranışlarını ve gelişimini 1-3 gözlenen ve inceledik. 1950&#39;lerde Vanderbilt Üniversitesi&#39;nde geç David Rogers ünlü bir örnek, bir Staphylococcus aureus bakterisi ve fagositoz 4 sonunda sürecini kovalayan bir kan yaymasında bir insan nötrofil gösterir. Bu canlı hücre film tek bir deneyde gözlenen ve korelasyon nasıl birden çok işlem mükemmel bir örnektir: Bir kimyasal degrade, mekanik ve hücre hareketi hızı algılama, hücre dinamikleri, yapışma, ve bir patojenin fagositozu şekillendirir. tam otomatik mikroskopları ve son derece hassas dijital kameralar gelişi hücre biyolojisi değişen f temel soru sormak için mikroskobu kullanarak araştırmacılar bir çok artan sayılarda sonuçlandıHücreler 5,6 taşımak ve dinamikleri ve membran ticaretini 9-11 organel 7,8 bölmek nasıl rom. Floresan olmayan, 1953 yılında Frits Zernike için Nobel Ödülü topladı faz-kontrast (PC), ve diferansiyel girişim kontrast da dahil olmak üzere aydınlık mikroskobu (DIC) mikrotübül demetleri dahil hücre ve çekirdeklerin aynı zamanda alt hücresel yapıların gözlem için izin , kromozomlar, nükleol, organel dinamikleri ve kalın aktin lifleri 12. Genetik floresan proteinleri kodlanmış ve organeller karşı floresan boyaların geliştirilmesi önemli ölçüde time-lapse mikroskopi 13-15 etkiledi. Bu yazının odağı değil iken, hücre sferoidler ve in situ (Intravital mikroskopi) konfokal ve multiphoton mikroskopi kullanılarak görüntüleme yaklaşımının başka genişleme temsil ve kullanımı ve bu yaklaşımları 16-19 tartışmak seçkin makaleleri vardır. Anti-Canc hücre tepkilerier ilaçlar veya doğal ürünler moleküler ve hücresel ölçekte belirlenir. Anlamak hücre yanıtları ve kaderleri aşağıdaki tedavisi genellikle tek hücreleri ölçmek nüfus ortalama deneyleri (örn., Immünoblotting, bütün kuyu ölçüleri), ya da immunofluorescent algılama ile sabit zaman noktaları ve akım sitometri, içerir. bir popülasyon içindeki ilaç tek hücre yanıtlarında heterojenliği, tümörler, özellikle de doygunluğuna aynı ilaç ile muamele edilir hücre hatları ve tümör boyunca görülen yanıt olarak değişkenlik bazı açıklayabilir. Belirli bir tek hücre ya da hücrelerin bir popülasyonu aşağıdaki uzunlamasına yaklaşımlar uzun süreli moleküler cevap yollarının doğrudan çalışma için olanak sağlayan daha az sık ama çok güçlü bir yaklaşım, farklı fenotipleri (örn., Hücre ölümü veya hücrenin bölme), gözlem hücre-hücre bir popülasyon içindeki değişkenliği ve nasıl bu faktörler popülasyon yanıtı dinamikleri 20-22 katkıda bulunur. Iyimser, güçlü olmakgözlemlemek ve uyuşturucu bazen başarısız neden çalışmak ve en iyi nasıl bunları kullanmak için nasıl anlayışımızı geliştirmemize yardımcı olacaktır tek hücre yanıtlarını ölçmek için. Uzun vadeli time-lapse mikroskobu, uzunlamasına izleme ve ilaç yanıtları analiz tekniği birçok araştırmacı tarafından kullanılabilir ve fenotip yanıtları 20,21 gözlemlemek için sadece iletilen ışık kullanarak, basit olabilir. yaklaşımının ana bileşenleri şunlardır: ilgi hücreleri uygun hazırlanması, çevre haznesi ile otomatik mikroskop, kamera kazanmak ve zaman atlamalı yorumlayan görüntüleri saklamak, yazılım ve ölçmek ve hücreleri analiz etmek için bir bilgisayar ile entegre ve herhangi bir floresan biyosensörler. Biz aydınlık ve / veya widefield epifluorescent mikroskopi kullanılarak sürece birkaç gün kültür hücreleri time-lapse mikroskobu yürütmek için birçok ipuçları ile ayrıntılı bir protokol sağlar. kültüründe yetiştirilebilir herhangi bir hücre hattı için kullanılabilir Bu protokolanti-kanser tedavilerinin kendi yanıtlarını incelemek için. Biz elde edilen verilerin örneklerini sunmak ve kısaca farklı prob türleri, avantaj ve uzun vadeli time-lapse ve boyuna izleme dezavantajlarını tartışmak çok farklı genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler ve faz-kontrast mikroskobu örneği kullanılarak analiz, ne olabilir, olmayan doğrudan yaklaşımlar ve biz yaklaşımı kullanılarak kabul değil deneyimsiz araştırmacıların ilgi ve değer olacağını umuyoruz bazı değişimlerden anlaşılması zor ve deneyimli araştırmacılara bu yaklaşım için öğrendim.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Taxol (paclitaxel)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T7191</td>
			<td>microtubule stabilizing drug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>etoposide</td>
			<td>Selleckchem</td>
			<td>S1225</td>
			<td>topoisomerase II inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>selinexor</td>
			<td>Karyopharm Therapeutics</td>
			<td>na</td>
			<td>XPO1/CRM1 inhibitor, gift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinesin-5 inhibitor</td>
			<td>Merck Serono</td>
			<td>na</td>
			<td>gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cell growth medium</td>
			<td>HyClone (Fisher) or Mediatech</td>
			<td></td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% CO2/balance air, certified</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>Z03NI7222004379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm 4 well dish, 20mm glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>D35C4-20-1.5-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm dish, gridded glass bottom</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multi-well, glass bottom</td>
			<td>Cellvis</td>
			<td>P12-1.5H-N</td>
			<td>many companies available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus IX2-UCB controller</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR LumenPro200</td>
			<td>Prior Scientific</td>
			<td>Lumen200PRO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRIOR Proscan III motorized stage</td>
			<td>Prio Scientific</td>
			<td>H117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STEV chamber</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Environmental Controller Unit</td>
			<td>InVivo Scientific</td>
			<td>STEV.ECU.HC5 STAGE TOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon laser launch</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOLA light engine</td>
			<td>lumencor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iXon Ultra 897 EM-CCD</td>
			<td>ANDOR&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TOKAI HIT inclubation chamber</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

through the looking glass: time-lapse microscopy and longitudinal tracking of single cells to study anti-cancer therapeutics

anti-kanser ilaçları ile tek hücre yanıtı Popülasyon yanıtı belirlenmesinde önemli ölçüde katkıda bulunmaktadır ve bu nedenle genel bir sonuç önemli bir faktördür. Bağışıklık, akım sitometri ve sabit hücre deneyleri genellikle hücreler anti-kanser ilaçlar nasıl tepki incelemek için kullanılır. Bu yöntemler önemlidir, ancak onlar birkaç eksiklikler var. kanser ve normal hücreler arasındaki ve farklı kanser kaynaklı hücreler ve geçici ve nadir yanıtları arasındaki ilaç yanıtları değişkenlik nüfus ortalama analizleri kullanılarak doğrudan izlemek ve uzunlamasına bunları analiz edebilmek olmadan anlamak zordur. mikroskop, özellikle de görüntü canlı hücreler için uygundur. teknolojideki ilerlemeler, sadece hücre izleme değil, aynı zamanda hücresel yanıtların çeşitli gözlem sağlayan bir çözünürlükte rutin görüntü hücreleri sağlamaktadır. Biz sürekli time-lapse görüntüleme sağlayan detaylı bir yaklaşım tarifesasen sürece genellikle 96 saat kadar istediğiniz gibi ilaç yanıtı sırasında hücreler. yaklaşımın çeşitleri kullanılarak, hücreler hafta içinde izlenebilir. genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörler sayısız süreçler, yolları ve tepkilerinin istihdam ile takip edilebilir. Bu izleme ve hücre büyümesi ve hücre döngüsü ilerlemesinin, kromozom dinamiği, DNA hasarının ölçme ve hücre ölümünü içerir örnekleri göstermektedir. Biz de teknik ve esnekliği çeşitlerini tartışmak ve bazı ortak tuzaklar vurgulayın.

Uzun vadeli time-lapse mikroskopi ve doğrudan uzunlamasına izleme ilaç yanıtı sırasında birçok anti-kanser etkileri çalışma için izin verir. Şekil 1 &#39;de genel hatları sonra hücreler çeşitli örnekleri takip anti-kanser ilaçları ile tedavi edilen doğrulanmış floresan haberci ifade gösterilmiştir ve farklı yaklaşımlar kullanılarak analiz edilmiştir. Tek başına faz kontrast mikr...

Watch this Scientific Journal Video about Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics at JoVE.com

Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Looking Glass sayesinde: Time-lapse Mikroskopi ve Tek Hücre Boyuna izleme Anti-kanser Therapeutics Eğitim için

The response of single cells to anti-cancer drugs contributes significantly in determining the population response, and therefore is a major contributing ...

through-looking-glass-time-lapse-microscopy-longitudinal-tracking

Research

JoVE Journal

Medicine

10.9K Görüntüleme.  University of Colorado, Boulder. Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.

Video: Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics

Live Imaging to Study Microtubule Dynamic Instability in Taxane-resistant Breast Cancers

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs' long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics. 
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged &#945;-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.

In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.

Canlı Görüntüleme taksan dirençli Meme Kanserlerinde Mikrotubul dinamik dengesizlik Eğitim için

Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane ...

Kanser Araştırmaları

A Time-lapse, Label-free, Quantitative Phase Imaging Study of Dormant and Active Human Cancer Cells

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., proliferation, migration, and others) and in vivo models have been developed to investigate and characterize angiogenic and non-angiogenic cell phenotypes, these methods are time and labor intensive, and often require expensive reagents and instruments, as well as significant expertise. In a recent study, we used a novel quantitative phase imaging (QPI) technique to conduct time-lapse and labeling-free characterizations of angiogenic and non-angiogenic human osteosarcoma KHOS cells. A panel of cellular parameters, including cell morphology, proliferation, and motility, were quantitatively measured and analyzed using QPI. This novel and quantitative approach provides the opportunity to continuously and non-invasively study relevant cellular processes, behaviors, and characteristics of cancer cells and other cell types in a simple and integrated manner. This report describes our experimental protocol, including cell preparation, QPI acquisition, and data analysis.

Dormant and active cancer cell phenotypes were characterized using quantitative phase imaging. Cell proliferation, migration, and morphology assays were integrated and analyzed in one simple method.

Hızlandırılmış, etiket içermeyen, nicel faz uyuyan ve aktif insan kanser hücrelerinin çalışma görüntüleme

The acquisition of the angiogenic phenotype is an essential component of the escape from tumor dormancy. Although several classic in vitro assays (e.g., ...

Long-term Live-cell Imaging to Assess Cell Fate in Response to Paclitaxel

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over the past decade, new and innovative technologies have greatly enhanced the practicality of live-cell imaging. Cells can now be kept in focus and continuously imaged over several days while maintained under 37 &#176;C and 5% CO2 cell culture conditions. Moreover, multiple fields of view representing different experimental conditions can be acquired simultaneously, thus providing high-throughput experimental data. Live-cell imaging provides a significant advantage over fixed-cell imaging by allowing for the direct visualization and temporal quantitation of dynamic cellular events. Live-cell imaging can also identify variation in the behavior of single cells that would otherwise have been missed using population-based assays. Here, we describe live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel. We demonstrate methods to visualize whether mitotically arrested cells die directly from mitosis or slip back into interphase. We also describe how the fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator (FUCCI) system can be used to assess the fraction of interphase cells born from mitotic slippage that are capable of re-entering the cell cycle. Finally, we describe a live-cell imaging method to identify nuclear envelope rupture events.

Live-cell imaging provides a wealth of information on single cells or whole populations that is unattainable by fixed cell imaging alone. Here, live-cell imaging protocols to assess cell fate decisions following treatment with the anti-mitotic drug paclitaxel are described.

Uzun vadeli canlı hücre kader Paklitaksel karşılık olarak değerlendirmek için Imaging hücreli

Live-cell imaging is a powerful technique that can be used to directly visualize biological phenomena in single cells over extended periods of time. Over ...

Longitudinal Intravital Imaging of Brain Tumor Cell Behavior in Response to an Invasive Surgical Biopsy

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized treatment determination. However, perturbation of the tumor architecture by biopsy and other invasive procedures has been associated with undesired effects on tumor progression, which need to be studied in depth to further improve the clinical benefit of these procedures. Conventional static approaches, which only provide a snapshot of the tumor, are limited in their ability to reveal the impact of biopsy on tumor cell behavior such as migration, a process closely related to tumor malignancy. In particular, tumor cell migration is the key in highly aggressive brain tumors, where local tumor dissemination makes total tumor resection virtually impossible. The development of multiphoton imaging and chronic imaging windows allows scientists to study this dynamic process in living animals over time. Here, we describe a method for the high-resolution longitudinal imaging of brain tumor cells before and after a biopsy in the same living animal. This approach makes it possible to study the impact of this procedure on tumor cell behavior (migration, invasion, and proliferation). Furthermore, we discuss the advantages and limitations of this technique, as well as the ability of this methodology to study changes in the cancer cell behavior for other surgical interventions, including tumor resection or the implantation of chemotherapy wafers.

Here we describe a method for high-resolution time-lapse multiphoton imaging of brain tumor cells before and after invasive surgical intervention (e.g., biopsy) within the same living animal. This method allows studying the impact of these invasive surgical procedures on tumor cells&#39; migratory, invasive, and proliferative behavior at a single cell level.

Invaziv cerrahi biyopsiye yanıt olarak beyin tümörü hücre davranışının boyuna Intravital görüntüleme

Biopsies are standard of care for cancer treatment and are clinically beneficial as they allow solid tumor diagnosis, prognosis, and personalized ...

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer therapies. However, tumor-associated macrophages can be harmful to the tumor depending on the tumor microenvironment and can reversibly alter their phenotypic characteristics by either antagonizing the cytotoxic activity of immune cells or enhancing anti-tumor response. The molecular actions of macrophages and their interactions with tumor cells (e.g., phagocytosis) have not been extensively studied. Therefore, the interaction between immune cells (M1/M2-subtype TAM) and cancer cells in the tumor microenvironment is now a focus of cancer immunotherapy research. In the present study, a live cell coculture model of induced M1 macrophages and mouse mammary 4T1 carcinoma cells was developed to assess the phagocytic activity of macrophages using a time-lapse video feature using phase-contrast, fluorescent, and differential interference contrast (DIC) microscopy. The present method can observe and document multipoint live-cell imaging of phagocytosis. Phagocytosis of 4T1 cells by M1 macrophages can be observed using fluorescent microscopy before staining 4T1 cells with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). The current publication describes how to coculture macrophages and tumor cells in a single imaging dish, polarize M1 macrophages, and record multipoint events of macrophages engulfing 4T1 cells during 13 h of coculture.

Macrophage phagocytic activity against cancer cells, specifically 4T1 mouse mammary carcinoma cells, was imaged in this study. The live cell coculture model was established and observed using a combination of fluorescent and differential interference contrast microscopy. This assessment was imaged using imaging software to develop multipoint time-lapse video.

Eş-Kültürlerde M1 Makrofaj-4T1 Fare Mammary Karsinom Hücrelerinde Fagositik Aktivitenin Zaman Atlamalı 2D Görüntülemesi

Tumor-associated macrophages (TAMs) have been identified as an important component for tumor growth, invasion, metastasis, and resistance to cancer ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Tıp

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Birincil Preneoplastic Meme Epitel Hücrelerinin Time-lapse görüntüleme Meme Kanseri Genetik Fare Modelleri türetilen

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

Tek hücreli Monitor hücre biyolojisi ve birden çok sinir nüfus Lineage ilerlemesini izleme ve ardından görüntüleme yaşamak

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Nörobilim

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an otherwise dynamic system, and successive phases are easily overlooked or misinterpreted. Live-cell imaging and time-lapse microscopy, in which living cells can be followed for hours or even days in a more or less continuous fashion, are therefore very informative. The protocol described here allows for the investigation of the fate of chemotherapeutic nanoparticles after the delivery of doxorubicin (dox) in living cells. Dox is an intercalating agent that must be released from its nanocarrier to become biologically active. In spite of its clinical registration for more than two decades, its uptake, breakdown, and drug release are still not fully understood. This article explores the hypothesis that lipid-based nanoparticles are taken up by the tumor cells and are slowly degraded. Released dox is then translocated to the nucleus. To prevent fixation artifacts, live-cell imaging and time-lapse microscopy, described in this experimental procedure, can be applied.

Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles

Live-cell imaging is a powerful tool to visualize dynamic processes. The examination of fixed cells provides only static pictures, which can lead to misinterpretation and confusion about the process. This work presents a method to study uptake, drug release, and intracellular localization of liposomal nanoparticles in living cells.

Vitro Lipid tabanlı nano tanecikleri tarafından canlı hücre Chemotherapeutics keşfetmek için Imaging teslim kullanma

Conventional imaging techniques can provide detailed information about cellular processes. However, this information is based on static images in an ...