Gli autori desiderano ringraziare Bofan Wu e Christian Raithel per l&#39;assistenza tecnica e Michael Rieger per la sua introduzione al live-cell imaging. Supportato da NCI, NIH RO1CA112176 (PAF), NCI, NIH. R01CA89041-10S1 (PAF), Deutscher Akademischer Austaush Dienst eV A/09/72227 rif. 316 (REN), Dipartimento della Difesa W81XWH-11-1-0074 (REN), WCU (World Class University) programma attraverso la Fondazione per la Ricerca Nazionale della Corea finanziato dal Ministero dell&#39;Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (R31-10069) (PAF ), NIH RR025828 IG20-01 (Barriera Attrezzature Roditore Fondo), e NCI NIH 5P30CA051008 (Microscopia e Imaging Risorse e degli animali condivise).

<html> 1. Schema generale <ol><li> Generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie preneoplastiche da ghiandole mammarie di ingegneria genetica e controllo topi wild-type. </li><li> Cattura immagini dal vivo di cellule ogni 15 min con un&#39;immagine software Volocity di acquisizione (versione 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA) per un massimo di 5 giorni. </li><li> Vista time-lapse immagini direttamente per valutare i tempi e meccanismo di formazione delle cellule epiteliali colonie, l&#39;incidenza di apoptosi, e la graduale di cambiamenti morfologici. </li><li> Convertire Volocity generato. Pile TIFF a. File JPG utilizzando Automation Microscopia MetaMorph &amp; Analysis Software immagini (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) e rinominare i file di immagini digitali (la ridenominazione 2.1.6, <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get / Sistema / Gestione di file / THE-Rename.shtml</a> ) per garantire la compatibilità con il software di monitoraggio strumento Timm (TTT,tz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://www.helmholtz-muenchen.de/en/isf/hematopoiesis/software-download/index. html). </li><li> Utilizzando TTT, generare mappe cellulari destino per la determinazione del tempo che intercorre tra divisioni cellulari (vite cellulari) e dei modelli di divisione cellulare (simmetrica rispetto asimmetrica). </li><li> Analizzare i dati quantitativi di passaggi 3 e 5 di cui sopra per determinare se ci sono differenze statisticamente significative tra i diversi modelli di topi geneticamente modificati e / o di tipo selvatico controlli. </li></ol> 2. Generazione di colture primarie di cellule epiteliali mammarie <ol><li> Preparare supporti completi per l&#39;isolamento di singole cellule epiteliali mammarie a seguito di una variazione di istruzioni del produttore (EpiCult-B mouse Media Kit, Stemcell Technologies, Vancouver, BC). Combinare 450 ml Epi-Cult-B media, 50 ml Epi-Cult B integratore proliferazione, 5% siero fetale bovino (FBS), 50 ug / ml di penicillina / streptomicina (PenStrep) e 10 ng / ml di fattore di crescita epidermico (EGF). </li><li> Preparare dissociazione supporti combinando 1 parte di un 10x Collagenasi / Ialuronidasi miscela con 9 parti multimediali complete da 2.1. </li><li> Eutanasia mouse e procedere immediatamente a necroscopia. Posizionare il mouse sul dorso su una piattaforma necroscopia polistirolo e fissare tutti e quattro gli arti così la pelle ventrale è tesa. Saturare pelle ventrale e capelli, compresa quella sovrastante gli arti, con il 70% di etanolo. Esporre # 2/3 (toracica) e # 4/5 (inguinale) ghiandole mammarie facendo una incisione mediana attraverso la pelle (non inserire il peritoneo), che si estende in un Y-incisione attraverso la pelle mediale di ciascun arto anteriore e rovesciata incisione a Y attraverso la cute mediale di ogni arto posteriore. </li><li> Utilizzando smussa, separare la pelle dal underlyingperitoneum, tirare indietro su entrambi i lati della pelle fino a quando non è teso, e fissarlo alla piattaforma necroscopia polistirolo con perni. Partendo dal lato esterno, utilizzare smussa con uso giudizioso di Disseforbici ction per isolare il inguinale intatto e / o toracici ghiandole mammarie dal sottostante tessuto connettivo e muscolare. Inserire non più di due ghiandole mammarie in un 10 cm piastra di Petri sterile e passare alla cappa di coltura tissutale. </li><li> Nella cappa di coltura, per esaminare le ghiandole linfonodi mammari che sono identificati come piccole, ben circoscritti noduli con un colore giallastro. Rimuovere linfonodi dalla ghiandola circostante con bisturi sterile e pinzette. Tritare tessuto mammario in ~ 1 mm 3 cubi con due bisturi sterili, uno in ogni mano. </li><li> Posto tritata tessuto mammario in 5 ml di dissociazione Media, mescolare delicatamente pipettando su e giù 2-3 volte usando una pipetta 10 ml, ed incubare una notte (fino a ~ 16 ore) in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2 in un provetta da 50 ml con tappo allentato. </li><li> La mattina dopo, preparare una miscela fredda di soluzione salina bilanciata di Hanks 1 parte &#39;(HBSS) contenente 2% di FBS e 4 parti tamponata di cloruro di ammonio soluzione per promuovere rosso bllisi cellulare ood (HFAmCl) nonché HBSS freddo addizionato con 2% FBS (HF). Pre-riscaldare Tripsina-EDTA (0,25%), 5 mg / ml in dispasi soluzione salina bilanciata di Hank Modified, 1 mg / ml DNasi I, e mezzi completi. </li><li> Rimuovere il tubo conico da centrifuga con il tessuto mammario dal termostato e delicatamente impulsi vortice 2-3 sec due volte. Centrifugare la provetta a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C), ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in un minimo di 10 HFAmCl ml e centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 3 ml di Tripsina-EDTA al pellet e mescolare prima con una pipetta da 5 ml e poi con una micropipetta P1000 fino filamentoso (1-3 min). Aggiungere 10 ml di HF, centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante. </li><li> Aggiungere 2 ml di 5 mg / ml dispasi e 200 microlitri di 1 mg / ml DNasi I pellet e mescolare con una micropipetta P1000 per 1 min. Campione deve essere cloudy ma non filante. Se filante, aggiungere 100 ml di DNasi I e mescolare ancora. </li><li> Aggiungere 10 ml fredda HF, filtrare con un colino cella 40 um e centrifugare a 450 g per 5 min (temperatura ambiente oa 4 ° C) ed eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet finale in Media completi. Quantificare il numero totale di cellule (utilizzando un emocitometro o Coulter Counter). Due ghiandole mammarie ottenere approssimativamente 1 x 10 6 a 1 x 10 7 cellule. Piastra cellule primarie epiteliali in un fondo piatto piastra da 6 pozzetti ad una densità di 1,5 x 10 5 cellule per pozzetto. </li></ol> 3. Live-cell imaging <ol><li> Subito dopo placcatura cellule, posizionare il piastra da 6 pozzetti sicuro su un palco microscopio di un 5% di CO 2 / saturo humidity/37 ° C Temperatura della camera di incubazione. Regolare il condensatore per l&#39;illuminazione Kohler e il centro degli anelli di fase. Per gli esperimenti qui presentati, una rovesciata Nikon Eclipse TE300/PerkinElmer Spinning Disc Confocalsistema di microscopia in contrasto di fase widefield modalità con una lente obiettivo 10x è stato utilizzato. </li><li> Aprire il software di acquisizione delle immagini, creare e denominare una biblioteca per i time-lapse immagini, e salvare in una posizione con spazio sufficiente per i file di grandi dimensioni. Gli esperimenti qui presentati utilizzato un&#39;immagine software Volocity di acquisizione (versione 5.3.1, PerkinElmer, Waltham, MA). </li><li> Consentire alla piastra di equilibrare nel microscopio incubatore per almeno 15 min. Abbassare le lenti per evitare la fase-obiettivo interferenze. Sotto il titolo &quot;Stage&quot;, selezionare &quot;Calibrare Stage&quot;. Riacquisire il piano focale, insieme Z = zero ai punti di imaging x, y, z scheda e segnare selezionando &quot;Aggiungi punto&quot; nella sezione &quot;Stage&quot; voce. Inserire punti al centro di ciascun pozzetto della piastra da 6 pozzetti per l&#39;imaging come l&#39;imaging a contrasto di fase possono essere distorte vicino alla periferia di pozzi di plastica. Disporre i punti in una piazza in 4 x 4 campi (650 micron x 700 micron campi), ciascuno con una sovrapposizione di piccole dimensioni (circa il 5%). Salvare i punti selezionati in &quot;Stage. &quot; </li><li> In &quot;Stage&quot; selezionare &quot;Crea mappa focus&quot; e seguire le istruzioni per impostare la messa a fuoco di ogni punto. Impostare tempi di acquisizione dell&#39;immagine e catturarne 4 immagini all&#39;ora (ogni 15 min). Questo può essere regolato a seconda delle esigenze del test specifico. Salvare la mappa di messa a fuoco in &quot;Stage&quot;. </li><li> Fare clic destro sulla destra &quot;Acquisizione di immagini di&quot; strumento bar a bordo e salvare le impostazioni di imaging. Premere il pulsante di registrazione per iniziare l&#39;imaging. Dopo 1 ora, controllare la messa a fuoco delle immagini per vedere se è necessaria una regolazione. </li><li> Monitorare e continuare l&#39;imaging dal vivo per 5 giorni, che termina quando le cellule diventano confluenti. </li></ol> 4. Visualizzazione diretta di time-lapse immagini per valutare i tempi e Meccanismo di Formazione Iniziale epiteliale Colony cellulare, Incidenza di apoptosi, e fase di cambiamenti morfologici <ol><li> Visione diretta del time-lapse immagini possono essere effettuare compatibile con qualsiasi software di visualizzazione video (ad esempio <a href="http://www.real.com/" target="_blank">http:</a>/ / Www.real.com/ realplayer o altri software freeware o disponibile in commercio). Le immagini possono essere visualizzate in formato. TIFF in questo passaggio o dopo la conversione in file JPG. (Vedere il punto 5). </li><li> Per determinare meccanismo di formazione della colonia iniziale, inizia con una immagine singola pila rappresenta un sito di imaging sulla piastra. In frames iniziali, le cellule saranno galleggiante. Seguire immagini seriali per determinare quando la prima cellula epiteliale aderisce alla piastra. In questa fase, le cellule epiteliali possono essere identificati e differenziati da fibroblasti di loro morfologia più cuboidale. Segui questa singola cellula epiteliale attraverso immagini seriali e seguire il suo destino nei successivi 24 ore. Registrare se diventa circondata da altre cellule epiteliali o subisce divisione cellulare o apoptosi. Se circondata da cellule epiteliali, il meccanismo di formazione di colonie può essere determinata direttamente visualizzando se le cellule circostanti sono derivati ​​da cellule galleggianti che poi aggregato con la cellula iniziale aderente (s) odalla divisione della cellula iniziale aderente. Registrare il numero di colonie formate da aggregazione cellulare rispetto divisione cellulare durante le prime 24 ore. </li><li> Per determinare il numero di cellule aderenti inizialmente che subiscono apoptosi in un periodo di tempo specifico, seguite immagini seriali per la comparsa di caratteristiche classiche di sviluppo apoptosi in una cellula che è stata aderente ( <a href="http://www.alsa.org/research/about-als-research/cell-death-and-apoptosis.html" target="_blank">http://www.alsa.org/research/about -als-research/cell-death-and-apoptosis.html</a> ), e il numero di cellule apoptotiche identificati durante l&#39;intera durata del imaging o in tempi specifici registrata. </li><li> Nel corso del tempo, le cellule epiteliali in coltura alterare la loro morfologia da una forma iniziale cuboidali ad un aspetto più allungato coerente con EMT. Segui le immagini seriali per determinare il giorno / ora dopo placcatura quando ciò si verifica. </li></ol> 5. Image File Modifica <ol><li&gt; Tramite il software Volocity, esportare i file di immagine TIFF a pile. Qui Automation Microscopia MetaMorph &amp; Analysis Software immagini (Molecular Devices, LLC Sunnyvale, CA) è stato utilizzato per aprire i file TIFF di stack e sono stati poi salvati in MetaMorph come immagini JPG singole.. </li><li> Rinominare le cartelle di immagini e file in base ai requisiti per il software Tracking Tool Timm Utilizzare un programma freeware come il 2.1.6 Rinomina ( <a href="http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml" target="_blank">http://www.softpedia.com/get/System/File-Management/THE-Rename.shtml</a> ) per rinominare i file in gruppi. Creare una cartella contenente tutte le cartelle ei file della sperimentazione e il nome della cartella (ad esempio, </em&gt; EXPERIMENTNAME). </li><li> Creare una sottocartella per ogni punto / posizione in cui è stato ripreso la cultura. Denominare le sottocartelle: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER. Il numero di posizione dovrebbe avere 3 cifre. Esempio: 072511RN_p001. Mettere tutti i file di immagine di tale posizione individuale nella sottocartella. </li><li> Aggiungere il timepoint (utilizzando 5 cifre) e numero di canale (poiché vi è un solo canale in campo chiaro, utilizzare &quot;0&quot;) alla fine di ogni nome di file in questo formato: EXPERIMENTNAME_pPOSITIONNUMBER_tTIMEPOINT_wCHANNELNUMBER.jpgExample: 072511RN_p001_t00001_w0.jpg </li><li> Generare un file di log per ogni posizione per prima cosa scaricare il programma gratuito TTTlogfileconverter dal sito TTT. Avviare il programma TTTlogfileconverter e selezionare la cartella esperimento. Un intervallo di ingresso dell&#39;immagine (in secondi). Per una foto scattata ogni 15 minuti, immettere 900 sec. Quindi, premere il pulsante verde segreto dei file di log. </li></ol> 6. Generazione di Mappe Cellulari destino delle cellule singole Utilizzo TTT <ol><li> CReate una cartella chiamata TTTexport e una sottocartella denominata TTTfiles in cui tutti i dati delle celle di tracciamento saranno conservati secondo le istruzioni del software TTT </li><li> Avviare il programma di TTT, selezionare iniziali dell&#39;utente e fare clic su &quot;Continua&quot;. </li><li> Premere il tasto &quot;Set NAS&quot;, selezionare l&#39;utente creato cartella &quot;TTTexport&quot;, e fare clic su Ok. Nel browser, selezionare una cartella di esperimento, selezionare una cartella di posizione, quindi premere &quot;posizione Carica&quot; ​​pulsante. </li><li> Impostare il fattore oculare di &quot;10x&quot;. Caricare il numero di immagini richieste (carico tutte le immagini è raccomandato per la prima volta). </li><li> Nella finestra della cella editor, selezionare &quot;Nuova colonia&quot; nel menu File. Nella finestra del filmato, premere il tasto &quot;cella Track&quot; o F2 per iniziare a tracciare una cella. </li><li> Identificare una cella del MOvie finestra e uso del mouse per posizionare il cursore sulla cella. Un cerchio con il numero della cella dovrebbe apparire dopo F2 è stato fatto clic. Utilizzare il tasto &quot;0&quot; sul tastierino numerico della tastiera per monitorare il posizionamento della cella e passare alla foto successiva. Spostare il cursore per rispettare la posizione di ogni cella in ogni fotogramma. Per cancellare una traccia e tornare alla precedente immagine premere il tasto &quot;Canc&quot; del tastierino numerico. Per spostare i fotogrammi in avanti senza il tracciamento della stampa cella &quot;3&quot;, e per tornare indietro senza di monitoraggio premere il tasto &quot;1&quot; del tastierino numerico. </li><li> Per contrassegnare una divisione cellulare fare clic sul pulsante &quot;divisione&quot; nella finestra del filmato. Per celebrare la morte cellulare fare clic su &quot;morte cellulare&quot; nella finestra del filmato. Una volta che si è verificata una divisione, le cellule figlie possono essere monitorati nella stessa mappa destino della cellula facendo clic destro sul simbolo del cerchio della cellula figlia designato nella finestra dell&#39;editor cella per iniziare a monitorare automaticamente in modalità. </li><li> Premere F10 per salvare l&#39;albero. Ogni albero salverà nella piega di uscita designatoer (TTTExport). Per avviare una nuova mappa destino cellulare, selezionare &quot;Nuova colonia&quot; sotto &quot;File&quot; e poi dal menu &quot;Apri&quot; nella finestra dell&#39;editor cella. </li><li> Riportino in una tabella i dati di durata delle celle dopo aver raccolto da &quot;Cell dati&quot; scheda nella finestra dell&#39;editor cella. </li></ol> 7. Analisi statistiche <ol><li> Utilizzare Student t-test (se confrontare due genotipi) o ANOVA (se confrontando&gt; due genotipi) per determinare se le differenze nei dati parametrici come il numero di colonie di cellule iniziali, la durata delle cellule o ore fino alla comparsa di EMT tra diversi genotipi sono statisticamente significativa. Frequenza apoptotica può essere paragonato come il numero / numero totale di cellule placcati con Student t-test o ANOVA o con Mann-Whitney o Kruskal-Wallis quando derivato come percentuale di cellule aderenti. </li><li> Eseguire i test di potenza usando i dati da una analisi dei primi esperimenti per determinare il numero di repliche sperimentali devono svolgere e mappe destino cellulare generato da ciascun campione replicato per s adeguatopotenza tatistical utilizzando freeware disponibile (ad esempio <a href="http://statpages.org/" target="_blank">http://statpages.org/</a> ). Negli esperimenti qui presentati, colture di cellule derivate da tre topi per genotipo sono stati sufficienti a determinare se ci fossero differenze statisticamente significative nella formazione delle cellule delle colonie e la durata delle celle quando specifiche modificazioni genetiche sono state fatte. </li></ol>

<ol>
	<li>Jones, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen+signaling+pathways+collaborates+with+loss+of+Brca1+to+promote+development+of+ERalpha-negative+and+ERalpha-positive+mammary+preneoplasia+and+cancer.">Activation of estrogen signaling pathways collaborates with loss of Brca1 to promote development of ERalpha-negative and ERalpha-positive mammary preneoplasia and cancer.</a> Oncogene. 27, 794-802 (2008).</li><li>Burga, L. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+proliferation+and+differentiation+properties+of+primary+mammary+epithelial+cells+from+BRCA1+mutation+carriers.">Altered proliferation and differentiation properties of primary mammary epithelial cells from BRCA1 mutation carriers.</a> Cancer Res. 69, 1273-1278 (2009).</li><li>Li, M., Wagner, K., Furth, P. A., Ip, M., Asch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+primary+mammary+epithelial+cells+and+transfection+by+viral+and+nonviral+methods.">Preparation of primary mammary epithelial cells and transfection by viral and nonviral methods.</a> Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer. , (2000).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+stem-cell-driven+regeneration+in+mammals.">Imaging stem-cell-driven regeneration in mammals.</a> Nature. 453, 345-351 (2008).</li><li>Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+single-cell+imaging+of+mammalian+stem+cells.">Long-term single-cell imaging of mammalian stem cells.</a> Nature Methods. 8, S30-S35 (2011).</li><li>Eilken, H. M., Nishikawa, S. -. I., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+single-cell+imaging+of+blood+generation+from+haemogenic+endothelium.">Continuous single-cell imaging of blood generation from haemogenic endothelium.</a> Nature. 457, 896-900 (2009).</li><li>Kokkaliaris, K. D., Loeffler, D., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tracking+hematopoiesis+at+the+single-cell+level.">Advances in tracking hematopoiesis at the single-cell level.</a> Current opinion in hematology. , (2012).</li><li>Rieger, M. A., Hoppe, P. S., Smejkal, B. M., Eitelhuber, A. C., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+cytokines+can+instruct+lineage+choice.">Hematopoietic cytokines can instruct lineage choice.</a> Science. 325, 217-218 (2009).</li><li>Rieger, M. A., Schroeder, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+lineage+choice+by+hematopoietic+cytokines.">Instruction of lineage choice by hematopoietic cytokines.</a> Cell Cycle. 8, 4019-4020 (2009).</li><li>Heinrich, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+subtype-specific+neurons+from+postnatal+astroglia+of+the+mouse+cerebral+cortex.">Generation of subtype-specific neurons from postnatal astroglia of the mouse cerebral cortex.</a> Nat. Protoc. 6, 214-228 (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi finanziari.

Passaggi critici È importante garantire che ghiandole mammarie sono raccolti da topi della stessa età per controllare legate all&#39;età variabilità mammaria comportamento delle cellule epiteliali. Quando le cellule placcatura, lo stesso numero di celle deve essere placcato in ogni pozzetto per ogni esperimento. Le cellule devono essere relativamente sparsa quando placcatura in modo che le culture non diventino confluenti troppo rapidamente rendendo possibile seguire più celle individuali ...

Modelli di topi geneticamente ingegnerizzati sono strumenti per studiare e capire come diverse lesioni genetiche contribuiscono al rischio di sviluppare il cancro al seno. Ad esempio, i topi geneticamente modificati hanno dimostrato che la combinazione di tre fattori: perdita del full-length del cancro al seno 1, ad esordio precoce (BRCA1) gene in cellule epiteliali mammarie, proteina p53 tumore (TP53) della linea germinale haploinsufficiency, e delle ghiandole mammarie epiteliali cellula bersaglio up-regolata estrogeni recettore alfa (ERa) risultati di espressione nello sviluppo del cancro mammario nel 100% dei Brca1 floxed (f) Virus del tumore 11/f11/Mouse mammaria (MMTV) -Cre/p53 + / -/tetracycline-operator ( tet-op) -ER/MMTV-reverse transattivatore della tetraciclina (rtTA topi di 12 mesi di età rispetto alle percentuali più basse riportate in Brca1 f11/f11/MMTV-Cre/p53 + / - topi senza ERa over-espressione (~ 50 - 60%) e BRCA1 topi f11/f11/MMTV-Cre senza TP53 haploinsufcienza (&lt;5%). 1 Dinamica time-lapse imaging del comportamento di preneoplastiche primarie cellule epiteliali mammarie rivela differenze nel comportamento cellulare che sono meno facilmente apprezzati in sezioni di tessuto statiche. Alterazioni nella proliferazione e la differenziazione sono stati osservati in cellule primarie mammarie dai vettori umani mutazione BRCA1. 2 Creazione di monocellulari sospensioni primarie di cellule epiteliali mammarie normali e di topi geneticamente ingegnerizzati sono generati attraverso la dissociazione enzimatica del tessuto ghiandolare mammario asportato. 3 Time-lapse le immagini vengono visualizzate per valutare meccanismi ed i tempi di comparsa delle cellule delle colonie e l&#39;incidenza di cambiamenti morfologici nelle cellule tra cui transizione epitelio-mesenchimale (EMT) e l&#39;apoptosi. Generazione di mappe destino cellulare, la quantificazione del periodo di tempo tra divisioni cellulari (cellule vite), e la determinazione di modelli di divisione cellulare è facilitata dall&#39;utilizzo di singola cellula inseguimento. TimmTracking Tool &#39;s (TTT) è un software disponibile pubblicamente usato per generare monocellulari mappe destino. La sua utilità nel chiarire i meccanismi di destino cellulare è stata stabilita 4,5 esaminando normale sviluppo delle cellule staminali ematopoietiche 6-9 e la generazione di neuroni. 10

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> EpiCult-B mouse medio basale </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05610 </td><td></td></tr><tr><td> EpiCult-B proliferazione Integratori mouse </td><td> StemCell Technologies </td><td> 05612 </td><td></td></tr><tr><td> ricombinante umana Epidermal Growth Factor (rhEGF) </td><td> StemCell Technologies </td><td> 02633 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenasi / ialuronidasi </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07912 </td><td></td></tr><tr><td> Scapels monouso </td><td> Piuma </td><td> 2975 # 10 </td><td></td></tr><tr><td> Salt Hanks &#39;soluzione equilibrata </td><td> StemCell Technologies </td><td> 37150 </td><td></td></tr><tr><td> Lammonium Chloride </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07800 </td><td></td></tr><tr><td> Tryspin-EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td></td></tr><tr><td> Dispasi </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07913 </td><td></td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07900 </td><td></td></tr><tr><td> 40 filtro cella pm </td><td> StemCell Technologies </td><td> 27305 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06100 </td><td></td></tr><tr><td> PenStrep </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td></td></tr></tbody></table>

time-lapse imaging of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer

Time-lapse imaging può essere usato per confrontare il comportamento di colture primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da diversi modelli murini geneticamente di cancro al seno. Ad esempio, il tempo tra le divisioni cellulari (vite cellulari), i numeri di cellulare per apoptosi, l&#39;evoluzione dei cambiamenti morfologici, e il meccanismo di formazione di colonie possono essere quantificati e confrontati in cellule che trasportano specifiche lesioni genetiche. Colture primarie di cellule epiteliali mammarie sono generati da ghiandole mammarie, senza tumore palpabile. Ghiandole sono accuratamente asportato con una chiara separazione dal muscolo adiacente, linfonodi vengono rimossi, e sospensioni monocellulari arricchite di cellule epiteliali mammarie sono generati sminuzzando tessuto mammario seguita da dissociazione enzimatica e filtrazione. Monocellulari sospensioni vengono piastrate e posti direttamente sotto un microscopio all&#39;interno di una camera incubatore per live-cell imaging. Sedici 650 micron x 700 micron campi in una configurazione 4x4 per ogni well di una piastra da 6 pozzetti vengono esposte ogni 15 min per 5 giorni. Time-lapse immagini vengono esaminati direttamente a misurare i comportamenti cellulari che possono includere meccanismi e la frequenza della formazione delle cellule colonia entro le prime 24 ore di placcatura cellule (aggregazione contro proliferazione cellulare), l&#39;incidenza di apoptosi, e la graduale eliminazione di cambiamenti morfologici. Singola cella di monitoraggio viene utilizzato per generare mappe di cellule destino per la misurazione della durata delle singole celle e le indagini dei modelli di divisione cellulare. I dati quantitativi sono analizzati statisticamente per valutare le differenze significative nel comportamento correlati con specifiche lesioni genetiche.

Cellule epiteliali e fibroblasti può essere distinto da morfologia cellulare. Cellule epiteliali hanno una forma cubica (Figura 1A-B) e formano colonie di cellule (Figura 1A). Fibroblasti, un tipo di cellule stromali, hanno una morfologia allungata (Figura 1C). Le cellule sono state arrotondate e galleggianti all&#39;insorgenza di imaging (Figura 2A-D). Dopo fissaggio alla piastra piatta e sono diventati dimostrato un aspet...

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Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

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11.7K Views.  Georgetown University. Time-lapse imaging viene utilizzato per valutare il comportamento di primarie preneoplastiche cellule epiteliali mammarie derivate da modelli murini geneticamente modificati di rischio di cancro al seno per determinare se ci sono correlazioni tra i parametri specifici di comportamento e distinte lesioni genetiche.

Video: Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In Imaging bioluminescenza in vivo di Dinamica Tumore ipossia di metastasi cerebrali cancro al seno in un modello murino

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

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Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

Paziente coltura cellulare derivato e isolamento di CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativi staminali alle cellule tumorali di melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Avvio del carcinoma metastatico della mammella dalla Targeting del duttale con Adenovirus-Cre: A Novel modello di topo transgenico di cancro al seno

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Metodo per ottenere primarie cellule tumorali ovariche da campioni solidi

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

Tracking the Mammary Architectural Features and Detecting Breast Cancer with Magnetic Resonance Diffusion Tensor Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of life and survival of breast cancer patients. In this paper a new approach for the detection of breast cancer is described, based on tracking the mammary architectural elements using diffusion tensor imaging (DTI). 
The paper focuses on the scanning protocols and image processing algorithms and software that were designed to fit the diffusion properties of the mammary fibroglandular tissue and its changes during malignant transformation. The final output yields pixel by pixel vector maps that track the architecture of the entire mammary ductal glandular trees and parametric maps of the diffusion tensor coefficients and anisotropy indices. 
The efficiency of the method to detect breast cancer was tested by scanning women volunteers including 68 patients with breast cancer confirmed by histopathology findings. Regions with cancer cells exhibited a marked reduction in the diffusion coefficients and in the maximal anisotropy index as compared to the normal breast tissue, providing an intrinsic contrast for delineating the boundaries of malignant growth. Overall, the sensitivity of the DTI parameters to detect breast cancer was found to be high, particularly in dense breasts, and comparable to the current standard breast MRI method that requires injection of a contrast agent. Thus, this method offers a completely non-invasive, safe and sensitive tool for breast cancer detection.

We describe how to obtain parametric and vector maps of the diffusion tensor of the breast using magnetic resonance imaging. The protocol and final output following imaging processing are tailored for tracking breast architectural features and detecting breast malignancy.

Monitoraggio delle mammarie caratteristiche architettoniche e Rilevamento cancro al seno con risonanza magnetica del tensore di diffusione Imaging

Breast cancer is the most common cause of cancer among women worldwide. Early detection of breast cancer has a critical role in improving the quality of ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.