Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health [R01 AI163333] per CMR. Riconosciamo l'ulteriore sostegno finanziario fornito alla West Virginia University Flow Cytometry and Single Cell Core Facility dalle seguenti sovvenzioni: WV CTSI grant GM104942, Tumor Microenvironment CoBRE grant GM121322 e NIH grant OD016165.

Tutte le procedure sono state approvate dai comitati istituzionali per la cura e l'uso degli animali della West Virginia e sono state eseguite seguendo le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio nazionale delle ricerche. Per questo studio sono stati utilizzati cuccioli di topo C57BL/6J. I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.
1. Preparazione dei terreni
<ol><li>Preparare 3 mL di terreno di coltura MEM integrati con FBS al 10%, 2 mM di glutammina, 25 mM di HEPES e penicillina (100 U/mL)/streptomicina (100 μg/mL) in una provetta da centrifuga da 5 mL e mantenerla in ghiaccio.</li>
	<li>Se necessario per conservare i progenitori del midollo osseo in azoto liquido, preparare terreni di congelamento contenenti il 10% di DMEM, l'80% di FBS e il 10% di DMSO.</li>
	<li>Per un DMEM completo, preparare DMEM integrato con il 10% di FBS, 2 mM di glutammina, 25 mM di HEPES e penicillina (100 U/mL)/streptomicina (100 μg/mL).</li>
	<li>Per la differenziazione dei macrofagi, preparare DMEM integrato con FBS al 10%, glutammina 2 mM, penicillina (100 U/mL)/streptomicina (100 μg/mL) e surnatante cellulare L929 al 10% 9,10,11.</li>
</ol>2. Preparazione del surnatante di cellule L929
<ol><li>Scongelare le cellule L929 conservate in azoto liquido e trasferirle in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5 mL di DMEM completo. Centrifugare a 350 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 5 mL di terreno DMEM completo e seminarle in un pallone di coltura tissutale T25 alla densità di 2×105 cellule. Contare le celle con un contatore di celle automatizzato utilizzando il tripano blu allo 0,4%. Incubare a 37 °C con il 5% di CO2 fino a raggiungere il 70% di confluenza.</li>
	<li>Per staccare le cellule, lavarle prima con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aspirare il PBS e sostituirlo con 2,5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%.</li>
	<li>Incubare a 37 °C con CO2 al 5% per 5 minuti e aggiungere 5 mL di DMEM completo.</li>
	<li>Raccogliere le celle e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere il pellet di cella in 15 mL di terreno DMEM completo e trasferirlo in un matraccio T75.</li>
	<li>Incubare a 37 °C con CO2 al 5% fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 90%, quindi raccogliere il terreno e centrifugare a 500 x g per 5 minuti a 4 °C. Filtrare il terreno contenente M-CSF attraverso un filtro da 0,45 μm e congelare a -80 °C in aliquote da 5 mL.</li>
</ol>3. Preparazione degli animali
<ol><li>Sotto una cabina di biosicurezza, separare accuratamente i cuccioli di topo C57BL/6J di 7-9 giorni (una cucciolata di 6 cuccioli) dalla madre e metterli in una gabbia separata.</li>
	<li>Immergere un batuffolo di cotone in 2 ml di isoflurano di grado veterinario in una campana di vetro o in un'altra camera di contenimento.</li>
	<li>Metti un cucciolo nella camera e chiudi il coperchio. Monitorare il neonato per circa 90 secondi per assicurarsi che diventi immobile e incosciente.</li>
	<li>Rimuovi rapidamente il cucciolo e decapitalo con forbici affilate (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente) prima che il cucciolo possa riprendere conoscenza. NOTA: I neonati non respirano sufficientemente profondamente per l'eutanasia con la sola inalazione di isoflurano.</li>
	<li>Assicurati di chiudere il coperchio del contenitore dopo che ogni cucciolo è stato rimosso. Lo stesso batuffolo di cotone può essere utilizzato per 5-7 cuccioli.</li>
</ol>4. Isolamento del midollo osseo neonatale
<ol><li>Sterilizzare il corpo del neonato con etanolo al 70%.</li>
	<li>"Usando una pinza e forbici chirurgiche a punta fine, fai un'incisione tra il addome e zampe posteriori. Rimuovere la pelle tirando verso il piede degli arti posteriori.</li>
	<li>Raschiare il tessuto connettivo e il muscolo attaccato alle ossa usando una pinza a spigoli vivi.</li>
	<li>Tagliare la tibia e il femore, come mostrato in Figura 1, con le forbici per staccare e rimuovere. Usando una pinza, posiziona queste ossa nel tubo multimediale sul ghiaccio. Ripeti il processo per ogni cucciolo.</li>
	<li>Trasferire le ossa con l'aiuto di una pinza in un colino da 40 μm con una provetta di raccolta. Schiacciare le ossa e rilasciare il midollo premendo con uno stantuffo da siringa da 3 ml contro il colino.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 350 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato in NaCl allo 0,2%, una soluzione ipotonica per la lisi degli eritrociti. Aggiungere immediatamente un volume uguale di NaCl all'1,6% per portare la soluzione a isotonica.</li>
	<li>Centrifugare a 350 x g per 5 min a 4 °C e rimuovere la soluzione di lisi.</li>
	<li>Risospendere in DMEM completo per l'uso immediato o congelare i terreni per la conservazione e contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato. NOTA: Per il presente studio, questo metodo ha prodotto 6,55 (± 1,44) × 106 cellule di midollo osseo/cucciolo (Figura 1E).</li>
	<li>Conservare le celle a -80 °C in un mezzo di congelamento o utilizzarle immediatamente come descritto di seguito. NOTA: A causa dell'età, le ossa sono trasparenti e abbastanza chiare da visualizzare il midollo attraverso di esse. È importante fare attenzione mentre si tirano le ossa poiché l'applicazione di una leggera pressione su di esse può essere sufficiente per rilasciare il midollo. Il midollo nelle ossa neonatali è sotto forma di liquido piuttosto che di un filo intatto che si trova nelle ossa adulte. È difficile raccogliere il midollo se fuoriesce durante la raccolta delle ossa.</li>
</ol>5. Differenziamento dei macrofagi di derivazione midollare neonatale
<ol><li>Seminare 2 × 107 cellule di midollo osseo per pallone T75 in 10 mL di DMEM completo che contiene il 10% di surnatante di cellule L929 (2,5 mL) come fonte di M-CSF. Incubare le piastre di coltura a 37 °C con CO2 al 5% per 5 giorni. Aggiungere 2 mL di terreno condizionato con L929 il giorno 3 di differenziazione.</li>
	<li>Osserva le cellule al microscopio ogni giorno utilizzando un microscopio invertito e un sistema di imaging con ingrandimento 20x. Dopo la differenziazione, i macrofagi dovrebbero apparire aderenti, allungati ed eterogenei (Figura 2).</li>
	<li>Per raccogliere i macrofagi per i saggi a valle, aspirare i mezzi di differenziazione.</li>
	<li>Lavare le cellule con 5 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti e le proteine sieriche che interferiscono con il distacco. Aspirare il PBS.</li>
	<li>Raccogliere le cellule aggiungendo 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% al pallone. Posizionare il pallone di coltura a 37 °C con l'incubatore al 5% di CO2 per 5 minuti e aggiungere 5 mL di DMEM.</li>
	<li>Pipettare le cellule da staccare e centrifugare a 350 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dissociare il pellet cellulare in 1 mL di DMEM completo, contare e controllare la vitalità cellulare utilizzando il blu di tripano. I BMDM isolati con questo metodo sono 7,05 (± 2,52) ×105 cellule/cucciolo (Figura 1E). NOTA: Osservare la presenza di cellule a forma di fuso che iniziano a comparire il secondo giorno di differenziazione (Figura 1B, frecce rosse). Se il colore del terreno diventa giallo, indicando che è esaurito, aggiungere altro terreno condizionato con L929 il giorno 4 di differenziazione; Si sconsiglia la sostituzione completa dei supporti.</li>
</ol>6. Immunomarcatura e citofluorimetria
<ol><li>Bloccare la marcatura degli anticorpi non specifici dei BMDM (2x105/marca) trattando con 10 μL/107 cellule di reagente bloccante FcR secondo le raccomandazioni del produttore in un volume di 100 μL/tampone per citometria a flusso (PBS integrato con 2 mM di EDTA e 0,5% di albumina sierica bovina). Conservare in ghiaccio per 10 min. NOTA: Le cellule possono essere bloccate in blocco o in singoli pozzetti o provette. Tutte le fasi successive indicano le quantità e i volumi per singola etichetta di marcatore cellulare a un volume finale di 100 μl.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 200 μL di tampone per citometria a flusso e centrifugare a 525 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e seminare le cellule in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U a una densità di 5 × 105 cellule per pozzetto. Colorare le cellule aggiungendo il colorante per la conta delle cellule vive/morte FVS780 diluito a 3.000 volte e 0,625 μL di BV786-CD11b, PE-F4/80 e AlexaFluor488-CD206 in 100 μL di tampone per citometria a flusso singolarmente o in combinazione 12,13,14,15. Incubare le celle per 45 minuti su ghiaccio coperto con un foglio.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di tampone per citometria a flusso e lavare le cellule centrifugando a 525 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aspirare il surnatante e agitare delicatamente il pellet cellulare. Aggiungere 100 μl di paraformaldeide allo 0,4% in ciascun pozzetto e incubare per una notte a 4 °C.</li>
	<li>Lavare le cellule aggiungendo 100 μL di tampone per citometria a flusso e pellet mediante centrifugazione a 525 x g per 7 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 400 μL di tampone per citometria a flusso e analizzarle utilizzando un citometro a flusso.</li>
</ol>7. Saggio in vitro per valutare l'efficacia fagocitaria di macrofagi neonatali derivati dal midollo osseo
<ol><li>Risospendere i BMDM in DMEM completo senza rosso fenolo o antibiotici e seminarli a una densità di 2 × 105/ quadrante in un piatto quadruplo da 35 mm a un volume di 500 μL.</li>
	<li>Per preparare l'inoculo batterico con una molteplicità di infezione (MOI) di 25 o di un altro MOI desiderato, rimuovere una scorta precalcolata di Escherichia coli O1:K1:H7 conservata a -80 °C.</li>
	<li>Aliquotare il volume desiderato di batteri in una provetta da microcentrifuga da 1,7 mL. Lavare i batteri aggiungendo PBS a un volume totale di 1 ml. Pellettare i batteri mediante centrifugazione a 2.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Ripetere la fase di lavaggio.</li>
	<li>Risospendere il pellet batterico in 50 μL di PBS e aggiungere un colorante fluorescente verde sensibile al pH a una concentrazione finale di 500 μM. Si tratta di un colorante sensibile al pH senza segnale fluorescente a pH neutro e fluorescente in ambienti acidi, come i fagosomi acidificati, durante il processo di fagocitosi.</li>
	<li>Incubare le cellule batteriche per 20 minuti al buio per la coniugazione del colorante.</li>
	<li>Lavare i batteri quattro volte con 1 mL di PBS mediante centrifugazione a 1000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Risospendere i batteri in 500 μL di DMEM completo senza rosso fenolo e aggiungerli alle colture BMDM.</li>
	<li>Incubare i BMDM a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 4 ore e quindi aggiungere 200 ng di un colorante fluorescente rosso permeabile alle cellule che colora i lisosomi. NOTA: I batteri fagocitici possono essere visualizzati mediante microscopia a fluorescenza.</li>
</ol>

Valutazione del test fagocitario dei macrofagi derivati dal midollo osseo neonatale 

<ol>
	<li>Lucas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+the+bone+marrow+and+its+role+in+hematopoiesis.">Structural organization of the bone marrow and its role in hematopoiesis.</a> Curr Opin Hematol. 28 (1), 36-42 (2021).</li><li>Deb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+stem+cells+turn+into+bone+and+fat.">How stem cells turn into bone and fat.</a> N Engl J Med. 380 (23), 2268-2270 (2019).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. 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K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+newborn+and+young+infant+from+infectious+diseases:+Lessons+from+immune+ontogeny.">Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: Lessons from immune ontogeny.</a> Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).</li><li>Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+characterization+of+murine+young-adult+long+bone+skeletal+progenitors.">Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 13, 930358 (2022).</li><li>Winterberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+phenotypic+features+of+neonatal+murine+macrophages).">Distinct phenotypic features of neonatal murine macrophages).</a> Eur J Immunol. 45 (1), 214-224 (2015).</li><li>de Brito Monteiro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M-CSF-+and+L929-derived+macrophages+present+distinct+metabolic+profiles+with+similar+inflammatory+outcomes.">M-CSF- and L929-derived macrophages present distinct metabolic profiles with similar inflammatory outcomes.</a> Immunobiology. 225 (3), 151935 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti per questo articolo.

La ricerca che coinvolge modelli murini neonatali può presentare una serie di sfide. I neonati hanno un sistema immunitario in via di sviluppo unico rispetto agli adulti8. Pertanto, i dati generati da modelli animali adulti non dovrebbero essere considerati applicabili ai neonati, e diversi lavori pubblicati hanno articolato bene questa idea 18,19. Pertanto, sono necessari modelli e fonti di cellule neonatali specifici per studiare le com...

Il midollo osseo racchiude popolazioni di cellule staminali ematopoietiche e mesenchimali che sono auto-rinnovabili e possono essere differenziate in varie linee cellulari. Le cellule staminali ematopoietiche nel midollo osseo danno origine a linee mieloidi e linfoidi1. Le cellule staminali mesenchimali producono osteoblasti (ossa), adipociti (grasso) o condrociti (cartilagine)2. Queste cellule hanno molteplici applicazioni nel campo della biologia cellulare e dell'ingegneria tissutale, compresa la terapia genica 3,4. Le cellule progenitrici presenti nel midollo osseo si differenziano in tipi cellulari specifici in presenza di fattori di crescita specifici del lignaggio. L'eritropoietina promuove la proliferazione delle cellule progenitrici eritroidi, il fattore stimolante le colonie di granulociti (G-CSF) stimola la crescita delle colonie di neutrofili e la trombopoietina regola la produzione di piastrine come alcuni esempi di fattori di crescita specifici del lignaggio5. Il FACS marcato con antigene di superficie cellulare e il sorting cellulare attivato magneticamente (MACS) sono metodi consolidati per l'isolamento e la purificazione di specifici tipi di cellule derivate dal midollo osseo6.
Sebbene gli studi neonatali stiano avanzando verso la ricerca delle cause delle morti neonatali e l'affrontare le complicanze durante le nascite premature, lo sviluppo terapeutico diretto rimane un'esigenza medica insoddisfatta. Smith e Davis affermarono: "I pazienti pediatrici rimangono orfani terapeutici"7. Ci sono diverse sfide, come piccoli campioni, effetti permanenti del risultato e questioni etiche nell'ottenere il consenso negli studi clinici sui neonati8. Pertanto, c'è una forte domanda di modelli di studio in vivo e in vitro specifici per i neonati per ottenere rilevanza traslazionale. A causa delle somiglianze tra i livelli anatomici e tissutali, i brevi periodi gestazionali e le dimensioni della cucciolata, i roditori sono il sistema modello di mammifero più studiato.
Qui, descriviamo una procedura dettagliata, altamente fattibile e riproducibile per isolare il midollo osseo da cuccioli di topo di 7-9 giorni e la loro capacità di differenziarsi in macrofagi. Tuttavia, una varietà di linee cellulari potrebbe essere ottenuta con l'uso di segnali di differenziazione distinti. Dimostriamo anche la presenza di marcatori di superficie cellulare e la presenza di attività fagocitaria in vitro attesa per i macrofagi derivati dal midollo osseo (BMDM).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>40 &#181;m strainer</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>542040</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well round (U) bottom plate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>12-565-65</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b-BV786</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>740861</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>141709</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80-PE</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>565410</td>
			<td>FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess3</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>TSI-C3ACC</td>
			<td>Automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>VWR</td>
			<td>WN182</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli O1:K1:H7</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>11775</td>
			<td>Infection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12-563-649</td>
			<td>Cell Imaging System&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Avantor&#160;</td>
			<td>76419-584</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBright BMDM</td>
			<td>Thermo fisher Scientific</td>
			<td>A1896701</td>
			<td>Dye free culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30034.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30237.01</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-929</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>Differentiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSRFortessa</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Flowcytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysotracker red DND 99</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L7528</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>15-010-CV</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin /streptomycin&#160;</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pHrodo green STP ester&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P35369</td>
			<td>Fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flask</td>
			<td>Cell star</td>
			<td>658170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300120</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 710&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>P20GM103434</td>
			<td>Confocal</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

neonatal mouse bone marrow isolation and preparation of bone marrow-derived macrophages

Varie tecniche per isolare il midollo osseo da topi adulti sono state ben consolidate. Tuttavia, isolare il midollo osseo da topi neonati è impegnativo e richiede tempo, ma per alcuni modelli è rilevante e necessario dal punto di vista traslazionale. Questo protocollo descrive un metodo efficiente e semplice per preparare le cellule del midollo osseo da cuccioli di 7-9 giorni. Queste cellule possono quindi essere ulteriormente isolate o differenziate in specifici tipi di cellule di interesse. I macrofagi sono cellule immunitarie cruciali che svolgono un ruolo importante nell'infiammazione e nell'infezione. Durante lo sviluppo, i macrofagi neonatali contribuiscono in modo significativo al rimodellamento dei tessuti. Inoltre, il fenotipo e le funzioni dei macrofagi neonatali differiscono da quelli delle loro controparti adulte. Questo protocollo delinea anche la differenziazione dei macrofagi neonatali dalle cellule isolate del midollo osseo in presenza di terreno condizionato con L929. I marcatori di superficie per macrofagi neonatali differenziati sono stati valutati utilizzando l'analisi citofluorimetrica. Per dimostrare la funzionalità, l'efficienza fagocitaria è stata testata anche utilizzando Escherichia coli coniugato con colorante sensibile al pH.

Bone marrow encloses both hematopoietic and mesenchymal stem cell populations that are self-renewable and can be differentiated into various cell lineages.&#160;Hematopoietic stem cells in the bone marrow give rise to myeloid and lymphoid lineages1. Mesenchymal stem cells produce osteoblasts (bone), adipocytes (fat), or chondrocytes (cartilage)2. These cells have multiple applications in the field of cell biology and tissue engineering, including gene therapy3,4. Progenitor cells present in the bone marrow differentiate into specific cell types in the presence of lineage-specific growth factors. Erythropoietin promotes the proliferation of erythroid progenitor cells, granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) stimulates the growth of neutrophil colonies, and thrombopoietin regulates the production of platelets as a few examples of lineage-specific growth factors5. Cell surface antigen labeled FACS and magnetic-activated cell sorting (MACS) are well-established methods for isolation and purification of the specific bone marrow-derived cell types6.
Though neonatal studies are advancing toward finding the causes of neonatal deaths and addressing the complications during premature births, direct therapeutic development remains an unmet medical need. Smith and Davis stated, &#34;Pediatric patients remain therapeutic orphans&#34;7. There are several challenges, such as small samples, lifelong effects of the outcome, and ethical issues in obtaining consent in clinical studies of neonates8. Hence, there is a high demand for in vivo and in vitro study models specific to neonates to achieve translational relevance. Because of the similarities between anatomical and tissue levels, short gestational periods, and litter sizes, rodents are the most studied mammalian model system.
Here, we describe a detailed, highly feasible, and reproducible procedure for isolating bone marrow from 7-9-day-old mouse pups and their ability to differentiate into macrophages. However, a variety of cell lineages could be achieved with the use of distinct differentiation signals. We also demonstrate the presence of cell surface markers and the presence of in vitro phagocytic activity expected for bone marrow-derived macrophages (BMDMs).

Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo riproducibile per isolare i macrofagi derivati dal midollo osseo da topi neonatali per far avanzare le risposte immunitarie precoci

Isolamento del midollo osseo di topo neonatale e preparazione di macrofagi derivati dal midollo osseo

The scope of this study is to understand some of the limitations in the early life immune response to bacterial infection. In order to accomplish this, we need to develop and use research models that are specific to neonates. Isolation of bone marrow from a day-seven-old-pup is challenging and not well established.Neonatal bone marrow derived macrophages are sensitive and prone to stress when compared to other BMDM. The technique used in this protocol is simple and reproducible. This method guides the users in isolating bone marrow from seven to nine-day-old neonatal mice without the use of any enzymes.This study provides a standardized strategy to generate bone marrow-derived macrophages from neonatal mice that can be used to address questions about neonatal immunology. This reproducible method provides an age-specific model for progressing neonatal immune research across many areas of expertise.

Utilizzando il metodo descritto in questo studio, da 25 a 37 milioni di cellule del midollo osseo possono essere isolate con successo da una cucciolata di cinque cuccioli di topo C57BL/6. Questo metodo è stato convalidato con cucciolate di dimensioni comprese tra 5 e 7 cuccioli. L'età minima per l'isolamento nei nostri esperimenti è stata di 7 giorni. A seconda delle dimensioni della cucciolata e del numero di cellule necessarie per l'esperimento inferiore a un milione, i ricercatori hanno potuto tentare questo protoc...

Questo protocollo descrive un metodo semplice e non enzimatico per isolare cellule di midollo osseo neonatale di topo di 7-9 giorni e generare macrofagi differenziati utilizzando un surnatante di cellule L929 come fonte di fattore stimolante le colonie di granulociti (M-CSF). I macrofagi derivati dal midollo osseo sono stati ulteriormente analizzati per gli antigeni di superficie F4/80, CD206, CD11b e la competenza funzionale.

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging ...

Lo scopo di questo studio è comprendere alcune delle limitazioni nella risposta immunitaria precoce all'infezione batterica. Per raggiungere questo obiettivo, dobbiamo sviluppare e utilizzare modelli di ricerca specifici per i neonati. L'isolamento del midollo osseo da un cucciolo di sette giorni è impegnativo e non ben consolidato.I macrofagi derivati dal midollo osseo neonatale sono sensibili e inclini allo stress rispetto ad altri BMDM. La tecnica utilizzata in questo protocollo è semplice e riproducibile. Questo metodo guida gli utenti nell'isolamento del midollo osseo da topi neonatali di sette o nove giorni senza l'uso di alcun enzima.Questo studio fornisce una strategia standardizzata per generare macrofagi derivati dal midollo osseo da topi neonatali che possono essere utilizzati per affrontare domande sull'immunologia neonatale. Questo metodo riproducibile fornisce un modello specifico per l'età per far progredire la ricerca immunitaria neonatale in molte aree di competenza.

neonatal-mouse-bone-marrow-isolation-preparation-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Neonatal Mouse Bone Marrow Isolation and Preparation of Bone Marrow-Derived Macrophages

995 Views.  West Virginia University School of Medicine. Lo scopo di questo studio è comprendere alcune delle limitazioni nella risposta immunitaria precoce all'infezione batterica. Per raggiungere questo obiettivo, dobbiamo sviluppare e utilizzare modelli di ricerca specifici per i neonati. L'isolamento del midollo osseo da un cucciolo di sette giorni è impegnativo e non ben consolidato.I macrofagi derivati dal midollo osseo neonatale sono sensibili e inclini allo stress rispetto ad altri BMDM. La tecnica utilizzata in questo protocollo ?...

Video: Autore in primo piano: Sviluppo di un metodo riproducibile per isolare i macrofagi derivati dal midollo osseo da topi neonatali per far avanzare le risposte immunitarie precoci

Various techniques for isolating bone marrow from adult mice have been well established. However, isolating bone marrow from neonatal mice is challenging and time-consuming, yet for some models, it is translationally relevant and necessary. This protocol describes an efficient and straightforward method for preparing bone marrow cells from 7-9-day-old pups. These cells can then be further isolated or differentiated into specific cell types of interest. Macrophages are crucial immune cells that play a major role in inflammation and infection. During development, neonatal macrophages contribute significantly to tissue remodeling. Moreover, the phenotype and functions of neonatal macrophages differ from those of their adult counterparts. This protocol also outlines the differentiation of neonatal macrophages from the isolated bone marrow cells in the presence of L929-conditioned medium. Surface markers for differentiated neonatal macrophages were assessed using flow cytometric analysis. To demonstrate functionality, the phagocytic efficiency was also tested using pH-sensitive dye-conjugated Escherichia coli.

This protocol describes a non-enzymatic and straightforward method for isolating 7-9-day-old neonatal mouse bone marrow cells and generating differentiated macrophages using a supernatant of L929 cells as a source of granulocyte colony-stimulating factor (M-CSF). The bone marrow-derived macrophages were further analyzed for surface antigens F4/80, CD206, CD11b, and functional competency.

Ricerca

Immunologia e infezioni

Non-Enzymatic Method for Isolating Neonatal Mouse Bone Marrow Cells

After decapitation, sterilize the body of the anesthetized neonate mouse with 70%ethanol. Using forceps and fine tipped surgical scissors, make an incision between the abdomen and hind legs. Then remove the skin by pulling it toward the foot of the hind limbs.Scrape the connective tissue and muscle attached to the bones using sharp edged forceps. Cut the tibia and femur with scissors. Use forceps to place the tibia and femur in a MEM culture media tube on ice.Transfer the bones to a 40 micron strainer with a collection tube. Crush the bones with a three milliliter syringe plunger against the strainer to release the marrow. Centrifuge the cell suspension at 350 G for five minutes at four degrees Celsius.Aspirate the supernatant and gently re-suspend the cells in 0.2%sodium chloride to make a hypotonic solution for the lysis of erythrocytes. Immediately add an equal volume of 1.6%sodium chloride to make the solution isotonic. Centrifuge the supernatant and remove the lysis solution.Re-suspend the cells in complete DMEM and count the cells on an automated cell counter.

Metodo non enzimatico per l'isolamento di cellule di midollo osseo di topo neonatale

Differentiation of Neonatal Bone Marrow-Derived Macrophages Using a Supernatant of L929 Cells

To begin, seed 20 million neonate mouse bone marrow cells per T75 flask in 10 milliliters of complete DMEM containing 2.5 milliliters of 10%L929 cell supernatant. Incubate the culture flask at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide for five days. On day three of differentiation, add two milliliters of L929 conditioned media into the flask.Under an inverted microscope with 20x magnification, daily observe the cells. To harvest the macrophages on day five, aspirate the differentiation media from the flask. Wash the cells with five milliliters of PBS to remove non-adherent cells and serum proteins.Add five milliliters of 0.05%trypsin EDTA to the flask and incubate at 37 degrees Celsius incubator with 5%carbon dioxide. After five minutes, add five milliliters of DMEM and pipette to detach the cells. Centrifuge the cell suspension at 350 g for five minutes.Dissociate the cell palate in one milliliter of complete DMEM. Count the cells on an automated cell counter. In the presence of L929 cell supernatant, bone marrow cells were differentiated into macrophages within five days.Spindle-shaped cell formation was observed from the second day with nearly half displaying this morphology by day three and a majority by day five.

Differenziazione di macrofagi derivati dal midollo osseo neonatale utilizzando un surnatante di cellule L929

Assessing Phagocytic Function of Neonatal Bone Marrow-Derived Macrophages Using a Fluorescent Bacterial Uptake Assay

To begin resuspend the mouse neonatal bone marrow derived macrophages in complete DMEM without phenol red or antibiotics. Seed 500 microliters of cell suspension at a density of 200, 000 per quadrant in a 35 millimeter quad dish. Remove the precalculated stock of Escherichia coli from minus 80 degrees Celsius.Aliquot the desired volume of cell suspension into a 1.7 milliliter micro centrifuge tube to prepare bacterial inoculum at a multiplicity of infection of 25, then add PBS to a total volume of one milliliter. Centrifuge the bacterial suspension at 2000 G for five minutes and resuspend the pellet in 50 microliters of PBS. Add green fluorescent pH sensitive dye to a final concentration of 500 micro molars and incubate for 20 minutes in the dark for dye conjugation.Wash the bacteria four times with one milliliter of PBS by centrifugation at 1000 G for five minutes. Resuspend the pellet in 500 microliters of complete DMEM without phenol red and add the bone marrow derived macrophage cultures. Incubate the culture at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for four hours.Add 200 nanograms of cell permeable red fluorescent dye to stain the lysosomes, Upon bacterial infection, abundant green fluorescent bacteria phagocytosed inside bone marrow derived macrophages were detected. The green fluorescence further localizes with red fluorescence indicative of acidified lysosomes. The phagocytosis and appearance of green pH sensitive dipositive neonatal bone marrow derived macrophages were also observed throughout the four hour infection.