Questo protocollo mira ad ottenere elevate quantità di macrofagi non stimolati che sono stati derivati dal midollo osseo e non sono mai stati esposti a fattori tissutali o citochine. Il vantaggio principale di questa tecnica è il numero di cellule acquisite da un singolo animale. Con la giusta procedura, si possono ottenere circa 2 volte 10 alla potenza di 7 macrofagi.
Questo metodo potrebbe aiutare i ricercatori di diverse aree che studiano i macrofagi come la biologia cellulare, la patologia, l'immunologia e la parassitologia, poiché le cellule sono sempre suscettibili alla contaminazione, è necessario prestare attenzione a tutti i passaggi sterili e utilizzare una cabina di biosicurezza a flusso laminare per mantenere la vitalità cellulare. A dimostrare la procedura sarà Izabela Aparecida de Souza. Uno studente di Master del nostro laboratorio.
Per iniziare la procedura sul topo maschio selvatico C57BL/6 di otto settimane correttamente soppresso, immergere il topo con una soluzione di etanolo al 70%. Utilizzando le forbici sterili, praticare un'incisione di un centimetro lungo l'addome e rimuovere la pelle fino a quando il muscolo delle zampe posteriori non è completamente esposto. Quindi rimuovere con cura le zampe posteriori all'altezza dell'anca senza rompere il femore e la tibia.
Mettere le zampe posteriori intatte in una provetta da centrifuga conica contenente una soluzione di etanolo al 70%. All'interno di una cabina di biosicurezza a flusso laminare, trasferire le gambe isolate da etanolo al 70% a PBS sterile. Usando pinze e salviette disinfettanti, pulire le ossa rimuovendo tutti i muscoli e la fascia attaccati.
Quindi, utilizzare una lama di bisturi chirurgico sterile per tagliare l'epifisi ossea su entrambe le estremità, esponendo il midollo osseo. Riempi una siringa da 20 millilitri con 10 millilitri di PBS sterile integrato con una soluzione di penicillina streptomicina al 2% e collega un ago calibro 26 ad esso. Tenere l'osso usando una pinza anatomica per dissezione con una mano.
Usa l'altra mano per inserire l'ago nella cavità ossea con cautela senza schiacciare l'osso. Quindi, lavare l'interno dell'osso con PBS e raccogliere il midollo osseo in una provetta da centrifuga conica sterile. Una volta lavata, la cavità ossea dovrebbe apparire bianca.
Centrifugare le cellule raccolte a 300 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet di cella in un millilitro di terreno DMEM/F1210. Omogeneizzare la sospensione e aggiungere altri nove millilitri di fluido per portare il volume totale fino a 10 millilitri.
Aggiungere un millilitro della sospensione cellulare progenitrice in ciascuna delle 10 piastre di Petri di plastica rotonde, che misurano 100 millilitri per 20 millimetri. Distribuire le cellule sulle piastre con una pipetta per ottenere una distribuzione uniforme. Quindi, aggiungere nove millilitri di DMEM/F1210 integrati con il 20% di surnatante cellulare L929 a ciascun piatto.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il terzo giorno, aggiungere 10 millilitri di terreno DMEM/F1210 integrato con il 20% di surnatante cellulare L929 a ciascun piatto. I 20 millilitri di terreno di coltura risultanti in ogni piastra sono sufficienti per la crescita cellulare fino alla maturazione.
Scartare i surnatanti da tutti i piatti di fermentazione. Lavare ogni piatto di coltura con 10 millilitri di PBS sterile privo di magnesio e calcio, preriscaldato a 37 gradi Celsius, ed eliminare la soluzione dopo il lavaggio. Aggiungere tre millilitri di soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica, preriscaldata a 37 gradi Celsius in ogni piatto.
Incubare per 10 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi, utilizzare un microscopio invertito per visualizzare se i macrofagi si dissociano dai piatti di coltura cellulare. Utilizzando una pipetta sierologica, lavare le piastre con la soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica, eseguendo ripetutamente movimenti circolari per garantire la completa dissociazione dei macrofagi.
Raccogliere e combinare la soluzione di tutte le piastre di coltura in una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri. Ancora una volta, aggiungere 10 millilitri di PBS sterile e preriscaldato alle piastre di coltura vuote. Centrifugare la provetta conica contenente la soluzione combinata raccolta a 300 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Scartare il surnatante e risospendere il pellet con un millilitro di DMEM/F1210. Omogeneizzare la sospensione lentamente e con attenzione pipettandola su e giù senza danneggiare le cellule. Diluire un'aliquota di 10 microlitri della soluzione di macrofagi aggiungendo 10 microlitri di blu di tripano per contare le cellule utilizzando un emocitometro.
Al settimo giorno, ogni piatto produrrebbe circa 2 milioni di macrofagi. L'esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi dal surnatante L929 ha gradualmente trasformato i progenitori del midollo osseo in macrofagi maturi, mostrando una tipica morfologia diffusa dovuta alle estensioni citoplasmatiche. Il terzo giorno sono comparsi alcuni macrofagi immaturi, con una tipica morfologia di forma rotonda con poche proiezioni di membrana.
Sebbene si trasformassero lungo l'intero processo, erano necessari sette giorni per raggiungere un numero e una maturità adeguati. I macrofagi ottenuti hanno mostrato una popolazione omogenea in termini di dimensioni e granularità nell'analisi di citometria a flusso. Inoltre, il 100% della popolazione ha espresso le caratteristiche molecole di superficie F480 e CD11B, formando un'unica popolazione ben definita di cellule.
La capacità di fagocitosi dei macrofagi maturi e ben differenziati è stata confermata da immagini al microscopio a fluorescenza che mostrano fagocitosio Leishmania principali parassiti all'interno dei macrofagi. Le zampe devono essere rimosse dall'animale con attenzione perché viene eseguita in un ambiente non sterile ed è la principale fonte di contaminazione. Le gambe non devono essere rotte al di fuori della cabina di biosicurezza a flusso laminare.
I macrofagi derivati dal midollo osseo ottenuti da questo protocollo possono essere utilizzati per eseguire successivamente la polarizzazione in vitro dei macrofagi per comprendere la fisiologia dei macrofagi.
