La creazione del video è stato sostenuto dalle concessioni dal National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) e l&#39;Istituto Nazionale di General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) dal National Institutes of Health. Questo lavoro è stato sostenuto anche da NSF concedere 1120425. MJD è Rita Allen Foundation Scholar. AWM è sostenuto in parte dal NIH T32 HG00035. Ringraziamo Sole Anna per l&#39;assistenza al miglioramento dei protocolli. Inoltre, riconosciamo Sara DiRienzi, Celia Payen, e Amy Sirr come primi utenti dei Ministat.

Usare le tecniche sterile per tutto il protocollo. 1. Assemblaggio dei pezzi e preparazione del Array Ministat <ol><li> Ordina tutte le parti. </li><li> Pulire tubi di vetro. Segna i tubi a 20 ml di volume. </li><li> Crea gruppi di sughero con l&#39;aria, i media, e le porte degli effluenti e metterli in cima dei tubi di vetro puliti cultura. </li><li> Preparare camere di umidificazione e organizzare tutti i non-autoclave parti. </li><li> Fai aria, scarichi, tubi e multimediale utilizzando la lunghezza dei tubi sufficienti e compatibili accoppiamenti. </li><li> Collegare ogni tipo di tubo (aria, i media, e degli effluenti), ai gruppi di sughero e filtri foglio e il supporto connettore rapido per prepararli per l&#39;autoclave. </li><li> Preparare una damigiana per la fabbricazione di mezzo sterile chemostato. </li><li> Preparare le bottiglie di campionamento la cultura con l&#39;inserimento di due fori tappo di gomma con raccordi appropriati. Lamina ogni filtro per prepararli per l&#39;autoclave. </li><li> Fit la matrice ben assemblato in uno o più vassoi autoclave e sterilizzare in autoclave tutte le parti. </li><li> Marca e filtrare i media chemostato in bottiglioni autoclave. </li></ol> 2. Configurazione di un esperimento <ol><li> Riempire ogni pallone idratazione con 700 ml DDH 2 O. </li><li> Posizionare i Ministat autoclavato nel set blocco riscaldante alla temperatura desiderata. </li><li> Posizionare le compagnie aeree nel collettore a 4 porte e accendere la pompa. </li><li> Collegare le linee di effluenti ai flaconi da 100 ml di raccolta. </li><li> Rimuovere la pellicola dalla fine del tubo media e damigiana media e collegare i due innesti rapidi. Infilare ogni lunghezza di tubo della pompa attraverso una cartuccia pompa peristaltica e fare clic su di loro in posizione. Accendere la pompa di supporto. </li><li> Lasciate che le camere di riempimento. Spegnere la pompa media. </li><li> Spruzzare i gruppi di sughero con il 70% di etanolo e inoculare le culture con una siringa. Salva un campione dell&#39;inoculo come uno stock di glicerolo congelatose desiderato. Lasciate culture crescere per 30 ore. </li><li> Regolare l&#39;altezza dell&#39;ago effluenti finché il volume cultura è impostato a 20 ml con il flusso d&#39;aria spenta. Questo può richiedere aggiustamenti diversi nel corso di un&#39;ora. Al termine girare il flusso d&#39;aria di nuovo. </li><li> Accendere la pompa multimediale su. </li><li> Svuotare le bottiglie di campionamento degli effluenti, che contengono dei media raccolti durante l&#39;impostazione del volume di cultura del lavoro, e registrare il tempo. </li><li> Per fare un tempo zero luogo di misura le linee degli effluenti in provette sterili per la raccolta di 15 minuti-2 ore (a seconda del volume che si desidera campione per l&#39;analisi del DNA). Anche fare una scorta congelata glicerolo per ogni coltura in questo momento se lo si desidera. </li></ol> 3. Misurazioni giornaliere <ol><li> Come con il tempo zero di misura, campione in ghiaccio per 15 minuti-2 ore (come richiesto per l&#39;esperimento) su ghiaccio e registrare il tempo di campionamento per campioni di DNA e di archivi congelati. </li><li> Per i campioni di RNA o raccogliere un piccolo volal volume, utilizzando una siringa e 22G 5 &quot;ago dalla cultura o stappare ogni Ministat per raccogliere tutta la cultura. campioni deve essere presa rapidamente, raccolto mediante filtrazione, ed immediatamente congelati in azoto liquido. </li><li> Misurare la residua raccolta dopo l&#39;ultimo prelievo per ogni Ministat quantificare di diluizione. Regolare tassi di diluizione, se necessario, regolando l&#39;impostazione di messa a punto della pompa o l&#39;ammenda regolare sulle linee pompe singole. </li><li> Sostituire i tubi di raccolta degli effluenti in bottiglia vuote. </li><li> Quantificare cellule / ml così come altri endpoint di interesse e fare una scorta congelata glicerolo. </li></ol> 4. Post-esperimento Cleanup <ol><li> Mettere tutti i tubi in vassoi separati e risciacquare con abbondante DDH 2 O. Tubi a secco utilizzando una pompa acquario. </li><li> Pulire le assemblee di sughero con DDH 2 O e usare l&#39;inserto ago per pulire gli aghi, aspirare e dispensare acqua a sua volta. Pulire la parte esterna degli aghi e sughero per rimuovere qualsiasisupporti residui. </li><li> Pulire il tubo di vetro con acqua ed etanolo, e rimuovere i contaminanti fisici con 3 appallottolato Kimwipes e pinze. </li><li> Sciacquare e asciugare tutti i componenti prima dell&#39;uso. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Coltivazione chemostato nelle Ministat, come con qualsiasi chemostato, richiede attenzione per i dettagli e la risoluzione dei problemi. Dal momento che la contaminazione è di grande preoccupazione in esperimenti di coltura continua, di solito cercare tramite microscopio per la contaminazione batterica e fungina su inoculazione e ogni 50 generazioni durante esperimenti a lungo termine evoluzione. Ad oggi non abbiamo osservato contaminazione tra 96 ​​esperimenti evoluzione maggiore di 300 generazioni (dati non mostrati). Per verificare la contaminazione incrociata tra Ministat e il potenziale di microbi di colonizzare la camera di coltura tramite la linea effluente correvamo 16 Ministat tali che ogni altra Ministat stato inoculato con lievito come sopra e il resto non sono stati inoculati con qualsiasi cultura. Le colture sono state campionate in un contenitore di rifiuti urbani, che è stato svuotato ogni altro giorno. Quindi, se fosse possibile per i contaminanti di entrare attraverso la linea di scarichi che probabilmente avrebbe osservato che in questo experiment. Nel corso di tre settimane e più di 100 generazioni di crescita in questo schema a scacchiera di colture inoculate e non inoculate non abbiamo osservato la crescita non inoculate provette di coltura Ministat, suggerendo che la contaminazione da lieviti dall&#39;esterno o altri microbi è improbabile che si verifichi in esperimenti di tempi simili. Anche se le Ministat sono stati progettati per operare in modo analogo a chemostati commerciali, la natura modulare di questa disposizione permette di ottimizzare per soddisfare le esigenze degli utenti e di bilancio. La pompa peristaltica utilizzata in questo protocollo può ottenere portate tra 0,0186 vol / hr a 3,6 vol / hr (dati non mostrati). Un maggiore controllo dei tassi di diluizione potrebbe essere realizzato con modelli di pompe alternative. Si noti che il funzionamento a bassi tassi di diluizione può richiedere la sostituzione di un ago calibro maggiore per ottenere la stessa frequenza di consegna goccia. Dimensione della popolazione è un fattore importante per la corretta progettazione di esperimenti di evoluzione.Il tasso di diluizione standard e la concentrazione dei nutrienti qui utilizzato fornisce una taglia popolazione relativamente grande (~ 10 9 cellule) dello stesso ordine di grandezza di studi pubblicati evoluzione. 11 popolazioni più grande o più piccolo potrebbe essere mantenuta modificando il volume di lavoro o limitando la concentrazione dei nutrienti. Fornitura mutazione aumentato potrebbe anche essere ottenuto lavorando con ceppi con elevati tassi di mutazione. Le Ministat potrebbe anche essere migliorata nel corso nostro sistema attuale. Ad esempio, in grado di raccogliere condensa sulle pareti del tubo di coltura e può essere notevolmente ridotto utilizzando un bagno d&#39;acqua profonda, incubatore, o ambiente a temperatura costante. Sebbene aggregazione e la crescita parete in solfato culture limitate sembra essere relativamente rare, appare in 5/48 esperimenti di evoluzione da 300 generazioni (dati non mostrati), una varietà di tensioattivi sono disponibili che può essere di aiuto nel ridurre o ritardare questo tratto. Nel caso in cui interferisce con agglomerante cultura adeguatamiscelazione, agitazione maggiore può essere ottenuto riducendo il numero di modi viene diviso ogni pompa di aria, o aggiungendo un apparato agitazione. Sonde aggiuntive per la concentrazione di gas disciolto, pH o altri parametri possono anche essere inclusi, come in alcuni altri disegni 17. Nonostante le modifiche possibili, in base alle Ministat come descritto in questo protocollo, abbiamo osservato parametri sperimentali altamente coerenti e risultati riproducibili quando si confrontano il nostro dispositivo con i dati riportati per chemostati volume maggiore commerciali. Questo incluso riproducibilità di fisiologia cellulare come visto attraverso il raggiungimento dello stato di equilibrio stazionario entro 10-15 generazioni (Figura 2A) e ottenendo densità cultura simile all&#39;equilibrio. Pattern di espressione genica erano coerenti tra biologico tre repliche in Ministat e tra Ministat e commerciali di grande volume piattaforme (Figura 2B), con l&#39;eccezione di geni metabolismo del ferro. Questi expression differenze sono probabilmente causati da cambiamenti nel contenuto di metallo tra i due dispositivi o miglioramento della qualità degli ingredienti media. I nostri dati suggeriscono che Ministat sarà utile per esperimenti di fisiologia o della concorrenza in cui è richiesto un ambiente coerente. Per verificare se il disegno Ministat è sufficiente per applicazioni sperimentali evoluzione ci siamo evoluti culture sotto limitazione solfato per 250 generazioni e utilizzato CGH per caratterizzare l&#39;amplificazione a livello del locus SUL1 -. Un segno distintivo di evoluzione a lungo termine in queste condizioni in chemostati di quantitativi maggiori 10 Abbiamo osservato amplificazione di SUL1 nei cloni da 4/4 esperimenti indipendenti in evoluzione solfato-limitati mezzi di comunicazione (Figura 2C). Nel suo insieme questi dati suggeriscono che Ministat sono una solida piattaforma che può essere utile per una varietà di applicazioni chemostato tradizionali. Anche se abbiamo dimostrato il loro uso in coltura di lievito in erba, i Ministat dovrebberoanche compatibile con altri organismi e disegni simili sono stati effettivamente utilizzati per la coltura di batteri e le specie di lievito altri. 16,17,25 Inoltre il volume più piccolo e cultura correlata ridotto bisogno di mezzi di comunicazione possono Ministat un&#39;alternativa interessante per esperimenti che richiedono costosi o esotici reagenti come può essere il caso in chimica o schermi genetici.

La dinamica della crescita microbica e l&#39;evoluzione sono fondamentali per microbiologia, ecologia, genetica e biotecnologie. Il metodo più comune di microbi coltura è in batch, in cui vengono inoculate cellule a bassa densità in brodo ricco di sostanze nutritive e cresciuta a saturazione. Anche se semplice da effettuare con attrezzature standard di laboratorio, colture in lotti sperimentare un ambiente fluttuante chimica e di conseguenza cambiando fisiologia cellulare. Questo ambiente eterogeneo crescita può provocare effetti secondari di crescita e lo stress che possono mascherare sottili differenze fisiologiche. L&#39;evoluzione sperimentale di trasferimento lotto di serie è possibile selezionare per le miscele complesse di crescita in fase sottopopolazioni specifiche, complicando i tentativi di connessione adattamenti a specifiche condizioni selettive. Misurazione dei fenotipi quantitativi può essere difficile a causa del rumore da calendario di campionamento imprecisa e variazione di caratteristiche come tempo di ritardo. Culture continui fornire un&#39;alternativaregime di crescita in cui le cellule possono essere coltivate riproducibile in un ambiente chimicamente omogenea ad un tasso di crescita definito per raggiungere uno stato fisiologico stazionario. Grazie a questi vantaggi, studi di evoluzione sperimentale e caratterizzazione di stato cellulare utilizzano spesso l&#39;ambiente controllato di coltura continua come il chemostato 14. Punteggio di questi vantaggi ha portato ad un ritorno di interesse in culture chemostato. 15 Sin dalla loro introduzione nel 1950, 1,2 chemostato sistemi sono stati sviluppati per funzionare su una varietà di scale che vanno da litri al microlitri e per una varietà di applicazioni. 16 -19 Questi disegni diversi, che vanno dalla bioreattori prodotti commercialmente alle navi glassblown personalizzati per piattaforme microfluidica, la quota di principi generali di progettazione. Camera di coltura viene agitata e aerato (di solito facendo gorgogliare aria attraverso di esso) ed i microbi esso contenute siano mantenute omogenealy dispersa la camera di coltura in ogni momento. Mezzo fresco di composizione viene aggiunto continuamente e la velocità di aggiunta controlla il tasso di crescita e influenza l&#39;ambiente chimico sperimentato dalla cultura. Un overflow imposta il volume di coltura nel tubo di crescita, e attraverso questo overflow la cultura saranno campionati con la stessa velocità con cui entra in terreno fresco. In questo modo le culture raggiungere in breve tempo uno stato fisiologico stabile in cui molti parametri biologici restano costanti. Nonostante i vantaggi di chemostati e le relazioni di queste diverse piattaforme presenti in letteratura, l&#39;adozione diffusa è stata limitata dalla difficoltà di costruzione e gestione di questi sistemi, e gli elevati costi connessi con i commerciali. Inoltre, le descrizioni di come creare e utilizzare questi dispositivi possono essere opachi. Presentiamo i disegni e le istruzioni per l&#39;uso di un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da ricambi facilmente disponibili a basso costo. Abbiamo obsErve parametri sperimentali altamente coerenti e risultati riproducibili quando si confrontano il nostro dispositivo con i dati riportati per il lievito in coltura in bioreattori grandi volumi commerciali. Questo include riproducibilità di fisiologia cellulare come visto attraverso il raggiungimento dello stato di equilibrio stazionario entro 10-15 generazioni e ottenendo densità cultura simile all&#39;equilibrio. Inoltre, i modelli di espressione genica sono coerenti tra Ministat e uno spot per più ampi volumi di piattaforma. Stabilità del tasso di diluizione, la densità ottica e la riproducibilità di espressione genica tra le tre culture repliche dimostrare la robustezza della nostra piattaforma. Abbiamo anche dimostrato che le stesse mutazioni adattive insorgere simili tempi di evoluzione sperimentali con chemostati volumi più grandi.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> 3/32 &quot;x 7/32&quot; tubazioni in silicone </td><td> VWR </td><td> 63009-260 </td><td> Tubing: Ordine: (50 &#39;pacco batteria) </td></tr><tr><td> Mezzo di silicone &quot;x 5/8&quot; di tubo (extra large) </td><td> VWR </td><td> 63009-299 </td><td> Tubing: Ordine: (50 &#39;pacco batteria) </td></tr><tr><td> 1/4 &quot;x 3/8&quot; di tubo in silicone (media) </td><td> VWR </td><td> 63009-279 </td><td> Tubing: Ordine: (50 &#39;pacco batteria) </td></tr><tr><td> Arancione verde Marprene pompa tubi </td><td> Watson-Marlow </td><td> 978.0038.00 + </td><td> Tubi: Order: 6x (confezione da 6) </td></tr><tr><td> Femmina luer, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45500-04 </td><td> Connettori: Ordine: 4x (pacchetto di 25) </td></tr><tr><td> Maschio Luer Lock, 1/8 &quot;barb </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-45503-04 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (pacchetto di 25) </td></tr><tr><td> Ridurre connettore, PVDF, 1/4 &quot;a 1/8&quot; </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-30703-50 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (confezione da 10) </td></tr><tr><td> Spinato Connettore a Y, 1/8 &quot;ID </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-30703-92 </td><td> Connettori: Ordine: 3x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> I morsetti del tubo Medio </td><td> VWR </td><td> 63022-405 </td><td> Morsetti: Ordine: 1x (confezione da 12) </td></tr><tr><td> Giorno Pinchcock (fascetta metallica per tubi) </td><td> VWR </td><td> 21730-001 </td><td> Morsetti: Ordine: 1x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> In linea con valvola maschio attacco rapido, Adatto a tubo: 1/4 </td><td> Pescatore </td><td> 05-112-39 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (pacchetto di 25) </td></tr><tr><td> Donne in linea con valvola attacco rapido, Adatto a tubo: 1/4 ID, Polipropilene </td><td> Pescatore </td><td> 05-112-37 </td><td> Connettori: Ordine: 1x (pacco da 5) </td></tr><tr><td> Pompe aria silenziosa </td><td> <a href="http://www.aquariumguys.com/" target="_blank">Acquario Guys.com</a> </td><td> 212422 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 4 pompe </td></tr><tr><td> Filtri in PTFE, 0,45 micron, per la filtrazione dell&#39;aria </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-02915-22 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 1x (confezione da 100) </td></tr><tr><td> Borraccia 1L con braccio laterale </td><td> Pescatore </td><td> 10-181F </td><td> Air Supply: Ordina: 2x (confezione da 6) </td></tr><tr><td> # 8 tappo in silicone, 3/8 nel foro, per fiaschi sidearm </td><td> Pescatore </td><td> K953715-0801 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 8 tappi </td></tr><tr><td> 4 porte collettore </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06464-85 </td><td> Alimentazione aria: Ordina: 8 collettori </td></tr><tr><td> 55 ml Tappo a vite cultura tubi </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 9825-25 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 2x (pacchetto di 48) </td></tr><tr><td> Regular bianco ago ipodermico hub, 16G, 5 pollici di lunghezza per la linea degli effluenti </td&gt; <td> Pescatore </td><td> 14-817-105 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 1x (confezione da 100) </td></tr><tr><td> Rubinetto ago spinale </td><td> VWR </td><td> BD40836 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 4x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> Ago ipodermico Regular rosa </td><td> Pescatore </td><td> 14-817-104 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 1x (confezione da 100) </td></tr><tr><td> Schiuma in silicone tappo formato &quot;2&quot;, rosa </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-06 </td><td> Sezione Cultura: Ordina: 2x (pacchetto di 20) </td></tr><tr><td> 8-Well tubo Rack </td><td> VWR </td><td> 82024-452 </td><td> Cultura della Camera: Ordine: 4 rack </td></tr><tr><td> Reservoir bottiglia 10L con uscita tubo inferiore: sicuro vuoto </td><td> VWR </td><td> 89001-530 </td><td> Media: Ordine: 2 o più </td></tr><tr><td> Giallo silicone tappo di schiuma, non standard taglia 12 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-22 </td><td> Media: Ordine: 2 o più </td></tr><tr><td> Damigiana di sfiato filtro </td><td> Pescatore </td><td> SLFG 050 10 </td><td> Media: Ordine: 1x (pacchetto di 10) </td></tr><tr><td> Nastro elettrico, verde </td><td> <a href="http://Amazon.com" target="_blank">Amazon.com</a> </td><td> 10851-BA-10 </td><td> Media: Ordine 1 rotolo. </td></tr><tr><td> Bottiglia filtro superiore, 1L, 0,2 micron, 45 mm </td><td> VWR </td><td> 29442-978 </td><td> Media: Ordine: (1 caso su 12) </td></tr><tr><td> 5000 ml flacone con serbatoio scarico di fondo: vacuum sicuro </td><td> VWR </td><td> 89003-384 </td><td> Media: (Opzionale) </td></tr><tr><td> Blu Tappo in silicone Schiuma, nonstandardsize 10 1/2 </td><td> Cole Parmer </td><td> EW-06298-18 </td><td> Media: (Opzionale) </td></tr><tr><td> 205S/CA16, 16 Cartuccia pompa </td><td> Watson-Marlow </td><td> 020.3716.00A </td><td> Media Pompa: ordinabile: 1 </td></tr><tr><td> 16 canali 205CA Estensione testa della pompa </td><td> Watson-Marlow </td><td> 023.1401.000 </td><td> Media della pompa: Ordina: teste della pompa 2 Estensione </td></tr><tr><td> Silicone sigillante acquario </td><td> Pescatore </td><td> S18180B </td><td> Media Pompa: ordinabile: 1 </td></tr><tr><td> 6-blocco di bagno a secco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Ordina: 2 per 32 Ministat o 1 per 16. </td></tr><tr><td> Blocco per drybath, 6 x 25 mm provetta per blocco </td><td> VWR </td><td> 12621-120 </td><td> Heatblock: Ordina: 12 per 32 Ministat o 6 per 16. </td></tr><tr><td> Filtri a membrana in nylon, 0,45 micron Dimensione dei pori, Dia: 25 mm. </td><td> Pescatore </td><td> R04SP02500 </td><td> Raccolta: Ordina: 1x (confezione da 100) (facoltativo) </td></tr><tr><td> Filtri a membrana in nylon, 0,45 micron Dimensione dei pori; 45 millimetri </td><td> Pescatore </td><td> R04SP04700 </td><td> Raccolta: Ordina: 1x (confezione da 100) (facoltativo) </td></tr><tr><td> 47 mm, grande apparato filtro </td><td> Pescatore </td><td> XX10 047 30 </td><td> Raccolta: Ordine: 1 (opzionale) </td></tr><tr><td> Glass portafiltro, 25 mm, piccola apparecchiatura filtro </td><td> VWR </td><td> 26316-692 </td><td> Raccolta: Ordine: 1 (opzionale) </td></tr><tr><td> Dewar pallone, 1L per azoto liquido </td><td> VWR </td><td> 63380-052 </td><td> Raccolta: Ordine: 1 (opzionale) </td></tr></tbody></table>

design and use of multiplexed chemostat arrays

Chemostati sono sistemi di coltura continua in cui le cellule vengono coltivate in un ben ambiente controllato chimicamente costante dove è vincolato densità cultura limitando specifici nutrienti. 1,2 I dati chemostati sono altamente riproducibili per la misurazione dei fenotipi quantitative che forniscono un tasso di crescita e l&#39;ambiente allo stato stazionario. Per queste ragioni, chemostati sono diventati strumenti utili per la messa a livello della fisiologia caratterizzazione attraverso l&#39;analisi di espressione genica 3-6 e le altre caratteristiche di culture allo steady-state di equilibrio. 7 a lungo termine esperimenti chemostati può evidenziare traiettorie specifiche popolazioni microbiche adottano durante l&#39;evoluzione adattativa in un ambiente controllato. Infatti, chemostati sono stati utilizzati per evoluzione sperimentale dalla loro invenzione. 8 Un risultato comune in esperimenti evoluzione è per ciascun replicato biologica di acquisire un repertorio di mutazioni. 9-13 Questa diversità suggerisce che c&#39;è ancora molto da scoprire eseguendo esperimenti di evoluzione con velocità di gran lunga maggiore. Vi presentiamo qui la progettazione e gestione di una relativamente semplice, a basso costo di serie chemostati-o miniatura Ministat-e convalidare il loro uso nella determinazione della fisiologia e in esperimenti di evoluzione con lievito. Questo approccio comporta una crescita di decine di chemostati scappare un singolo multiplex pompa peristaltica. Le colture sono mantenuti ad un volume di 20 ml di lavoro, che è pratico per una varietà di applicazioni. La nostra speranza è che l&#39;aumento della produttività, riduzione costi, e fornendo costruzione dettagliate e istruzioni operative può anche motivare la ricerca e l&#39;applicazione industriale di questo progetto come una piattaforma generale per caratterizzare funzionalmente un gran numero di ceppi, specie, e parametri di crescita, oltre che genetica o farmaci biblioteche.

La matrice Ministat sopra descritta e nella (Figura 1A, B) è stato utilizzato per la cultura un aploide MATA ceppo di laboratorio di lievito in erba (S288c) in solfato di limitazione condizioni come descritto in precedenza 10. Abbiamo testato l&#39;efficacia per le applicazioni più comuni chemostato compresa la determinazione della fisiologia e evoluzione sperimentale. Per convalidare i Ministat, abbiamo ripetuto diversi esperimenti condotti in precedenza fermentatori industriali modificati per uso chemostato. 10,20,21 Sixfors ATR fermentatori sono state eseguite in un volume 300 ml di lavoro, oltre dieci volte il volume dei Ministat, e hanno modi molto diversi di aerazione cultura e di agitazione. Abbiamo tentato di replicare la stabilità attrezzature, fisiologia stato stazionario, i risultati sperimentali evoluzione, e modelli di espressione genica ottenuti con questi fermentatori. Dal momento che l&#39;uniformità del tasso di diluizione e di aerazione sono aspetti importanti del progetto chemostato, abbiamo measured il tasso effettivo di diluizione in 32 Ministat dopo 15 generazioni di crescita e ha scoperto che con un tasso di diluizione obiettivo di 0,17 vol / h (4-5 gocce / min) abbiamo raggiunto un tasso medio di 0,17208 diluizione con una deviazione standard di 0,0075 in 32 replica. Questa gamma era alla nostra tolleranza tipica di + / -0,01 vol / h differenza dalla definizione degli obiettivi, oltre il quale cambiamenti su larga scala dell&#39;espressione genica sono stati osservati. 22-23 su 4 Ministat la portata d&#39;aria è stato determinato in 307,5 ​​ml / min con una deviazione standard di 9,57 ml / min. Questo suggerisce che il flusso d&#39;aria nelle camere è robusto e divisi tra i quattro camere ed è un valore simile a quello descritto per l&#39;aerazione in fermentatori industriali. 20 Abbiamo già osservato l&#39;amplificazione del ricorrente ad alta affinità di zolfo agli ioni di SUL1 trasportatore in 8/8 solfato-limitati esperimenti di evoluzione nel lievito. 10 Data la coerenza dei risultati in thicondizione s abbiamo scelto solfato-limitazione per verificare la capacità del nostro sistema. Un elemento requisito della cultura chemostato è la necessità di mantenere un ambiente costante chimica. Fluttuazioni l&#39;abbondanza di un cambiamento di limitazione nutritiva o di altro ambiente tipicamente risultare in un cambiamento del numero di cellule in una data cultura. Abbiamo misurato la densità ottica come proxy per numero di cellule (Figura 2A) e riproducibilità misurato in 16 repliche culture, trovare un A600 media di 1.12 (~ 10 9 celle) dopo circa 15 generazioni di crescita con una deviazione standard di 0,057 unità, o 5.1 %. Per confronto, le misure prese da 4 colture replicate coltivate nei fermentatori industriali hanno mostrato una deviazione standard di 2,5%. Cellule erano ben miscelato nella camera di crescita: misurazioni di OD e di cellule sulla pista effluenti erano equivalenti ai campioni prelevati direttamente dal tubo cultura (dati non mostrati). Questi risultati dimostrano la robustezza della nostra piattaforma und capacità di mantenere un ambiente costante chimico entro una tolleranza simile come il fermentatore industriale. Come una lettura più sensibile della fisiologia, abbiamo confrontato il genoma stazionario espressione genica stato da colture cresciute sotto limitazione solfato nelle Ministat e nel fermentatore industriale. Espressione genica nelle Ministat mostrato un alto grado di somiglianza tra tre repliche biologica (Figura 2B). Abbiamo precedentemente notato che per RNA derivati ​​da due chemostati replicati Sixfors e co-ibridato ad un microarray, espressione del 99% dei geni rientra in un intervallo di 1,5 volte, permettendo l&#39;uso di 1,5 X come cutoff significato empirico. 21 espressione genica da Ministat tre repliche, rispetto a coppie, ha mostrato il 99% dei geni rientrava in un range 1,5-1,7 volte, paragonabile ai risultati dei fermentatori industriali. I tre campioni sono stati ibridati per singoli array ed i rapporti a coppie calcolate in seguito, per cui questi value includono inter-matrice rumore oltre al rumore biologico, potenzialmente sovrastimare la variazione tra replicati rispetto ai pubblicate, co-ibridizzati risultati. 138 geni sono differenzialmente espressi&gt; 1.5 volte in tutto Ministat tre repliche rispetto ad un campione prelevato da una coltura cresciuta abbinato nel fermentatore industriale. I geni sono diminuiti in espressione nei Ministat sono stati fortemente arricchito per il metabolismo del ferro. Questa firma può riflettere la diversa composizione metallica di ogni configurazione del dispositivo: l&#39;apparecchio Sixfors comprende una girante in metallo e montaggio aerazione immersi nella cultura, e la damigiane supporti precedentemente utilizzati anche richiesto hardware in metallo. Il Ministat utilizza aghi di acciaio inossidabile, ma non componenti metallici. I geni con aumentata espressione sono stati in gran parte associato con le membrane cellulari, anche se il significato biologico di questa associazione non è chiaro. Infine, abbiamo testato unde sperimentale evoluzioner queste condizioni. Dopo 250 generazioni di solfato-limitata crescita, 4/4 cloni testati da 4 popolazioni indipendenti evoluzione mostrato amplificazione SUL1 come rilevato da Genomic Hybridization matrice comparativa (CGH, Figura 2C). Questo risultato è coerente con quanto rilevato negli chemostati di quantitativi maggiori su intervalli di tempo simili 10. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig1highres.jpg"/> Figura Design 1. Design A. e disposizione della matrice Ministat. B. della camera di coltura. <img src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50262/50262fig2highres.jpg"/> Figura 2. A. Experimentale dati che dimostrano che le culture raggiungere l&#39;equilibrio nel raggio di dieci generazioni di crescita (n = 16). dati di espressione B. biologica tre repliche S1-3 campionati durante lo stato stazionario in solfato di limitazione rispetto ad un riferimento comune cresciuto in un corrispondente solfato-limitata chemostato Sixfors C.. amplificazioni SUL1 recuperato in Ministat dopo 250 generazioni di crescita in un solfato di un ambiente limitato. DNA genomico da ciascun clone è stato evoluto rispetto al DNA ancestrale da CGH come descritto. 21 Il numero medio di copia è stato calcolato per ogni regione amplificata ed è indicato accanto a ciascun amplicone. Tutti i dati di microarray sono depositati nella banca dati GEO in adesione GSE36691. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50262/50262fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura.</a>

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Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Abbiamo sviluppato e validato un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da prontamente parti disponibili per basso costo. Risultati evoluzione fisiologiche e sperimentali sono stati simili a chemostati volumi più grandi. La matrice Ministat fornisce una piattaforma compatta, poco costoso, e accessibile per gli esperimenti chemostato tradizionali, genomica funzionale, e le applicazioni di screening chimici.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

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Research

JoVE Journal

Biology

23.1K Views.  University of Washington. Abbiamo sviluppato e validato un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da prontamente parti disponibili per basso costo. Risultati evoluzione fisiologiche e sperimentali sono stati simili a chemostati volumi più grandi. La matrice Ministat fornisce una piattaforma compatta, poco costoso, e accessibile per gli esperimenti chemostato tradizionali, genomica funzionale, e le applicazioni di screening chimici.

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays. Robust flow control and precise fluidic volumes are two critical requirements for these applications. We have developed microfluidic chips featuring elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS) microvalve arrays that: 1) need no extra energy source to close the fluidic path, hence the loaded device is highly portable; and 2) allow for microfabricating deep (up to 1 mm) channels with vertical sidewalls and resulting in very precise features.

The PDMS microvalves-based devices consist of three layers: a fluidic layer containing fluidic paths and microchambers of various sizes, a control layer containing the microchannels necessary to actuate the fluidic path with microvalves, and a middle thin PDMS membrane that is bound to the control layer. Fluidic layer and control layers are made by replica molding of PDMS from SU-8 photoresist masters, and the thin PDMS membrane is made by spinning PDMS at specified heights. The control layer is bonded to the thin PDMS membrane after oxygen activation of both, and then assembled with the fluidic layer. The microvalves are closed at rest and can be opened by applying negative pressure (e.g., house vacuum). Microvalve closure and opening are automated via solenoid valves controlled by computer software.

Here, we demonstrate two microvalve-based microfluidic chips for two different applications. The first chip allows for storing and mixing precise sub-nanoliter volumes of aqueous solutions at various mixing ratios. The second chip allows for computer-controlled perfusion of microfluidic cell cultures.

The devices are easy to fabricate and simple to control. Due to the biocompatibility of PDMS, these microchips could have broad applications in miniaturized diagnostic assays as well as basic cell biology studies.

We demonstrate protocols for manufacturing and automating elastomeric polydimethylsiloxane (PDMS)-based microvalve arrays that need no extra energy to close and feature photolithographically defined precise volumes. A parallel subnanoliter-volume mixer and an integrated microfluidic perfusion system are presented.

Chips Microfluidic controllati con le matrici elastomeriche microvalvola

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

Ricerca

Biologia

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower detection limit compared to other methods of gene expression profiling while using smaller amounts of input for each assay.  Automated qPCR setup has improved this field by allowing for greater reproducibility.  Its convenient and rapid setup allows for high-throughput experiments, enabling the profiling of many different genes simultaneously in each experiment.  This method along with internal plate controls also reduces experimental variables common to other techniques.  
We recently developed a qPCR assay for profiling of pre-microRNAs  (pre-miRNAs) using a set of 186 primer pairs.  MicroRNAs have emerged as a novel class of small, non-coding RNAs with the ability to regulate many mRNA targets at the post-transcriptional level.  These small RNAs are first transcribed by RNA polymerase II as a primary miRNA (pri-miRNA) transcript, which is then cleaved into the precursor miRNA (pre-miRNA).  Pre-miRNAs are exported to the cytoplasm where Dicer cleaves the hairpin loop to yield mature miRNAs.  Increases in miRNA levels can be observed at both the precursor and mature miRNA levels and profiling of both of these forms can be useful.  There are several commercially available assays for mature miRNAs; however, their high cost may deter researchers from this profiling technique.  Here, we discuss a cost-effective, reliable, SYBR-based qPCR method of profiling pre-miRNAs.  Changes in pre-miRNA levels often reflect mature miRNA changes and can be a useful indicator of mature miRNA expression.  However, simultaneous profiling of both pre-miRNAs and mature miRNAs may be optimal as they can contribute nonredundant information and provide insight into microRNA processing.  Furthermore, the technique described here can be expanded to encompass the profiling of other library sets for specific pathways or pathogens.

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

We will demonstrate the setup and analysis of pre-microRNA 96-well arrays for QPCR using a robot as well as by hand with a Thermo Scientific Matrix multichannel pipette.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if animals have been exposed to adventitious infectious agents (viruses, mycoplasma, and other fastidious microorganisms). Infections of immunocompetent animals are generally transient, yet serum antibody responses to infection often can be detected within days to weeks and persist throughout the life of the host. Serology is the primary diagnostic methodology by which laboratory animals are monitored. Historically the indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has been the main screening method for serosurveillance. The ELISA is performed as a singleplex, in which one microbial antigen-antibody reaction is measured per well. In comparison the MFIA is performed as a multiplexed assay. Since the microspheres come in 100 distinct color sets, as many as 100 different assays can be performed simultaneously in a single microplate well. This innovation decreases the amount of serum, reagents and disposables required for routine testing while increasing the amount of information obtained from a single test well. In addition, we are able to incorporate multiple internal control beads to verify sample and system suitability and thereby assure the accuracy of results. These include tissue control and IgG anti-test serum species immunoglobulin (&alpha;Ig) coated bead sets to evaluate sample suitability. As in the ELISA and IFA, the tissue control detects non-specific binding of serum immunoglobulin. The &alpha;Ig control (Serum control) confirms that serum has been added and contains a sufficient immunoglobulin concentration while the IgG control bead (System Suitability control), coated with serum species immunoglobulin, demonstrates that the labeled reagents and Luminex reader are functioning properly.

Using Luminex Corporation&#x2019;s xMAP microsphere technology, we have developed the Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay (MFIA) for serosurveillance of various laboratory animal species. The MFIA is a suspension microarray where antigen, tissue control or immunoglobulins are covalently linked to color-coded polystyrene microspheres. The MFIA testing method as well as various troubleshooting topics is addressed.

Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

To ensure the quality of animal models used in biomedical research we have developed a number of diagnostic testing strategies and methods to determine if ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mappatura batteriche reti funzionali e sulle vie di<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizzando matrici sintetiche genetiche

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, distinct microenvironments can impose differentiation, migration, and proliferation phenotypes, and on the tissue level the microenvironment processes as complex as morphogenesis and tumorigenesis1. Not only do the cell and molecular contents of microenvironments impact the cells within, but so do the elasticity2 and geometry3 of the tissue. Defined as the sum total of cell-cell, -ECM, and -soluble factor interactions, in addition to physical characteristics, the microenvironment is complex. The phenotypes of cells within a tissue are partially due to their genomic content and partially due to the combinatorial interactions with the microenviroment. A major challenge is to link specific combinations of microenvironmental components with distinctive behaviours.
Here, we present the microenvironment microarray (MEArray) platform for cell-based functional screening of interactions with combinatorial microenvironments4. The method allows for simultaneous control of the molecular composition and the elastic modulus, and combines the use of widely available microarray and micropatterning technologies. MEArray screens require as few as 10,000 cells per array, which facilitates functional studies of rare cell types such as adult progenitor cells. A limitation of the technology is that entire tissue microenvironments cannot be completely recapitulated on MEArrays. However, comparison of responses in the same cell type to numerous related microenvironments, for instance pairwise combinations of ECM proteins that characterize a given tissue, will provide insights into how microenvironmental components elicit tissue-specific functional phenotypes.
MEArrays can be printed using a wide variety of recombinant growth factors, cytokines, and purified ECM proteins, and combinations thereof. The platform is limited only by the availability of specific reagents. MEArrays are amenable to time-lapsed analysis, but most often are used for end point analyses of cellular functions that are measureable with fluorescent probes. For instance, DNA synthesis, apoptosis, acquisition of differentiated states, or production of specific gene products are commonly measured. Briefly, the basic flow of an MEArray experiment is to prepare slides coated with printing substrata and to prepare the master plate of proteins that are to be printed. Then the arrays are printed with a microarray robot, cells are allowed to attach, grow in culture, and then are chemically fixed upon reaching the experimental endpoint. Fluorescent or colorimetric assays, imaged with traditional microscopes or microarray scanners, are used to reveal relevant molecular and cellular phenotypes (Figure 1).

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays MEArrays

A combinatorial functional screening method for gaining insights into the impacts of the molecular composition of microenvironments on cellular functions is described. The method takes advantage of existing microarray-based technologies to generate arrays of defined combinatorial microenvironments that support cell adhesion and functional analysis.

Realizzazione e utilizzo di microarrays microambiente (MEArrays)

The interactions between cells and their surrounding microenvironment have functional consequences for cellular behaviour. On the single cell level, ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

Assemblea dei nucleosomal matrici da ricombinanti core istoni e nucleosomi posizionamento DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

Progettazione e analisi del comportamento delle preferenze di temperatura e del suo ritmo circadiano in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

Identificare proteina-proteina siti di interazione Uso Peptide Array

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays crucial roles in cell development and many diseases. Approximately 5,000 lysine methylation sites were identified on different proteins, which are set by few dozens of protein lysine methyltransferases. This suggests that each PKMT methylates multiple proteins, however till now only one or two substrates have been identified for several of these enzymes. To approach this problem, we have introduced peptide array based substrate specificity analyses of PKMTs. Peptide arrays are powerful tools to characterize the specificity of PKMTs because methylation of several substrates with different sequences can be tested on one array. We synthesized peptide arrays on cellulose membrane using an Intavis SPOT synthesizer and analyzed the specificity of various PKMTs. Based on the results, for several of these enzymes, novel substrates could be identified. For example, for NSD1 by employing peptide arrays, we showed that it methylates K44 of H4 instead of the reported H4K20 and in addition H1.5K168 is the highly preferred substrate over the previously known H3K36. Hence, peptide arrays are powerful tools to biochemically characterize the PKMTs.

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Analisi Specificità di proteine ​​lisina metiltransferasi Utilizzando SPOT Peptide Array

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Barcoding genetica con proteine ​​fluorescenti per applicazioni multiplexati

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...