Il vantaggio principale di questo protocollo è che è meno laborioso e richiede tempo rispetto al metodo tradizionale di conteggio delle unità formanti colonie per stimare la crescita intracellulare di Mycobacterium tuberculosis. Questa tecnica rende più facile per i ricercatori esaminare rapidamente i farmaci approvati dalla FDA con l'obiettivo di riutilizzarli come terapie dirette dall'ospite per trattare la tubercolosi. Il metodo è molto semplice e diretto.
La conoscenza di base delle tecniche di coltura di cellule T di supporto micobatterico e EO sarebbe sufficiente per seguire il protocollo passo dopo passo. Per iniziare, trasferire da sei a otto millilitri di coltura micobatterica attenuata H37Ra dal pallone T25 in un tubo di polipropilene da 15 millilitri. Centrifugare il tubo in una centrifuga da banco.
Dopo aver rimosso accuratamente il tubo, trasferire il tubo nell'armadio di sicurezza biologica e attendere un minuto affinché i batteri si depositino. Versare il surnatante nel contenitore di scarto del disinfettante. Quindi, ricapitolare il tubo e sospendere i batteri nel mezzo rimanente toccando delicatamente il lato del tubo e lasciando che i batteri si depositino per un minuto.
Aggiungere e mescolare due millilitri di RPMI completo preriscaldato e trasferire in un tubo conico da 50 millilitri. Per risospendere i micobatteri, aspirare la sospensione in una siringa da cinque millilitri dotata di un ago da 25 gauge. Quindi, espellere molto delicatamente lungo la parete laterale del tubo per ridurre al minimo la produzione di aerosol e ripetere il processo da sei a otto volte.
Smaltire l'ago e la siringa in un contenitore per oggetti taglienti nell'armadietto di biosicurezza. Trasferire la sospensione in un tubo di microcentrifuga da due millilitri e centrifugare per pellettare eventuali grumi rimanenti. Riportare il tubo nell'armadio di sicurezza e lasciare che i batteri si depositino per un minuto.
Trasferire la parte superiore da 1 a 1,5 millilitri del surnatante in un nuovo tubo. Gettare il tubo originale nel cestino dei rifiuti contenente il disinfettante. Mescolare bene e aggiungere varie quantità di sospensione micobatterica ai due vetrini della camera di vetro del pozzetto e incubare i vetrini per tre ore a 37 gradi Celsius.
Dopo aver pipettato su e giù tre volte per rimuovere i batteri non fagocitati, rimuovere il mezzo dal vetrino della camera di vetro. Lavare una volta con due millilitri di PBS. Scongelare le aliquote del 4% di PFA nel PBS memorizzato a meno 20 gradi Celsius.
Diluire l'aliquota al 2% di PFA e aggiungere due millilitri a ciascun pozzetto. Dopo l'incubazione per 10 minuti a temperatura ambiente, rimuovere il vetrino dall'armadio di sicurezza per la colorazione. Gettare il PFA nel contenitore dei rifiuti chimici PFA e lavare il vetrino sotto un getto delicato di acqua di rubinetto.
Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, erogare abbastanza auramina per coprire le cellule sul vetrino e incubare il vetrino per un minuto a temperatura ambiente al buio. Lavare il colorante in eccesso dal vetrino con acqua di rubinetto e aggiungere il quencher per un minuto al buio. Dopo aver lavato via il quencher in eccesso, incubare per 15 minuti a temperatura ambiente con la macchia di Hoechst al buio.
Quindi lavare via la macchia di Hoechst. E dopo aver drenato l'acqua in eccesso, aggiungere una goccia di antisbiadimento e un foglietto di copertura. Esaminare il vetrino essiccato all'aria sotto il microscopio fluorescente utilizzando l'obiettivo olio 100x.
I micobatteri saranno fluorescenti verdi sotto il filtro Fitz e i nuclei saranno fluorescenti blu sotto il filtro DAPI. Contare il numero di micobatteri fagocitati per cellula e la percentuale di cellule infette per determinare il MOI. Calcolare il volume di sospensione micobatterica necessaria per ottenere il MOI richiesto in base alla superficie di un pozzetto nella piastra.
Dopo aver miscelato la sospensione di micobatteri, aggiungere il volume calcolato alle celle su 12 piastre di pozzetto per ottenere il MOI desiderato. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per tre ore per consentire ai micobatteri di essere fagocitati. Quindi rimuovere i batteri extracellulari lavando più volte i pozzetti con RPMI caldo.
Aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi per 10 minuti per lisare i macrofagi in un pozzetto del campione di tre ore e raccogliere il lisato per determinare il tasso di infezione basale. Quindi aggiungere un nuovo RPMI completo e le dosi di farmaco richieste, o il controllo del veicolo, ai pozzetti rimanenti. Incubare le piastre nell'incubatore ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius per uno a otto giorni, a seconda del progetto dell'esperimento.
Per determinare il tempo percentuale di positività, o TTP, dell'inoculo iniziale del campione di tre ore, brodo caldo di Middlebrook e bottiglie di coltura dello strumento a temperatura ambiente. Trasferire il mezzo dalla piastra a 12 pozzetti ai corrispondenti tubi conici etichettati e aggiungere 500 microlitri di tampone di lisi sterile a ciascun pozzetto. Dopo 10 minuti, raschiare delicatamente le cellule dal pozzetto con un raschietto sterile e combinarle con il mezzo nell'apposito tubo conico.
Una volta che il pozzetto viene lavato con 0,5 millilitri di PBS sterile e combinato con il terreno e il lisato, rompere i grumi passando delicatamente ogni campione attraverso una siringa ad ago da 25 gauge da sei a otto volte. Diluire il campione in brodo MB aggiungendo 900 microlitri di brodo MB a 100 microlitri di campione e ripetere il processo di raccolta nei punti temporali richiesti durante l'incubazione. Preparare i flaconi del quadro strumenti sterilizzando il tappo di gomma con alcool al 70%.
Trasferire abbastanza integratori nutrizionali per tutti i campioni in un tubo conico e utilizzare un ago e una siringa per iniettare 0,5 millilitri di integratore alimentare nel flacone di coltura dello strumento. Quindi, pipettare 500 microlitri del campione diluito uno su 10 in un tubo inferiore a V da un millilitro. Utilizzare un ago e una siringa per iniettare i 500 microlitri di campione nei flaconi di coltura dello strumento assegnati.
Dopo aver trasportato con cura le bottiglie dall'armadio di biosicurezza allo strumento per il caricamento, premere il pulsante di caricamento sul sistema di rilevamento microbico automatizzato. Scansiona i codici a barre sui flaconi per la coltura degli strumenti e posizionali nell'incubatore del sistema di rilevamento a 37 gradi Celsius per un massimo di 42 giorni. Leggi e registra il tempo impiegato per raggiungere la positività dallo schermo dello strumento e calcola la percentuale TTP.
Un TTP positivo indica una crescita micobatterica. Lo strumento automatizzato di coltura liquida ha monitorato i livelli di anidride carbonica ogni 10 minuti e ha calcolato il TTP, che è il numero di giorni dall'inoculazione fino a quando le colture sono contrassegnate come positive. È stata illustrata una relazione inversa tra TTP e valori log(10) di CFU nell'inoculo iniziale.
Quando la crescita intracellulare di Mycobacterium tuberculosis all'interno dei macrofagi determinata enumerando CFU è stata confrontata con il metodo di coltura automatizzato descritto, è stata ottenuta una correlazione significativa tra i risultati. La crescita del Mycobacterium tuberculosis è stata presentata graficamente confrontando i valori di TTB fino a otto giorni dopo l'infezione dei macrofagi con il valore TTP iniziale. Una tendenza simile tra CFU e coltura liquida ha dimostrato una significativa inibizione della crescita di Mycobacterium tuberculosis nei macrofagi in presenza di acido retinoico all-trans, o AtRA, in soluzione, o la dose equivalente di AtRA incapsulata in microparticelle PLGA.
Un esperimento dose-risposta è stato condotto in cellule THP-1 infette per determinare l'efficacia dell'antibiotico Linezolid da solo, o la combinazione di linezolid e interferone gamma. Non è stata osservata alcuna interazione significativa tra i farmaci. La colorazione AFP ci consente di utilizzare un MOI basso per ridurre al minimo la morte cellulare quando si infettano i macrofagi e per garantire che lo stesso MOI venga utilizzato indipendentemente dal trattamento utilizzato.
Seguendo questo protocollo, i principali farmaci anti-TB possono essere identificati e studiati ulteriormente per studiare la loro efficacia in vivo.
