Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Grants Salute NS-38849 e DK-076160, la Juvenile Diabetes Research Foundation Centro per lo Studio delle complicanze nel diabete, il Programma di neurologia ricerca e scoperta e la A. Alfred Taubman Medical Research Institute presso l&#39; Università del Michigan. Questo lavoro usato la morfologia e l&#39;analisi Core Image del Centro Michigan Diabetes Research e formazione, finanziato dal National Institutes of Health di Grant 5P60 DK-20572 presso l&#39;Istituto Nazionale del Diabete e digestivi e malattie renali. Gli autori ringraziano T. Scott Clarke da Molecular Probes / Invitrogen per i suoi preziosi consigli sui vari Click-iT EdU etichettatura kit e la donazione generosa di reagenti per sostenere lo sviluppo iniziale della tecnica di amplificazione Edu.

1. Preparazione dei neuroni <ol><li> Ganglio della radice dorsale (DRG) i neuroni sono cresciuti su sterili (autoclave) coprioggetto da 12 mm di vetro in un 24-ben piastra di coltura. </li><li> I 10 magazzino mM di Edu (in DMSO, Click-iT EdU micropiastre Assay Kit) è normalmente diluita 1:100 nel terreno di coltura per ottenere una soluzione 10X EdU (100 mM) e poi diluito 1:10 nella cultura pozzi (per esempio 30 microlitri della soluzione del EdU 10X in un totale di 300 ml di terreno di coltura). Neuroni DRG vengono incubate con una concentrazione finale di 10 EdU mM a 37 ° C e 5% CO 2 tra 2-24 ore. Il periodo di tempo dipende da come trattamenti influenzano il tasso di sintesi del DNA mitocondriale. </li><li> In una cappa aspirante, i neuroni DRG sono fissate nel 2% paraformaldeide per 10-15 minuti a temperatura ambiente, lavate due volte in PBS 1X 2-5 minuti ogni lavaggio e conservati in fresco 1X PBS per fino a 1 mese a 4 ° C. </li><li> Coprioggetto sono trasferiti con punta fine pinze ad una camera preparata umido (BioAssay piatto Corning con fondo nero tappezzata per contrasto, avvolto in un foglio di alluminio per proteggere i componenti sensibili luce e umidificata con Kimwipes acqua satura) e messo su un foglio di Parafilm M che fornisce una superficie idrofoba di confinare le soluzioni per il coprioggetto. Il protocollo che segue è stato progettato per 28 coprioggetto e le soluzioni sono preparate per 32 coprioggetti (circa il 14% di volume in più). Soluzioni con componenti costosi o limitata sono fatti in modo che il 75-80 microlitri vengono utilizzati su ogni vetrino. Altrimenti, 200-300 microlitri vengono utilizzati per soluzioni di lavaggio e blocco di lavare accuratamente le soluzioni precedenti. </li><li> Riapplicare PBS 1X per coprire la superficie di ogni coprioggetto (200-300 mL). Preparare il Click-iT saggio e tyramide kit di amplificazione del segnale come descritto di seguito e nelle istruzioni del produttore. </li></ol> Preparazione di Click-iT EdU micropiastre Assay Kit La maggior parte dei componenti del Click-iT Assay Kit EdU Microplate sono pre-made e sono conservati a 4 ° C [2x Click-iT tampone di reazione (E Component 10x), CuSO4 (100 mM, componente F), Click-iT EdU fissativo ( componente D) e tampone di bloccaggio (2x componente H)]. Click-iT Additivo EdU Buffer (10x Component G) è conservato a -20 ° C per evitare che si trasformi giallo-marrone nel tempo. Questo componente tollera ripetuti cicli di gelo-disgelo. L&#39;Oregon verde 488 azide (componente B) deve essere suddivisa in piccole quantità (10-20 mL) per ridurre al minimo i cicli di gelo-disgelo e conservati a -20 ° C. Per preparare una soluzione madre della anti-Oregon Verde coniugato HRP (componente I), aggiungere 75 ml di Milli Q dH 2 O al flaconcino. Mescolare pipettando dolce o per inversione per evitare la formazione di schiuma e conservare a 4 ° C. Non vortice. Preparazione del TSA Kit # 12, con HRP capra anti-IgG e Alexa Fluor 488 Kit Tyramide Per preparare la soluzione tyramide magazzino, sciogliere il materiale solido (Alexa Fluor 488 tyramide, Componente A) in 150 ml di DMSO (componente B). Capovolgere il flaconcino più volte per sciogliere qualsiasi tipo di rivestimento tyramide lati del flacone. Soluzione negozio in piccole aliquote (10-20 mL) a ≤ -20 ° C, essiccato e protetto dalla luce. 2. Click-iT 5-etinil-2-deossiuridina (EDU) Etichettatura NOTA: Tutte le soluzioni vengono rimossi con una pipetta a bulbo di trasferimento con una punta di 200 l apposto alla fine per rimuovere delicatamente le cellule liquidi senza perdere. Evitare di utilizzare una linea di vuoto, che di solito rimuovere soluzioni troppo energicamente. Una pipetta bulbo viene utilizzato per inondare delicatamente vetrini con 200-300 ml di soluzioni di lavaggio per lavare accuratamente la soluzione precedente. <ol><li> Le cellule sono permeabilizzate con 0,1% Triton X-100 in soluzione PBS 1X per 10 minuti a temperatura ambiente in una camera coperta umida. Utilizzare l&#39;1% Triton-X-100 soluzioni di riserva. <ul><li> Fai 3000 ml di 0.1% Triton X-100 con l&#39;aggiunta di 300 ml 1% Triton X-100 stock 2700μL PBS 1X. </li><li> Usa 75-80 microlitri per coprioggetto. </li></ul></li><li> Rimuovere il Triton X-100 soluzione e lavare due volte con PBS 1X. </li><li> Perossidasi endogena è spento da una riduzione dell&#39;1% H 2 O 2 in soluzione PBS 1X per 30 minuti a temperatura ambiente. Diluire 30% H 2 O 2 soluzione con PBS 1X. Questa soluzione deve essere fresco, ma può essere effettuata durante la fase di permeabilizzazione 10 minuti sopra (punto 3.1). <ul><li> Fai 3000 ml di una riduzione dell&#39;1% H 2 O 2 con l&#39;aggiunta di 100 l 30% di H 2 O 2-2900 microlitri di PBS 1X. </li><li> Usa 75-80 microlitri per coprioggetto. </li><li> Rimuovere la soluzione perossidasi e lavare due volte con PBS 1X. </li></ul></li><li> Click-iT EdU Reazione <ul><li> Per 32 coprioggetto (32 x 80 microlitri =2560 mL) per un totale di 2560 microlitri è necessario. La reazione 2x è fatto nel 1280 microlitri, che è la metà del volume totale della reazione. </li><li> Appena preparare il Click-iT Cocktail di reazione prima di iniziare la correzione dopo 5 minuti (punto 3.5 di seguito). </li><li> Mescolate il cocktail pipettando su e giù. Non vortice quando si effettua questa reazione. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 2 x reazione Cocktail I componenti sono da Click-iT EdU micropiastre Assay Kit </td><td> La metà del volume: 1280 microlitri </td></tr><tr><td> Milli Q dH 2 O </td><td> 1132,8 microlitri </td></tr><tr><td> 2x Click-iT tampone di reazione (E Component 10x) </td><td> 100,3 microlitri </td></tr><tr><td> Click-iT EdU Additivo Buffer (G Component 10x) </td><td> 25,6 microlitri </td></tr><tr><td> CuSO 4 (100 mm, F Component) </td><td> 25,6 microlitri </td></tr><tr><td> Oregon Verde Azide (un componente) </td><td> 6,4 microlitri </td></tr><tr><td> Totale </td><td> 1290,7 microlitri </td></tr></tbody></table> NOTA: I volumi usato sopra sono proporzionali ai volumi elencati nella Click-iT direzioni Assay kit EdU micropiastre. Il volume finale di Cocktail reazione è poco più di 1280 microlitri. </li><li> Il Click-iT 2X reazione viene diluito con uguale volume di Click-iT EdU fissativo (Componente D) a destra prima dell&#39;uso. Mescolando questi insieme rende una soluzione uniforme per tutti reazione coprioggetto. </li><li> Aggiungi 1290,7 microlitri Click-iT EdU fissativo (Componente D) per il cocktail 1290,7 reazione microlitri. Usa 75-80 microlitri per coprioggetto. </li></ul></li><li> Post-fix i neuroni con Click-iT EdU fissativo (Componente D) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Fissare e rimuovere aggiungere cocktail reazione dall&#39;alto (punto 3.4). Copertura al riparo dalla luce e incubare per 25 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente il cocktail di reazione. Lavare due volte con tampone diluito 1X blocco (2X Component H). <ul><li> Fai 5200 ml di 1X tampone di bloccaggio diluendo 2600 Buffer microlitri di blocco (2x componente H) con un uguale volume di MilliQ d H 2 O (2600 mL). Usa 75-80 microlitri per coprioggetto. </li></ul></li><li> Sotto un epi-microscopio a fluorescenza, controllare per la colorazione verde Oregon nei nuclei delle cellule di controllo mitoticamente attivo. </li></ol> 3. Tyramide amplificazione del segnale (TSA) di EdU segnale <ol><li> Aggiungere 1% di soluzione ad ogni blocco TSA coprioggetto e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. <ul><li> Fai microlitri 6000 di 1% soluzione blocco TSA pesando 0,06 g di reagente di blocco TSA (TSA kit # 12, Componente D) e aggiungerla a 6000 microlitri di PBS 1X. Vortex per mescolare. L&#39;aggiunta di siero di capra al 5% nel 1% soluzione blocco TSA spesso contribuire a ridurre legame non specifico. </li></ul></li><li> In breve rotazione anti-Oregon verde perossidasi coniugato magazzino anticorpi (componente I del Click-iT Assay EdU micropiastre), preparato 2-24 ore prima del TSA. Diluire l&#39;anticorpo primario 1:300 in soluzione% 1 TSA bloccare e invertire o pipetta su e giù delicatamente per mescolare. Non vortice di non perturbare le HRP-coniugato anticorpo. Rimuovere l&#39;1% soluzione blocco TSA, aggiungere 75 microlitri per ogni coprioggetto e incubare una notte a 4 ° C. <ul><li> L&#39;anticorpo può essere utilizzato più concentrato, come ad esempio 1:150, ma è disponibile in quantità limitate, in modo da utilizzare con parsimonia. Anche in questo caso, l&#39;aggiunta di siero di capra al 5% nel 1% soluzione blocco TSA spesso contribuire a ridurre legame non specifico della Oregon anti-perossidasi di rafano verde anticorpi coniugati. </li><li> Fai 2560 ml di una soluzione di anticorpo 1:300 con l&#39;aggiunta di 8,53 l di Coniglio magazzino anti-Oregon Green-HRP (Click-iT EdU micropiastre Assay) a 2560 microlitri 1% TSA blocco. Mescolare pipettando dolce o inversione. </li></ul></li><li> Il giorno seguente, togliere la soluzione di anticorpi e lavare tre volte con PBS 1X. Incubare i coprioggetti nel lavaggio finale, per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente per garantire che l&#39;anticorpo non legato primario è stato rimosso. </li><li> Preparare reazione Tyramide di 2560 microlitri (32 coprioggetto x 80 mL). <ul><li> Fare 400 ml di una H 0,15% 2 O 2 soluzione (100X) con l&#39;aggiunta di 2 ml di 30% H 2 O 2 (TSA kit # 12, componente F) a 398 Buffer Amplificazione microlitri (TSA kit # 12, E Component) . Questo dovrebbe essere fatto appena prima necessità. </li><li> Per un volume finale di 2560 microlitri combinare: <ul><li> 25,6 microlitri Tyramide-488 (TSA componente del kit A) </li><li> 2508,8 Buffer Amplificazione microlitri (TSA E Component kit) </li><li> 25,6 microlitri 0,15% H 2 O 2 (dall&#39;alto per una finale 0,0015% H 2 O 2) </li><li> Rimuovere 1X PBS e incubare con la reazione Tyramide per 15 minuti a temperatura ambiente. </li></ul></li></ul></li><li> Rimuovere reazione Tyramide e risciacquare tre volte con PBS 1X, incubando nel lavaggio finale per 30-60 minuti a temperatura ambiente come prima. </li><li> Verificare la presenza di mtDNA etichettatura sotto un epi-microscopio a fluorescenza. <ul><li> Coprioggetto montaggio su vetrini da microscopio di vetro con un mezzo Antifade montaggio, come prolungare oro con DAPI. In alternativa, l&#39;etichettatura e EdU amplificazione può essere seguito da standard di immunocitochimica fluorescenti ad etichettare altri marcatori cellulari. </li></ul></li></ol> 4. Risultati rappresentante: Visualizzazione di replica del DNA mitocondriale come marker per la biogenesi mitocondriale Siamo interessati a come i neuroni sensoriali (Figura 1) regolano il numero di mitocondri. Questo protocollo verrà etichetta mtDNA di nuova sintesi con un marcatore fluorescente come un modo per misurare nuovi mitocondri. L&#39;incorporazione della EdU sintetico nucleotide seguita dalla chimica clic del amplificazione Oregon Green-azide e la successiva con l&#39;Alexa Fluor-488 risultati tyramide per l&#39;etichettatura di mtDNA con un segnale fluorescente verde (Figura 2). Se fatto correttamente, il segnale amplificato verde è sufficientemente superiore a fluorescenza di fondo (come autofluorescenza cellulare o un effetto collaterale della HRP-reazione TSA). Questa tecnica è stata progettata per etichetta mtDNA nuova replicato al fine di visualizzare e quantificare la biogenesi mitocondriale all&#39;interno di compartimenti subcellulari dei neuroni (Figura 3). L&#39;etichettatura EdU permette per la successiva immunocitochimica fluorescenti di etichettare gli altri marcatori cellulari come neurofilamenti (Fig. 3D). La reazione TSA può essere fatto anche con altre fluorescenti tyramides Alexa Fluor come Alexa Fluor 594-tyramide. Il risultato è un segnale fluorescente verde nucleare dalla Green-azide reazione click Oregon nel nucleo, ma nessun segnale verde nel mtDNA, che è rilevabile prima della TSA. L&#39;amplificazione con Alexa Fluor 594-tyramide intensifica l&#39;etichetta nucleare e rivela la EdU incorporato in mtDNA con un segnale rosso fluorescente (Figura 4). Una procedura di amplificazione simile viene utilizzato per visualizzare incorporazione di BrdU in nuova sintesi del DNA mitocondriale (Figura 5), ​​tuttavia, questo metodo richiede un ulteriore passo per recuperare l&#39;epitopo BrdU sia da un acido duro (HCl) o enzimi digerire, che non è necessario per EdU etichettatura. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentante contrasto differenziale di interferenza (DIC) immagini di embrionale (a sinistra) e adulti (a destra) ganglio della radice dorsale (DRG), i neuroni che sono tipicamente utilizzati per l&#39;analisi. Bar = 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Schema che rappresenta il regime per l&#39;etichettatura EdU nel mtDNA con un segnale verde fluorescente. Lo schema rappresenta le tre fasi del protocollo per l&#39;etichettatura EdU nel mtDNA con un segnale verde fluorescente. Mitoticamente attivo F11 cellule di neuroblastoma servire come controllo positivo e illustrare il modello di etichettatura dei EdU che è stata incorporata nel DNA nucleare e mitocondriale. Il primo passo (P1) è di incorporare un analogo della timidina in nuova sintesi del mtDNA incubando le cellule in presenza di Edu. Il secondo passo (P2) si basa sulla chimica click per etichetta EdU incorporato con una Oregon Green-azide. Segnale verde è visibile nei nuclei delle cellule che replicare il loro DNA nucleare. La fase finale (P3) è quello di amplificare il Gr Oregoneen-azide segnale da incubazione con un anticorpo coniugato HRP-coniglio contro Oregon verde seguita da incubazione con Alexa Fluor 488 tyramide etichettati in presenza di perossido di idrogeno (H 2 O 2) per visualizzare il segnale verde nel mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. EdU etichettatura del mtDNA nel ganglio della radice dorsale (DRG) neuroni. Neuroni sono incubati con Edu e il segnale viene poi amplificato a rivelare mtDNA che incorporava Edu. Rappresentante immagini di fluorescenza sovrapposti a luce trasmessa mostrando segnali verde puntata di amplificati EdU (EDU-OG-TSA, verde) incorporato nel DNA mitocondriale di nuova sintesi di entrambi embrionale (A) e adulti (BD) neuroni DRG. La procedura di etichettatura EdU permette per la successiva colorazione di immunofluorescenza di marcatori neuronali come neurofilamenti (D, αNF, in rosso). Barre di scala = 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Schema che rappresenta il regime per l&#39;etichettatura EdU nel mtDNA con un segnale rosso fluorescente. Lo schema rappresenta le tre fasi del protocollo per l&#39;etichettatura EdU nel mtDNA con un segnale rosso fluorescente. Mitoticamente attivo F11 cellule di neuroblastoma servire come controllo positivo e illustrare il modello di etichettatura dei EdU che è stata incorporata nel DNA nucleare e mitocondriale. Il primo passo (P1) è di incorporare un analogo della timidina in nuova sintesi del mtDNA incubando le cellule in presenza di Edu. Il secondo passo (P2) si basa sulla chimica click per etichetta EdU incorporato con una Oregon Green-azide. Segnale verde è visibile nei nuclei delle cellule che replicare il loro DNA nucleare. La fase finale (P3) è quello di amplificare il Green-azide Oregon segnale da incubazione con un anticorpo coniugato HRP-coniglio contro Oregon verde seguita da incubazione con Alexa Fluor 594 tyramide etichettati in presenza di perossido di idrogeno (H 2 O 2) per visualizzare segnale rosso nel mtDNA. <img src="/files/ftp_upload/2147/2147fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. BrdU etichettatura e amplificazione del segnale tyramide con un segnale verde o rosso fluorescente nel mtDNA. Lo schema rappresenta la procedura per l&#39;etichettatura BrdU nel mtDNA di nuova sintesi sia con un segnale verde o rosso fluorescente. Un primo passo è necessario per recuperare il epitopo BrdU sia da un acido (HCl) o enzimi digerire, che non è necessaria per l&#39;etichettatura di Edu. Il passo successivo è l&#39;incubazione con un primario del mouse anticorpi anti-BrdU. Questo è seguito da incubazione con perossidasi di rafano (HRP)-capra coniugato anti-topo. Infine, il segnale viene amplificato con un tyramide verde o rosso fluorescente in presenza di perossido di idrogeno (H 2 O 2) per la visualizzazione del segnale nel mtDNA.

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+mitochondrial+DNA+occurs+throughout+the+mitochondria+of+cultured+human+cells.">Replication of mitochondrial DNA occurs throughout the mitochondria of cultured human cells.</a> Exp. Cell. Res. 289, 133-142 (2003).</li><li>Amiri, M., Hollenbeck, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biogenesis+in+the+axons+of+vertebrate+peripheral+neurons.">Mitochondrial biogenesis in the axons of vertebrate peripheral neurons.</a> Dev. Neurobiol. 68, 1348-1361 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo sviluppato un dosaggio sensibile per etichettare mtDNA di nuova sintesi in singole cellule utilizzando un amplificazione tyramide segnale di Edu. Uno dei maggiori problemi durante l&#39;ottimizzazione di questo protocollo è stato il risultato incoerenti tra lamelle. Sono state apportate modifiche ai protocolli di kit di Invitrogen per evitare la sovrapposizione di piccoli volumi su vetrini singoli e rendendo le soluzioni maestro da utilizzare per tutte le lamelle. Il 75-80 microlitri utilizzato per ogni bicchiere 12 millimetri vetrino circolare è un volume ideale per coprire completamente la superficie, fornendo una soluzione abbastanza per dare risultati coerenti tra i campioni. I tempi di incubazione e le concentrazioni di reagenti sono stati ottimizzati, ma i miglioramenti possono essere visti con adattamenti per loro. Il protocollo è progettato per essere eseguito ogni processo una volta. Tuttavia, alcuni dei passaggi sono stati ripetuti con nuove soluzioni per recuperare campioni che non è riuscita dopo il primo tentativo. In particolare, i passi cliccare reazione EdU (3,4-3,6) sono stati ripetuti senza un significativo aumento della fluorescenza di fondo. L&#39;anti-Oregon Green-HRP incubazione degli anticorpi (4,1-4,3) e l&#39;amplificazione tyramide (4,4-4,5) passi sono stati anche ripetuti, ma più spesso si traduce in un segnale di scarsa rumore a causa della fluorescenza di fondo maggiore. I reagenti più sensibili sono i Click-iT Additivo Buffer EdU (componente G) e il coniglio anti-Oregon Green-HRP anticorpi (componente I) dalla Click-iT Assay kit EdU micropiastre. Il Click-iT Additivo Buffer EdU trasforma gradualmente giallo nel tempo se conservato a 4 ° C e tra 6-12 mesi scurisce notevolmente. Conservazione del Click-iT Additivo Buffer EdU a -20 ° C alleviare questo problema. L&#39;etichettatura e le fasi di amplificazione tyramide funzionano meglio quando il coniglio anti-Oregon Green-HRP anticorpale è utilizzato entro 4-6 mesi di ricostituire in MilliQ dH 2 O. L&#39;etichettatura mite del EdU nel mtDNA permette di confronti diretti con l&#39;aggiunta di marcatori cellulari 9-11 e migliora l&#39;utilità di questa tecnica su altri analoghi della timidina, come il 5-bromo-2-deossiuridina (BrdU), che richiede un trattamento duro per recuperare il suo epitopo all&#39;interno del DNA. Il nostro laboratorio 11-12 e 13-15 gli altri hanno utilizzato con successo BrdU per etichettare mtDNA. La tecnica di etichettatura BrdU è simile a quello utilizzato per l&#39;istruzione, ma ha alcune importanti differenze (Figura 5). Dopo la fase di permeabilizzazione sopra elencati (3.1-3.2), l&#39;epitopo BrdU viene recuperato con un passo denaturazione (2 N HCl per 30 minuti a 37 ° C seguita da tre lavaggi in PBS 1X). La BrdU viene etichettato con un anticorpo primario contro BrdU (Vector Laboratories diluito 1:50 in soluzione 1% bloccando dal kit TSA e incubate overnight a 4 ° C). Un passo anticorpo secondario è necessario per amplificare il segnale BrdU (capra anti-IgG di topo coniugato con HRP dal kit TSA # 2 e # 5, diluito 1:100 in soluzione 1% di blocco e incubate per 45 minuti a temperatura ambiente) prima i passi TSA (4,3-4,5 sopra). Avere due analoghi della timidina, Edu e BrdU, di mtDNA etichetta è vantaggioso per l&#39;esecuzione di esperimenti di doppia etichetta dove mtDNA possono essere etichettate in sequenza di impulsi di etichettatura paradigmi 11. Il nostro laboratorio sta usando il EdU BrdU e l&#39;etichettatura di mtDNA per verificare la regolamentazione della biogenesi mitocondriale nel contesto di neuropatia diabetica, una complicanza comune del diabete. Abbiamo utilizzato con successo l&#39;amplificazione del segnale per misurare le variazioni del mtDNA biogenesi in singoli neuroni 11-12. Questa tecnica è utile in altri esperimenti progettati per esplorare i meccanismi di replicazione del DNA mitocondriale e del fatturato o per identificare i farmaci che inibiscono la sintesi del DNA mitocondriale. Inoltre, i principi di base di amplificare segnali Edu e BrdU può essere applicato ad altri studi che misurano la replicazione del DNA o riparazione.

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>12 mm coverslips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>12-545-82</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>245 mm x 245 mm BioAssay Dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>431111</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Parafilm M</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>PM-996</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>paraformaldehye</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P6148</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T-8532</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phosphate buffered saline 10X solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP399</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Transfer Pipet</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-7M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hydrogen peroxide, 30% in water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP2633</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Click-iT EdU Microplate Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>C10214</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #12, with HRP&#x2014;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20922</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #15, with HRP&#x2013;goat anti-rabbit IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20925</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ProLong Gold antifade reagent with DAPI</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P-36931</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Polyclonal rabbit Neurofilament antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Chemicon</td>
<td>AB1981</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse monoclonal anti-BrdU antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>VP-B209</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #2, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 488 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20912</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TSA Kit #5, with HRP&#x2014;goat anti-mouse IgG and Alexa Fluor 594 tyramide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T20915</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

visualization of mitochondrial dna replication in individual cells by edu signal amplification

I mitocondri sono regolatori chiave di energia cellulare e la biogenesi mitocondriale è una componente essenziale di regolare numeri mitocondri nelle cellule sane 1-3. Un approccio per il monitoraggio biogenesi mitocondriale è quello di misurare la percentuale di DNA mitocondriale (mtDNA) replica 4. Abbiamo sviluppato una tecnica sensibile per etichettare mtDNA di nuova sintesi in singole cellule per studiare biogenesi mitocondriale. La tecnica combina l&#39;incorporazione di 5-etinil-2&#39;-deossiuridina (EDU) 5-7 con una amplificazione del segnale tyramide (TSA) 8 protocollo di visualizzare la replicazione del DNA mitocondriale all&#39;interno di compartimenti subcellulari di neuroni. EdU è superiore agli analoghi della timidina altri, come il 5-bromo-2-deossiuridina (BrdU), perché la reazione iniziale clicca per EdU etichetta 5-7 non richiede trattamenti acidi forti o enzima digerisce che sono necessarie per esporre l&#39;epitopo BrdU . L&#39;etichettatura più mite di EdU permette la comparazione diretta della sua costituzione con altri marcatori cellulari 9-10. La possibilità di visualizzare e quantificare la biogenesi mitocondriale fornisce uno strumento essenziale per investigare i meccanismi utilizzati per regolare la biogenesi mitocondriale e che consentono di studiare la patogenesi associata a tossicità da farmaci, l&#39;invecchiamento, cancro e malattie neurodegenerative. La nostra tecnica è applicabile ai neuroni sensoriali così come altri tipi di cellule. L&#39;uso di questa tecnica per misurare la biogenesi mitocondriale ha implicazioni importanti nel favorire la comprensione sia normale fisiologia cellulare, così come stati di malattia ridotta.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification at JoVE.com

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Abbiamo sviluppato una tecnica sensibile per etichetta di nuova sintesi del DNA mitocondriale (mtDNA) in celle individuali al fine di studiare la biogenesi mitocondriale. La tecnica combina l&#39;incorporazione di EdU insieme ad un tyramide amplificazione del segnale (TSA), protocollo di visualizzare la replicazione del DNA mitocondriale all&#39;interno di compartimenti subcellulari di neuroni.

Visualizzazione della replicazione del DNA mitocondriale in singole celle da amplificazione del segnale EdU

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

visualization-mitochondrial-dna-replication-individual-cells-edu

Research

JoVE Journal

Neuroscience

22.8K Views.  University of Michigan. Abbiamo sviluppato una tecnica sensibile per etichetta di nuova sintesi del DNA mitocondriale (mtDNA) in celle individuali al fine di studiare la biogenesi mitocondriale. La tecnica combina l'incorporazione di EdU insieme ad un tyramide amplificazione del segnale (TSA), protocollo di visualizzare la replicazione del DNA mitocondriale all'interno di compartimenti subcellulari di neuroni.

Video: Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Automated Interactive Video Playback for Studies of Animal Communication

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, parameter-based computer animation offers the opportunity to independently manipulate any number of behavioral, morphological, or spectral characteristics in the context of realistic, moving images of animals on screen. A major limitation of conventional playback, however, is that the visual stimulus lacks the ability to interact with the live animal. Borrowing from video-game technology, we have created an automated, interactive system for video playback that controls animations in response to real-time signals from a video tracking system. We demonstrated this method by conducting mate-choice trials on female swordtail fish, Xiphophorus birchmanni. Females were given a simultaneous choice between a courting male conspecific and a courting male heterospecific (X. malinche) on opposite sides of an aquarium. The virtual male stimulus was programmed to track the horizontal position of the female, as courting males do in the wild. Mate-choice trials on wild-caught X. birchmanni females were used to validate the prototype's ability to effectively generate a realistic visual stimulus.

Video playback is a widely used technique in animal behavior. We created and evaluated a program that applies rules-based, interactive playback of 3-D computer animations in response to real-time, automated data on subject behavior.

Riproduzione automatica Interactive Video per gli Studi di comunicazione animale

Video playback is a widely-used technique for the controlled manipulation and presentation of visual signals in animal communication. In particular, ...

Ricerca

Neuroscienze

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-cellula Imaging di cellule sensoriali Precursore in Organo intatto Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Visualizzazione dei Propriorecettori in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve e pupe

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etichettatura mirata di neuroni in una specifica funzionale Micro-dominio della neocorteccia combinando segnale intrinseca e due fotoni Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

Un metodo per High Fidelity optogenetic controllo dei singoli Piramidale neuroni<em&gt; In vivo</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Evaluation of Bioenergetic Function in Cerebral Vascular Endothelial Cells

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types that comprise the BBB; these cells have a very high-energy demand, which requires optimal mitochondrial function. In the case of disease or injury, the mitochondrial function in these cells can be altered, resulting in disease or&#160;the opening of the BBB. In this manuscript, we introduce a method to measure mitochondrial function in CVE cells by using whole, intact cells and a bioanalyzer. A mito-stress assay is used to challenge the cells that have been perturbed, either physically or chemically, and evaluate their bioenergetic function. Additionally, this method also provides a useful way to screen new therapeutics that have direct effects on mitochondrial function. We have optimized the cell density necessary to yield oxygen consumption rates that allow for the calculation of a variety of mitochondrial parameters, including ATP production, maximal respiration, and spare capacity. We also show the sensitivity of the assay by demonstrating that the introduction of the&#160;microRNA, miR-34a, leads to a pronounced and detectable decrease in mitochondrial activity. While the data shown in this paper is optimized for the bEnd.3 cell line, we have also optimized the protocol for primary CVE cells, further suggesting the utility in preclinical and clinical models.

Endothelial cell mitochondria are critical to maintain blood-brain-barrier integrity. We introduce a protocol to measure bioenergetic function in cerebral vascular endothelial cells.

Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

The integrity of the blood-brain-barrier (BBB) is critical to prevent brain injury. Cerebral vascular endothelial (CVE) cells are one of the cell types ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized animals. Highly sensitive, genetically encoded fluorescent reporters of Ca2+ have revolutionized the recording of cell and synaptic activity using non-invasive optical approaches in behaving animals. When combined with genetic and optogenetic techniques, the molecular mechanisms that modulate cell and circuit activity during different behavior states can be identified.
Here we describe methods for ratiometric Ca2+ imaging of single neurons in freely behaving Caenorhabditis elegans worms. We demonstrate a simple mounting technique that gently overlays worms growing on a standard Nematode Growth Media (NGM) agar block with a glass coverslip, permitting animals to be recorded at high-resolution during unrestricted movement and behavior. With this technique, we use the sensitive Ca2+ reporter GCaMP5 to record changes in intracellular Ca2+ in the serotonergic Hermaphrodite Specific Neurons (HSNs) as they drive egg-laying behavior. By co-expressing mCherry, a Ca2+-insensitive fluorescent protein, we can track the position of the HSN within ~ 1 &#181;m and correct for fluctuations in fluorescence caused by changes in focus or movement. Simultaneous, infrared brightfield imaging allows for behavior recording and animal tracking using a motorized stage. By integrating these microscopic techniques and data streams, we can record Ca2+ activity in the C. elegans egg-laying circuit as it progresses between inactive and active behavior states over tens of minutes.

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

This protocol describes the use of genetically encoded Ca2+ reporters to record changes in neural activity in behaving Caenorhabditis elegans worms. &#8195;

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Visualization of Cortical Modules in Flattened Mammalian Cortices

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and can be delineated by certain histochemical and immunohistochemical methods. In this study, we highlight a method to isolate the cortex from mammalian brains and flatten them to obtain sections parallel to the cortical sheet. We further highlight selected histochemical and immunohistochemical methods to process these flattened tangential sections to visualize cortical modules. In the somatosensory cortex of various mammals, we perform cytochrome oxidase histochemistry to reveal body maps or cortical modules representing different parts of the body of the animal. In the medial entorhinal cortex, an area where grid cells are generated, we utilize immunohistochemical methods to highlight modules of genetically determined neurons which are arranged in a grid-pattern in the cortical sheet across several species. Overall, we provide a framework to isolate and prepare layer-wise flattened cortical sections, and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods in a wide variety of mammalian brains.

This article describes a detailed methodology to obtain flattened tangential sections from mammalian cortices and visualize cortical modules using histochemical and immunohistochemical methods.

Visualizzazione dei moduli corticali nelle cortecce dei mammiferi appiattite

The cortex of mammalian brains is parcellated into distinct substructures or modules. Cortical modules typically lie parallel to the cortical sheet, and ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.