Il nostro laboratorio utilizza Drosophila melanogaster per identificare e caratterizzare geni e percorsi che regolano la funzione mitocondriale durante lo sviluppo e l'omeostasi fisiologica. Il protocollo qui presentato utilizza l'imaging dal vivo con aggiunta di perossido di idrogeno per visualizzare gli effetti dei danni ossidativi sulla localizzazione e la dinamica delle strutture subcellulari nell'ovaio adulto drosophila. Usiamo spesso protocolli di imaging per studiare come le mutazioni alterano la normale localizzazione mitocondriale e il movimento nelle cellule germinali femminili.
Nel corso dei nostri studi abbiamo scoperto che lo stress introdotto dalla dissezione o da altri fattori di stress cellulare ha avuto un profondo impatto sulla localizzazione mitocondriale. Come controllo per identificare se lo stress generale, al contrario del trattamento sperimentale, è la causa di eventuali cambiamenti nella localizzazione o nel comportamento delle strutture subcellulari. Abbiamo sviluppato questo protocollo per introdurre lo stress di controllo utilizzando il perossido di idrogeno.
In questo video, dimostreremo come il danno ossidativo indotto dal perossido di idrogeno cambia la distribuzione dei mitocondri e della ribonucleoproteina Clu. I supporti più adatti a questa tecnica di imaging dal vivo contenevano i supporti Drosophila di Schneider contenenti il 15% di siero bovino fetale inattivato dal calore, 0,6 X Pen-Strep e 200 microgrammi per insulina bovina microliter, di seguito denominata supporto Schneider completo. L'esecuzione della preparazione dei supporti in condizioni sterili garantirà che non sia contaminata.
Mescolare bene il contenuto e conservare durante la notte a quattro gradi. L'insulina non si dissolve completamente nel supporto Schneider completo e noterai un precipitato depositarsi nella parte inferiore del tubo. Fai aliquote, assicurandoti di lasciare questo precipitato in quanto interferirà con l'imaging.
Questa soluzione può essere utilizzata per un mese se conservata in aliquote a quattro gradi. Per un'imaging ottimale delle cellule germinali femminili, preparare prima una fiala contenente un tampone di pasta di lievito umido che è la consistenza del burro di arachidi. Ciò garantisce che le femmine siano ben nutrite e producano tutte le fasi di sviluppo del follicolo per l'imaging.
Per mosche ottimali e sane, raccogli da zero a un giorno le femmine vecchie e trasferisci con i maschi in una fiala di cibo a mosca contenente pasta di lievito umido. Assicurarsi che le mosche addormentate non contattino la pasta di lievito in quanto possono attaccarsi ad essa. Nutrire le mosche da tre a sette giorni, cambiando la pasta di lievito ogni giorno.
Assicurarsi che la pasta di lievito contatti il fly food, in modo che non si asciughi. Per indurre danni ossidativi, utilizzeremo una soluzione stock di perossido di idrogeno al 30% e per visualizzare i mitocondri, useremo una soluzione stock di TMRE da 100 millimolare. È importante preparare le soluzioni multimediali fresche perché il perossido di idrogeno è suscettibile all'ossidazione e il TMRE si degrada nel tempo.
Poco prima della dissezione, in completo supporto schneider, preparare una nuova aliquota di due perossido di idrogeno micromolare, un'aliquota fresca di 46 nanomolare TMRE e un'aliquota fresca di 46 nanomolare TMRE più due perossido di idrogeno micromolare. Per la dissezione dell'ovaio avrai bisogno di due paia di pinza fine e un paio di aghi di tungsteno elettroliticamente affilati. Per sezionare le ovaie riempire un bicchiere da orologio con il supporto Schneider completo che è stato riscaldato a temperatura ambiente, quindi posizionare una singola mosca nel supporto utilizzando le forcep.
Afferrare delicatamente la mosca dal torace usando un paio di forcep fini. Con le altre forcep, afferrare il posteriore e tirare delicatamente per rimuovere le ovaie. Rimuovere qualsiasi cuticola o tessuto estraneo, quindi trasferire l'ovaio in un nuovo pozzo contenente mezzi freschi.
Le ovaie dovrebbero ancora muoversi dalla torcia muscolare circostante. Usando gli aghi di tungsteno affilati, stuzzicare delicatamente gli ovariole, facendo attenzione a rimuovere la torcia muscolare circostante. Se la toria muscolare non viene rimossa, come dimostrato qui, l'ovaria si contrae, causando problemi con l'acquisizione dell'immagine.
Una volta che le ovariole sono state sezionate in modo pulito, trasferirle in una goccia di 100 microliter di supporto su un piatto MatTek se si visualizzano strutture etichettate in modo endogeno. Trasferire gli ovarioli in una goccia di 100 microliter di supporti TMRE su un piatto MatTek se si visualizzano mitocondri etichettati con TMRE. Gli ovariole affonderanno sul fondo della goccia.
È importante praticare le dissezioni per iniziare a immaginare il tessuto il più rapidamente possibile. Una volta montati gli ovariole, posizionare il piatto sul microscopio invertito e acquisire immagini fisse o brevi video come registrazione delle condizioni di pretrattamento. Una volta fatto questo, mettere in pausa l'imaging dal vivo, rimuovere il coperchio e aggiungere con cura 100 microlitri della soluzione preparata perossido di idrogeno micromolare.
Evitare di rompere la superficie della goccia multimediale esistente o di aggiungere la soluzione troppo rapidamente, in modo da non spostare gli ovariole appoggiati sul fondo. Sostituire il coperchio del piatto, spostare e rifocalizzare l'ovariolo desiderato e riprendere l'imaging. Fai attenzione a riprendere l'imaging il più rapidamente possibile, poiché il trattamento sperimentale è sensibile al tempo.
Ecco le immagini fisse di un film, scattate dopo il trattamento con perossido di idrogeno. I mitocondri e le cellule germinali femminili sono dispersi in tutto il citoplasma quando le mosche sono ben nutrite e sane. Dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno, il danno ossidativo fa sì che i mitocondri si agluclino, che possono essere visti con la velocità di 10 minuti dopo il trattamento.
Dopo 20 minuti, il danno causa la dissipazione del potenziale della membrana mitocondriale. Pertanto, la maggior parte dei mitocondri svanisce. In questo film dal vivo del processo, i mitocondri possono essere visti rapidamente aggrapparsi e la maggior parte dei mitocondri alla fine svanisce.
Il lampeggiamento pulsante nel citoplasma, in particolare nelle cellule follicolari circostanti, appare caratteristico dell'aggiunta di TMRE. Come accennato in precedenza, l'imaging deve avvenire rapidamente dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno. Come mostrato qui, se trascorre troppo tempo, il potenziale della membrana mitocondriale è già perso e l'etichettatura TMRE si dissipa, rendendo i dati imprecabili.
In queste immagini fisse video, le particelle di Clu etichettate endogenamente GFP sono robuste e abbondanti nel germoplasma delle femmine ben nutrite. Dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno, le particelle di Clu si disperdono entro 10 minuti. Questo è dimostrato nel video di accompagnamento.
Dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno, le particelle di beatitudine di Clu si disperdono rapidamente. Abbiamo trovato questo protocollo uno strumento utile per garantire un'imaging accurata della localizzazione di tipo selvaggio di mitocondri e particelle di beatitudine Clu nelle cellule germinali femminili di Drosophila. Questo protocollo dovrebbe essere applicabile per un'ampia gamma di studi di imaging vivo e potrebbe essere utilizzato anche per trattare i tessuti prima della fissazione.
I passaggi più importanti sono isolare gli ovarioli liberi dalla fodera muscolare, aggiungere delicatamente il perossido di idrogeno, in modo da non rimuovere gli ovariole e immagine rapidamente dopo l'aggiunta di perossido di idrogeno. Speriamo che lo troverai un controllo utile per l'imaging dal vivo di una varietà di strutture subcellulari. Grazie per la visione e buona fortuna con i tuoi esperimenti.
