Name: laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes
Uploaded: 2016-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
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Work related to this technique is supported by NIH/NICHD RO1 HD070044 and USDA/NIFA Hatch projects W-3171 and W-2112.

1. Micropipetta Produzione <ol><li> micropipetta iniezione <ol><li> Posizionare un capillare di vetro borosilicato (diametro esterno (OD): 1,0 mm, diametro interno (ID): 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo. </li><li> Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga tapper. (Esempio: Heat: 825; Pull: 30; Velocity: 120; Tempo: 200; Pressione: 500). </li><li> Rimuovere con cura le pipette tirato dal dispositivo e posizionarlo su una microforge in posizione orizzontale. </li><li> Portare la pipetta tirato e il riscaldamento del filamento microforge con la sua perla di vetro a fuoco. Utilizzare il reticolo oculare per misurare lo spessore desiderato e spostare la pipetta orizzontale fino filamento riscaldatore raggiunge il diametro interno di destinazione (5 micron). </li><li> Regolare il calore a circa il 45% e delicatamente portare la pipetta verso il basso in modo che tocchi il filamento. Attivare brevemente il riscaldamento. Questo will leggermente fondere la pipetta in modo da aderire al filamento e per raffreddamento, la pipetta si romperà nel punto di contatto generando un taglio dritto. Nota: L&#39;impostazione della temperatura appropriata è fondamentale in questa fase dal momento che le temperature troppo alte renderanno la curva pipetta e quindi un taglio dritto, non sarà possibile e le temperature troppo basse non saranno sufficienti a fondere la pipetta (Figura 1A). </li><li> Fare un approssimativo di 30 ° angolo vicino alla punta della pipetta posizionandola a circa 10 micron di distanza dal filamento di riscaldamento. Impostare la temperatura a 60% ed attivare il riscaldamento. Nota: Questo piegare la pipetta sul filamento. Questo angolo è desiderato in modo che la punta dell&#39;ago è parallelo alla superficie della piastra di iniezione quando montato nell&#39;iniettore (Figura 1B). </li><li> Maneggiare pipette microiniezione con cautela in quanto sono estremamente nitide e fragile. </li></ol></li><li> tenendo micropipetta <ol><li> Posizionare un borosilicate capillare di vetro (OD: 1,0 mm ID: 0.75 mm) in un estrattore micropipetta (al centro dei titolari dei diritti e capillari sinistra) e bloccarlo. </li><li> Utilizzare un programma appropriato per tirare il capillare di vetro in modo che si traduce in una punta sottile con una lunga anche cono e pareti parallele (Esempio: Heat: 815; Pull: 20; Velocity: 140; Tempo: 175; Pressione: 200). </li><li> Rimuovere con cautela la pipetta tirato dal dispositivo estrattore e posizionarlo sul supporto microforge in posizione orizzontale. Regolare il fuoco sul filamento riscaldatore e pipetta. </li><li> Utilizzare il reticolo oculare per misurare il diametro pipetta e spostare la pipetta fino al suo diametro sopra il filamento raggiunge 180 micron. </li><li> Alla dimensione indicata, segnare il capillare di vetro con una penna punta di diamante, e quindi premere delicatamente sulla punta tirato a rompere il vetro. Questo dovrebbe portare a un taglio dritto (Figura 1C). </li><li> Spostare la pipetta in posizione verticale con la punta vicino al filamento. Impostare la temperatura<html> del microforge al 60%. </li><li> Fuoco smalto la punta della pipetta utilizzando tecniche standard 7 fino a raggiungere un ID di 40 micron. Utilizzare il reticolo oculare per controllare l&#39;ID (Figura 1D). </li><li> Realizzare un angolo la pipetta. <ol><li> Portare la pipetta torna in posizione orizzontale a circa 10 micron di distanza dal filamento e lontano dalla punta 5 mm. Impostare la temperatura a circa il 60% ed attivare il riscaldamento di piegare la pipetta sul filamento. Continuare riscaldamento fino a raggiungere un angolo desiderato (di circa 30 °). Controllare l&#39;angolo visivo (Figura 1E). Nota: La pipetta è di solito montato al microinjector ad un angolo approssimativo di 60 o rispetto al fondo del piatto iniezione. La punta della pipetta è piegata in modo che sia parallelo al fondo del piatto, che è necessaria per la corretta iniezione dell&#39;embrione al suo piano medio. </li></ol></li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 2. Impostazione Micromanipolatore <ol><li> Controllare che le microiniettori sono a pieno carico con olio e che non ci siano bolle d&#39;aria nel sistema (bolle nel microinjector impediscono un controllo preciso di iniezione). </li><li> Controllare che i micromanipolatori sono nella posizione centrale. Ciò consentirà per una vasta gamma di movimento delle pipette. </li><li> Inserire la pipetta tenendo nel supporto micromanipolatore sinistra e la pipetta di iniezione nel supporto micromanipolazione giusta. </li><li> Lasciare che l&#39;olio di entrare nelle pipette per capillarità e verificare che il sistema funzioni correttamente spostando olio su e giù dentro la pipetta utilizzando i controlli microinjector. Nota: se non c&#39;è movimento di olio all&#39;interno degli aghi, ci potrebbe essere uno zoccolo. In questo caso, utilizzare un ago nuovo. </li><li> Utilizzare i controlli micromanipolatore per portare le pipette nel centro del campo del microscopio di vista. Utilizzando 4X ingrandimento, controllare che le punte micropipetta sono nella corretta angolazione (parallel al fondo del piatto). Nota: Una corretta impostazione degli aghi è la chiave per una iniezione di successo e per i risultati coerenza. </li><li> Calibrare il sistema laser seguente manuale di taratura del produttore. </li></ol> 3. Preparazione del piatto iniezione (figura 2) <ol><li> Mettere una goccia 50 ml di riscaldato (37 ° C) SOF-HEPES (composizione descritto nella sezione materiali) supplementato con siero fetale bovino 20% (FBS) sul centro del coperchio di una piastra di Petri di 100 mm. Inserire un 1 - 2 goccia microlitri della soluzione da iniettare vicino alla goccia iniezione. Assicurarsi che gli embrioni non raffreddare sotto RT. Nota: In questo protocollo aggiungeremo il colorante Destrano-Red per la soluzione parenterale per essere in grado di visualizzare il sito di iniezione e tenere traccia in un secondo momento. </li><li> Coprire le gocce nella piastra iniezione utilizzando circa 10 ml di olio minerale. </li><li> Porre la capsula di iniezione sul palco del microscopio invertito e portare il pipEttes nella goccia iniezione. Verificare che gli aghi sono a fuoco all&#39;interno della goccia. Regolare la loro altezza in base alle esigenze utilizzando i controlli micromanipolatore. </li><li> Utilizzando un microdispenser, caricare circa 20 - 30 zigoti (17 - 20 hr post-fecondazione (HPF)) nella parte superiore della goccia iniezione. Eseguire iniezione a temperatura ambiente in modo che il numero di embrioni nella goccia iniezione è determinata dalla velocità con cui la persona può iniettare. Non caricare più embrioni di quelli che possono essere iniettati in 30 min. <ol><li> Per caricare gli embrioni nel microdispenser, premere lo stantuffo completamente ed immergere la punta nella soluzione contenente gli embrioni. Toccare gli embrioni che vengono raccolti con la punta del capillare di vetro (uno alla volta) e rilasciano lentamente il pistone così ogni embrione entra nel capillare. Ripetere questa operazione fino a quando tutti gli embrioni vengono prelevati o la capacità microdispenser è piena. </li><li> Per rilasciare gli embrioni caricati, premere delicatamente lo stantuffo fino a quando l&#39;intero volume di containing gli embrioni viene rilasciato dal capillare. </li></ol></li></ol> 4. microiniezione <ol><li> Utilizzando l&#39;obiettivo 4X, caricare la soluzione da iniettare nella pipetta di iniezione applicando pressione negativa (aspirazione). Caricare soluzione sufficiente per iniettare 2 - 3 zigoti. Quindi spostare la goccia iniezione. </li><li> All&#39;interno della goccia iniezione, spostare la pipetta tenendo così la punta si avvicina a uno zigote. Applicare una pressione negativa (aspirazione) con la partecipazione microinjector così lo zigote viene fissata alla pipetta detenzione e la modifica a un obiettivo 20X. </li><li> Una volta che lo zigote è attaccato alla pipetta holding, controllarne la qualità utilizzando la pipetta iniettando per spostare delicatamente l&#39;embrione in giro senza staccarla. Un zigote buona qualità dovrebbe avere i due corpi polari (anche se a volte è visto solo uno) e un citoplasma omogeneo. Non iniettare zigoti anormali (Figura 3a). </li><li> Se necessario, riposizionare l&#39;embrione di iniezione correttoluogo. Un buon posizionamento sarebbe quella in cui vi è uno spazio tra la ZP e PM, in modo che il PM non danneggiare dal laser. </li><li> Verificare che la pipetta di iniezione è posizionato sul piano medio dell&#39;embrione sfiorando zigote sul sito di iniezione. Se non è sul suo piano di mezzeria, l&#39;ago tenderà a rendere l&#39;embrione ruotare invece di foratura. Regolare l&#39;altezza della pipetta di iniezione come necessario. </li><li> Fare un buco nella ZP utilizzando un laser (Figura 3B). <ol><li> Utilizzando posto software del laser del reticolo laser nel ZP cui verrà effettuato il foro (sul lato opposto a dove l&#39;embrione è attaccato alla pipetta tenuta). Utilizzando la finestra di controllo del laser, fare clic sul pulsante di fuoco. Assicurarsi che la dimensione del foro è grande abbastanza per creare un&#39;apertura nella ZP per l&#39;ago di passare attraverso senza danneggiare il PM (Esempio: 0,662 ampiezza impulso msec / 6,9 micron Formato del foro). </li></ol></li><li> Passare l&#39;ago per l&#39;iniezioneattraverso il foro nella ZP e prendere contatto con il PM. Continuare a spingere la pipetta in avanti fino a quando l&#39;ago è ¾ del modo in l&#39;embrione (Figura 3C). </li><li> Osservare la posizione del menisco all&#39;interfase soluzione di olio, in modo da essere usato per controllare costantemente volume di iniezione. </li><li> Applicare pressione negativa (aspirazione) sulla pipetta di iniezione, che si tradurrà in PM e citoplasma essere inspirate l&#39;ago di iniezione. Continuare finché il movimento di citoplasma all&#39;interno dell&#39;ago accelera o quando il contenuto citoplasma mescolando con la soluzione iniettabile può essere visto. Questi indicheranno rottura del PM (Figura 3D). </li><li> Iniettare nuovamente il contenuto citoplasmatico seguita dalla soluzione nel citoplasma dello zigote applicando pressione positiva (iniezione), finché il menisco all&#39;interfase soluzione-olio ha avanzato diametro equivalente di uno zigote oltre il punto di partenza. Nota: Nelle nostre condizioni, questo rappresenta circa 7 pl di soluzione iniettata (Figura 3E). </li><li> Passare un obiettivo 4X e spostare l&#39;embrione / s iniettato al lato inferiore della goccia iniezione. Rilasciare l&#39;embrione mediante l&#39;applicazione di una pressione positiva sul microinjector azienda. Mantenere gli embrioni non iniettati sul lato superiore e quelli iniettati sul lato inferiore della goccia per tenere traccia degli embrioni iniettati / non-iniettato e lavorare in modo efficiente. </li></ol> 5. Embrione di recupero e iniezione Risultati <ol><li> Fare 3 gocce di circa 200 ml in un nuovo piatto con pre-riscaldato SOF-HEPES. Raccogliere gli embrioni iniettati usando una microdispenser (come descritto sopra). Lavare gli embrioni iniettati spostandoli attraverso il 3 SOF-HEPES gocce. </li><li> Contare gli embrioni lisati durante la microiniezione e gettarli. Nota: Un zigote lisato può essere facilmente distinguibili da un uno intatto dal momento che il primo appare traslucido, compilare l&#39;intero ZP, e ha di solito citoplasmaticacontenuti fuoriuscita all&#39;esterno dell&#39;embrione. </li><li> Facoltativamente, verificare l&#39;efficienza microiniezione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Essere consapevoli del fatto che l&#39;esposizione ai raggi UV può indurre danni embrione che può influenzare il successivo sviluppo. </li><li> Gruppi Cultura di 25 embrioni iniettati in 50 gocce microlitri di media ottimizzazione simplex di potassio (KSOM) integrato con 4 mg / ml albumina sierica bovina (BSA) sotto olio minerale a 38,5 ° C, 5% di CO 2 in aria, umidità e alla saturazione. </li><li> Integrare il terreno di coltura con il 5% di FBS due giorni dopo l&#39;iniezione. </li><li> Controllare blastocisti (BL) i tassi di 7 giorni dopo l&#39;iniezione. Calcola BL tariffe come numero totale di embrioni blastocisti / numero totale di embrioni coltivati ​​in quella goccia. </li></ol>

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	<li>McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+composition+of+lipids+in+immature+cattle,+pig+and+sheep+oocytes+with+intact+zona+pellucida.">Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida.</a> J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Ross, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parthenogenetic+activation+of+bovine+oocytes+using+bovine+and+murine+phospholipase+C+zeta.">Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta.</a> BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).</li><li>Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jumonji+domain-containing+protein+3+regulates+histone+3+lysine+27+methylation+during+bovine+preimplantation+development.">Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).</li><li>Bogliotti, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4+Developmental+outcomes+and+effiency+of+two+CRISPR/Cas9+microinjection+methods+in+bovine+zygotes.">4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes.</a> Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).</li><li>Bakhtari, A., Ross, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DPPA3+prevents+cytosine+hydroxymethylation+of+the+maternal+pronucleus+and+is+required+for+normal+development+in+bovine+embryos.">DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos.</a> Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).</li><li>Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+the+process+of+polishing+borosilicate+glass+capillaries+used+for+fabrication+of+in-vitro+fertilization+(iVF)+micro-pipettes.">Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes.</a> Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pipette Cookbook 2015 P-97 &amp; P-1000 Micropipette Pullers. , (2015).</li><li>Sutter Instrument. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , (2014).</li><li>Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of cloning. , (2002).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+a+reporter+gene+after+microinjection+of+mammalian+artificial+chromosomes+into+pronuclei+of+bovine+zygotes.">Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes.</a> Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Microiniezione di zigoti è un metodo consolidato per l&#39;introduzione di soluzioni in embrioni di mammiferi. Con alcune variazioni dipendenti dalla specie e l&#39;obiettivo dell&#39;esperimento, questa tecnica può essere utilizzata largamente. Mostriamo come eseguire microiniezione intracitoplasmatica utilizzando un laser per assistere all&#39;ingresso di una micropipetta smussato-end. Zigoti di alcune specie di bestiame (come bovini, ovini, suini e) hanno un citoplasma scuro, ostacolando la visualizzazione della pi...

microiniezione citoplasmatica di embrioni di 1-Cell è una tecnica molto potente. Può essere usato per erogare qualsiasi soluzione nell&#39;embrione, per esempio, producono gene knock-out per studiare la funzione del gene o per generare animali geni modificati. La maggior parte agricolo-zigoti rilevanti animali da allevamento hanno una composizione molto alto acido grasso che rende il loro citoplasma opachi e scuri 1. Hanno anche una membrana plasmatica mediamente elastiche (PM). Queste caratteristiche rendono la microiniezione utilizzando convenzionale pronuclear iniezione / citoplasmatica usati in specie di roditori impegnative e spesso imprecisi. Microiniezione citoplasmatica ha dei vantaggi rispetto microiniezione pronuclear poiché è più facile da eseguire e provoca anche meno danni agli embrioni iniettati, con conseguente maggiore vitalità 2. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare un metodo di successo per fornire soluzioni nel citoplasma degli zigoti animali da allevamento. Per poter eseguiremicroiniezione citoplasmatica con alta efficienza sugli embrioni bestiame, un laser viene utilizzato per generare un foro nella zona pellucida (ZP) e poi un ago di vetro smussato-end viene utilizzato per la microiniezione. Questa strategia mira a ridurre il danno meccanico impresso l&#39;embrione durante l&#39;iniezione. Poi, l&#39;aspirazione del contenuto citoplasmatica dentro l&#39;ago dell&#39;iniezione permette la rottura efficiente e sicuro del PM garantire che la soluzione è consegnato nel citoplasma dell&#39;embrione. Questa tecnica è già stata utilizzata con successo in embrioni di bovini per fornire siRNA nel citoplasma zygotic 3,4 e generare mutazioni utilizzando i cluster si ripete regolarmente intervallati brevi palindromi (CRISPR) / CRISPR associato sistema 9 Sistema 5 (Cas9). E &#39;anche adatto (con piccole modifiche) per iniettare bovini ovociti cumulo-racchiuso 6. Qui, descriviamo il nostro protocollo di iniezione fornire un colorante, che può essere applicabile a qualsiasi iniezione dessoluzione ired nel zigote, e mostrano che l&#39;utilizzo di questa tecnica provoca la lisi minima e non influenza lo sviluppo embrionale precoce.

<table><tbody><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Sutter instruments</td><td>B100-75-10</td><td>These capillaries are used for making the holding and injecting pipettes. Any thick/standard wall borosilicate tubing without filament can be used.</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-9</td><td>Equipped with 10X magnification lense.</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Nikon/ Narishige</td><td>NT88-V3</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>Equipped with 4X, 20X lenses and with a laser system.</td></tr><tr><td>Laser</td><td>Research Instruments</td><td>7-47-500</td><td>Saturn 5 Active laser.</td></tr><tr><td>Microdispenser</td><td>Drummond</td><td>3-000-105</td><td>The microdispenser is used to move the embryos. A p10 pipette can also be used but loading as minimal volume as possible.</td></tr><tr><td>100 x 15 mm culture dish</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Use the lid of the dish to make the injection plate since they have lower walls and will make positioning and moving of the micromanipulator easier. The lid of a 60 mm culture dish can also be used.</td></tr><tr><td>35 mm culture dish</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>These dishes are used for culturing the embryos in 50 &amp;mu;l drops covered with mineral oil. Alternatively, a 4 well dish can also be used. Regardless of the dish chosen to culture the embryos, they always have to be equilibrated in the incubator for at least 4 hr prior to transfering the embryos to them.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-19AIC</td><td>Any incubator that can be set to 38.5 &amp;deg;C, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; conditions can be used.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800</td><td>Used for visualizing the embryos in the culture drops and during washes. Any stereomicroscope with a 10X magnification can be used.</td></tr><tr><td>Control Unit HT</td><td>Minitube</td><td>12055/0400</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Heated Microscope Stage</td><td>Minitube</td><td>12055/0003</td><td>Heating system attached to the stereomicroscope.</td></tr><tr><td>Dextran-Red</td><td>Thermo Scientific</td><td>D1828</td><td>A sterile 10 mg/ml solution is used to inject.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>sigma</td><td>M8410</td><td>Keep the mineral oil at room temperature and&amp;nbsp; protected from light using foil paper.</td></tr><tr><td>KSOMaa Evolve Bovine</td><td>Zenit</td><td>ZEBV-100</td><td>Supplemented with 4 mg/ml BSA. KSOM plates for embryo culture should be equilibrated in an incubator for at least 4 hr before use.</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-525</td><td>Use a stem-cell qualified FBS.</td></tr><tr><td>Zygotes</td><td></td><td></td><td>Zygotes are injected 17 - 20 hpf and can be &lt;em&gt;in-vitro&lt;/em&gt;- or &lt;em&gt;in-vivo&lt;/em&gt;-derived.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>Final concentration: 107.7 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>Final concentration: 7.16 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Final concentration: 1.19 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Final concentration: 0.49 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium DL-lactate</td><td>Sigma</td><td>L4263</td><td>Final concentration: 5.3 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>Final concentration: 1.71 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>D-(&amp;minus;)-Fructose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>F3510</td><td>Final concentration: 0.5 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>Final concentration: 21 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BME-EAA</td><td>Sigma</td><td>B6766</td><td>Final concentration: 1x. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Final concentration: 4 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P4562</td><td>Final concentration: 0.33 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050</td><td>Final concentration: 1 mM. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A-3311</td><td>Final concentration: 1 mg/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma</td><td>G-1397</td><td>Final concentration: 5 &amp;mu;g/ml. Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>Water for embryo transfer</td><td>Sigma</td><td>W1503</td><td>Component of SOF-HEPES medium.</td></tr><tr><td>SOF-HEPES medium</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>pH 7.3 - 7.4, 280 &amp;plusmn; 10 mOs. Filter sterilized through a 22 &amp;mu;m filter can be stored in the fridge at 4 &amp;deg;C for 1 month. Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use.</td></tr></tbody></table>

laser-assisted cytoplasmic microinjection in livestock zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

Laser-assistita microiniezione citoplasmatica è un protocollo potente e affidabile per fornire soluzioni nel citoplasma di zigoti bestiame. La figura 3 mostra uno schema generale dei zigoti prima e dopo l&#39;iniezione e la sagoma complessiva della tecnica. Destrano-rosso viene usato come iniettare soluzione per consentire il monitoraggio sito di iniezione e iniezione efficienza e precisione. Il raggiungimento della soluzione è illustrata nella figura 4</strong...

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Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Laser-assistita citoplasmatica microiniezione nel bestiame zigoti

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

8.9K Views.  University of California, Davis. This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

Video: Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.

Studying the earliest events of preneoplastic cell progression and innate immune cell interaction is pivotal to understand and treat cancer. Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformations and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells in zebrafish larvae.

Immagini dal vivo di Innata immunitario e preneoplastiche interazioni cella utilizzando un / UAS Expression System inducibile GAL4 in Zebrafish larvale pelle

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Consegna degli acidi nucleici attraverso Embrione microiniezione in tutto il mondo agricolo parassita,<em&gt; Capitata Ceratitis</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genetica

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microiniezione di mRNA e oligonucleotidi antisenso Morpholino in embrioni di zebrafish.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Biologia

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microiniezione di embrioni di zebrafish per analizzare la funzione del gene

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Microstructured Devices for Optimized Microinjection and Imaging of Zebrafish Larvae

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning fundamental developmental biology through to large-scale genetic and chemical screens. However, many experiments, especially those related to infection and xenograft models, rely on microinjection and imaging of embryos and larvae, which are laborious techniques that require skill and expertise. To improve the precision and throughput of current microinjection techniques, we developed a series of microstructured devices to orient and stabilize zebrafish embryos at 2 days post fertilization (dpf) in ventral, dorsal, or lateral orientation prior to the procedure. To aid in the imaging of embryos, we also designed a simple device with channels that orient 4 zebrafish laterally in parallel against a glass cover slip. Together, the tools that we present here demonstrate the effectiveness of photolithographic approaches to generate useful devices for the optimization of zebrafish techniques.

Microinjection of zebrafish embryos and larvae is a crucial but challenging technique used in many zebrafish models. Here, we present a range of microscale tools to aid in the stabilization and orientation of zebrafish for both microinjection and imaging.

Dispositivi microstrutturati Microinjection ottimizzata e Imaging delle larve di Zebrafish

Zebrafish have emerged as a powerful model of various human diseases and a useful tool for an increasing range of experimental studies, spanning ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microiniezione di zigote per la creazione di alleli knock-in e flox a cassetta genica nei topi

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

High Throughput microiniezioni di Sea Urchin zigoti

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the host chromosome and is passed on to progeny. Thus, they are ideal vectors for creation of stable cell lines, in vivo delivery of indicators, and transduction of single cell fertilized eggs to create transgenic animals. However, mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against lentiviral gene delivery. Lentiviruses are too large to penetrate the zona and are typically delivered by microinjection of viral particles into the perivitelline cavity, the space between the zona and the embryonic cells. The requirement for highly skilled technologists and specialized equipment has minimized the use of lentiviruses for gene delivery to mouse embryos. This article describes a protocol for permeabilizing the mouse fertilized eggs by perforating the zona with a laser. Laser-perforation does not result in any damage to embryos and allows lentiviruses to gain access to embryonic cells for gene delivery. Transduced embryos can develop into blastocyst in vitro, and if implanted in pseudopregnant mice, develop into transgenic pups. The laser used in this protocol is effective and easy to use. Genes delivered by lentiviruses stably incorporate into mouse embryonic cells and are germline transmittable. This is an alternative method for creation of transgenic mice that requires no micromanipulation and microinjection of fertilized eggs.

Mouse fertilized eggs and early stage embryos are protected by the zona pellucida, a glycoprotein matrix that forms a barrier against gene delivery. This article describes a protocol for perforating the zona with a laser to transduce embryonic cells with lentiviral vectors and to create transgenic mice.

Laser-assistita lentivirali Gene consegna al Mouse fecondate le uova

Lentiviruses are efficient vectors for gene delivery to mammalian cells. Following transduction, the lentiviral genome is stably incorporated into the ...

Zebrafish Microinjection Techniques

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage embryos. Using this technique, solutions containing genetic material or knockdown constructs are delivered into the blastomeres: the embryonic cells sitting atop the yolk of the newly fertilized egg. Delivery into the cytoplasm is achieved either through direct injection into the blastomere, or via natural cytoplasmic movements that occur after a solution is injected into the yolk. Successful genetic manipulations are usually followed by quantification of embryonic phenotypes in order to elucidate the genetic mechanisms of development.
This video will provide an introduction to carrying out microinjections in zebrafish embryos. The discussion begins with a review of the essential tools for the technique, including the injection apparatus and the microinjector, which controls fluid movement with pressure pulses of air. Next, important preparatory steps are demonstrated, such as the pouring of agar plates to stabilize embryos during injection and calibration of the microinjection apparatus. The injection procedure is then presented along with tips on when and where injections should be performed. Finally, applications of the microinjection technique are discussed, including gene overexpression via mRNA injection, gene silencing by delivery of antisense morpholino oligonucleotides, and the generation of transgenic zebrafish using specially engineered plasmid DNA.

Introduction to Microinjection of Early Zebrafish Embryos

Tecniche di microiniezione di Zebrafish

One of the major advantages to working with zebrafish (Danio rerio) is that their genetics can be easily manipulated by microinjection of early stage ...

Didattica

JoVE Science Education

Biologia di base

Biologia II: topo, zebrafish e pollo

Laser-Assisted Lentiviral Gene Delivery: A Technique to Permeabilize Mouse Fertilized Eggs to Facilitate Lentiviral Gene Delivery

Source: Martin, N. P., et al. <a href="https://www.jove.com/v/58327">Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs.</a> J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the laser-assisted permeation of the protective layer of zona pellucida in mouse fertilized eggs for facilitating lentiviral gene delivery. Lentivirus enables the generation of transgenic animals with a gene of interest stably integrated into their genome.

Consegna genica lentivirale assistita da laser: una tecnica per permeabilizzare gli ovuli fecondati di topo per facilitare la consegna del gene lentivirale

Source: Martin, N. P., et al. Laser-assisted Lentiviral Gene Delivery to Mouse Fertilized Eggs. J. Vis. Exp. (2018).
In this video, we demonstrate the ...